[Recuperación de antígenos: su importancia e inconvenientes en la inmunohistoquímica]

Uno de los mayores problemas de la inmunohistoquímica ha sido cómo mantener tanto la buena morfología como la inmunorreactividad de los antígenos en las secciones de tejido. Se han ideado varias técnicas para recuperar la inmunorreactividad de los antígenos (desenmascaramiento) después de las preparaciones tisulares rutinarias, como la fijación, la deshidratación y la incrustación, y ahora se están utilizando para las inmunotinciones no sólo en las investigaciones citohistológicas sino también en los diagnósticos patológicos. En este informe, en primer lugar, se examinan los mecanismos y la importancia de la fijación y la recuperación de antígenos desde el punto de vista de la inactivación de las proteínas. En segundo lugar, se revisaron algunos problemas prácticos y notas en dos de las técnicas de desenmascaramiento más populares, la digestión enzimática y la recuperación de epítopos inducida por calor (HIER), con el fin de adaptar las técnicas con precisión en la inmunohistoquímica. El principal artefacto inducido por la fijación es el enmascaramiento de los antígenos tisulares debido al entrecruzamiento entre los residuos de aminoácidos de las proteínas. Es importante elegir una condición de fijación adecuada para cada antígeno teniendo en cuenta su naturaleza bioquímica y su resistencia a la fijación (Tabla 2), y mantener las condiciones de fijación al mínimo para que la inmunorreactividad del antígeno pueda ser fácilmente recuperada por diversas técnicas de desenmascaramiento (Tabla 3, Fig. 1). La recuperación del antígeno en sí es el proceso que provoca la desnaturalización de las proteínas en los tejidos, al igual que muchos otros procesos de inactivación de las proteínas (Tabla 1). La digestión enzimática puede grabar las partes enmascarantes de las proteínas alrededor de un antígeno para exponer su epítopo. Aunque la digestión enzimática es relativamente simple y su condición de tratamiento es fácil de controlar, los resultados no son necesariamente dramáticos y consistentes dependiendo de los tipos o lotes de enzimas. Por lo tanto, uno debe encontrar su propio manual de digestión para lograr el mejor resultado de tinción para cada antígeno (por ejemplo, la Tabla 4). Por ejemplo, la digestión con pepsina dio los mejores resultados en la inmunotinción de la bromo-deoxiuridina (BrdU) y del antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), mientras que otras enzimas tuvieron poco efecto (Tabla 5). El calentamiento también puede escindir la columna vertebral del polipéptido e interrumpir los enlaces cruzados producidos por la fijación. El efecto del calentamiento en la recuperación del antígeno depende de la temperatura y parece ser proporcional al producto de la temperatura y el tiempo. En el caso de la inmunotinción de PCNA en secciones fijadas en paraformaldehído e incluidas en parafina, fue necesario calentar a 90 grados C durante al menos 3 minutos; sin embargo, a medida que la condición de calentamiento se hizo más severa, también aumentaron las manchas de fondo no específicas (Tabla 6), que es uno de los problemas más graves en la recuperación de antígenos (Fig. 2a, c). Una posible opción para evitar estos resultados indeseables es la combinación de calentamiento subóptimo (a 80 grados C durante 10-15 minutos) y digestión con pepsina (Fig. 2b, d). Una consideración teórica importante para emplear un método de desnaturalización tan drástico es si los epítopos del antígeno enmascarado pueden ser expuestos adecuadamente sin dar lugar a resultados falsos positivos (o falsos negativos) con anticuerpos previamente confiables. Parece que cada antígeno requiere una preparación tisular «a medida» para la conservación óptima de su antigenicidad y su localización precisa. De acuerdo con el desarrollo de la inmunología, la biología molecular, la genética o la embriología, debería aumentar la necesidad de realizar inmunotinciones múltiples en combinación con otras tecnologías como la hibridación in situ para analizar las relaciones espaciales y funcionales entre varias moléculas in situ. La recuperación de antígenos se convertiría entonces en una poderosa estrategia.