Relojes biológicos

La alternancia del día y la noche del ciclo terrestre es tan fiable que no es de extrañar que los animales, las plantas y las bacterias ajusten su comportamiento y fisiología (para una revisión, véase la ref. 1). Los ritmos circadianos son una adaptación ubicua de todos los organismos a los desafíos ambientales más predecibles. Un ritmo biológico que persiste en condiciones constantes y tiene un periodo de ≈1 día se denomina «circadiano» (circa, «alrededor»; dian, «día»).

Hasta hace muy poco, las moléculas que subyacen a la oscilación han permanecido desconocidas. Las alteraciones de dichas oscilaciones mediante inhibidores de la síntesis de ARN o de proteínas sugieren que dichas moléculas están implicadas (2).

Un enfoque que ha tenido éxito para desentrañar los mecanismos es el uso de alteraciones genéticas. Los primeros y segundos mutantes del reloj descubiertos en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, son los genes del período y de la atemporalidad (3-5).

En las moscas de la fruta, la abundancia de ARNm y de productos proteicos de los genes del período y de la atemporalidad cicla durante ≈24 horas en lugares específicos del cerebro de la mosca (6). Maki Kaneko et al. hablaron de estas células marcapasos putativas en el cerebro de la mosca de la fruta utilizando estas oscilaciones moleculares como marcador (7). En la cabeza adulta, los estudios de proteínas mostraron que per se expresa rítmicamente en sitios específicos, las neuronas laterales situadas entre el cerebro central y los lóbulos ópticos. Las neuronas laterales se consideran las células marcapasos putativas del ritmo de actividad locomotora de la mosca adulta.

Kaneko et al. (7) demostraron que los productos de per y tim son detectables en un número limitado de neuronas del cerebro larvario. Los patrones de expresión en varias de estas células son cíclicos. Entre estas neuronas, cinco células localizadas lateralmente expresan PERIOD (PER) desde el estadio larvario temprano, lo que sugiere que pueden ser responsables del mantenimiento del tiempo larvario de la eclosión y de la actividad locomotora. Otro hallazgo interesante es un grupo de neuronas con la expresión cíclica de per y tim en antifase a las neuronas laterales. Los resultados implican la presencia de múltiples osciladores implicados en los ritmos de diferentes procesos fisiológicos o de comportamiento en un mismo organismo. Kaneko et al. (7) también describieron la caracterización anatómica de los patrones de cableado de las neuronas marcapasos utilizando la expresión del gen reportero dependiente del promotor per. Este enfoque anatómico molecular debería aportar una nueva visión sobre la cartografía funcional de este sistema cerebral. Además, la comparación entre las células del reloj de los mamíferos y de las moscas debería aclarar la relación evolutiva entre estos sistemas.

El control circadiano de la transcripción proporciona un punto de entrada para analizar los elementos reguladores que actúan en cis y los factores que actúan en trans a través de los cuales el reloj puede regular muchas expresiones génicas controladas por el reloj (6). Se supone que estos supuestos elementos reguladores de acción cis, denominados «time-box» (8), están localizados en la región promotora y potenciadora de los genes controlados por el reloj. Además, el elemento de respuesta controlado por el reloj (6) o time-box puede regular los fenómenos fisiológicos circadianos endógenos en condiciones constantes. Recientemente, se ha identificado un posible candidato para el time-box en la región promotora del gen period de Drosophila (9). Aunque se ha propuesto que per medie en el ciclo del ARNm a través de la represión transcripcional, la interacción directa entre per y el ADN es muy poco probable debido a la falta de un dominio de unión al ADN en PER. El grupo de Hardin analizó ampliamente la región promotora del gen per en estudios realizados con moscas transgénicas del gen per-lacZ (9). Identificaron un potenciador transcripcional circadiano dentro de un fragmento de ADN de 69 pb que contiene un E-box aguas arriba del gen per, que es responsable de la activación nocturna de la expresión del gen per. La caja E es un sitio de unión conocido para la clase de factores de transcripción de hélice-bucle-hélice básica.

Recientemente, el candidato más fuerte hasta ahora para un factor de acción trans en el oscilador es Clock, clonado mediante el uso de una estrategia genética de avance (10). El grupo de Takahashi (10) aisló y analizó la actividad locomotora de cepas de ratones mutantes circadianos. El mutante Clock mostraba un periodo largo que se volvía arrítmico después de varios días en oscuridad constante. Takahashi y sus colegas (10) clonaron con éxito el gen responsable e identificaron la mutación en la región de codificación de la proteína del gen Clock. Curiosamente, la proteína Clock contiene un dominio de unión a proteínas (PAS), que se encuentra en el gen per de Drosophila y un motivo básico de hélice-bucle-hélice para la unión al ADN. Además, Takahashi y sus colegas (10) fueron capaces de rescatar por completo el fenotipo de periodo largo y arrítmico de los ratones mutantes del reloj mediante la transferencia del gen normal del reloj.

Ravi Allada et al. describieron los componentes moleculares comunes centrados en Clock, que es responsable de la generación del ritmo circadiano tanto en moscas como en humanos (11). Allada y sus colegas (11) examinaron moscas mutagénicas químicamente en busca de mutantes que alteraran o abolieran la ritmicidad circadiana de la actividad locomotora y encontraron un nuevo mutante arrítmico, denominado inicialmente Jrk. Las moscas Jrk expresan niveles bajos de proteínas del periodo y del tiempo debido a la reducción de los niveles de transcripción. El gen se identificó y exhibe una sorprendente conservación de la secuencia con el gen del ritmo circadiano de los mamíferos, Clock; por ello, Allada et al. (11) rebautizaron este gen de la mosca como dClock. Al igual que el reloj de ratón, el reloj de Drosophila contiene dominios básicos de hélice-bucle-hélice y PAS, así como un dominio de activación transcripcional.

Trabajos recientes tanto de mamíferos como de moscas sugieren que los socios proteicos de CLOCK también se conservan evolutivamente (denominados BMAL) (12, 13). Se demostró que los dímeros CLOCK-BMAL se unen a la región promotora de los genes period y timeless y transactivan ambos genes en las moscas. Además, la expresión de PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) reprime la inducción del reportero mediada por CLOCK-BMAL. Así, se ha propuesto un modelo de retroalimentación negativa (Fig. 1).

En los mamíferos, se considera que el SCN en el hipotálamo es un importante marcapasos de los fenómenos del ritmo circadiano, como demuestran muchos estudios anatómicos y fisiológicos (14). Recientemente, se ha informado de la existencia de tres homólogos del gen del periodo de Drosophila en el ratón y en el ser humano (15). A pesar de la existencia de tres homólogos del periodo de mamíferos que muestran una oscilación circadiana del ARNm en el núcleo supraquiasmático del cerebro del ratón, no se ha informado de ninguna implicación funcional del comportamiento locomotor circadiano.

Para aclarar si el per homólogo de los mamíferos podría estar implicado en el ritmo circadiano del comportamiento locomotor de los mamíferos, el grupo de Ishida ha clonado un per homólogo de la rata y ha realizado ratas arrítmicas con SCN-lesión para monitorizar los ritmos circadianos en los tejidos periféricos (16).

Para comprobar si la expresión rítmica del ARNm de PERIOD 2 de rata (RPER2) se observa en otros tejidos además del SCN, se llevó a cabo un análisis de Northern blot en tejidos del ojo, cerebro, corazón, pulmón, bazo, hígado y riñones. Curiosamente, todos los tejidos analizados mostraron una expresión rítmica del ARNm de RPER2, aunque la proporción noche/día era diferente en cada tejido. El RPER2 se comporta como un homólogo mamífero del gen del periodo de Drosophila (16) porque su expresión circadiana era alta por la noche en una amplia variedad de tejidos, al igual que el periodo en Drosophila.

Debido a que el SCN se considera un marcapasos del reloj circadiano en los mamíferos, el grupo de Ishida (16) probó si la expresión circadiana de múltiples tejidos del ARNm del RPER2 se ve afectada por una lesión del SCN. Sorprendentemente, la naturaleza rítmica de la expresión tisular múltiple de RPER2 fue completamente abolida por la lesión del SCN. Por lo tanto, la expresión tisular múltiple de RPER2 está bajo el control del SCN. Este es el primer informe que indica que el ritmo circadiano multitejido está gobernado por un reloj cerebral de mamífero, el SCN del hipotálamo. Los datos también sugieren que un per homólogo de los mamíferos (RPER2) podría estar implicado en el ritmo circadiano del comportamiento locomotor en los mamíferos, porque la pérdida de la expresión circadiana del ARNm de RPER2 en todo el cuerpo se produjo cuando se perdió la actividad circadiana locomotora de las ratas. Para aclarar este problema, tenemos que hacer animales transgénicos que tengan una mutación de pérdida de función o de ganancia de función en el gen RPER2. El hecho de que la expresión rítmica del ARNm de RPER2 en varios tejidos dependa completamente del SCN sugiere que se necesitan algunas señales para mantener coordinadamente el ritmo de todo el organismo (Fig. 2). Un estudio de trasplante del SCN también sugiere la importancia de los factores humorales del SCN (17). Estos factores humorales del SCN podrían ser importantes para generar la expresión rítmica circadiana del gen RPER2 en los tejidos periféricos. Así, parece que, como en el caso de la biología del desarrollo, las moléculas clave de este reloj biológico están bien conservadas entre las moscas y los mamíferos. El mecanismo de reloj molecular común desde las bacterias (18) hasta el ser humano podría vislumbrarse en un futuro próximo.