Secuenciación con bisulfito

La secuenciación con bisulfito aplica métodos rutinarios de secuenciación en ADN genómico tratado con bisulfito para determinar el estado de metilación en los dinucleótidos CpG. También se emplean otras estrategias de no secuenciación para interrogar la metilación en loci específicos o a nivel de todo el genoma. Todas las estrategias asumen que la conversión inducida por el bisulfito de las citosinas no metiladas a uracilo es completa, y esto sirve de base para todas las técnicas posteriores. Lo ideal es que el método utilizado determine el estado de metilación por separado para cada alelo. Entre los métodos alternativos a la secuenciación con bisulfito se encuentran el análisis combinado de restricción con bisulfito y la inmunoprecipitación del ADN metilado (MeDIP).

Las metodologías para analizar el ADN tratado con bisulfito se están desarrollando continuamente. Para resumir estas metodologías en rápida evolución, se han escrito numerosos artículos de revisión.

Las metodologías pueden dividirse generalmente en estrategias basadas en la PCR específica de metilación (MSP) (Figura 4), y estrategias que emplean la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada en condiciones no específicas de metilación (Figura 3). Los métodos basados en microarrays utilizan también la PCR basada en condiciones no específicas de metilación.

Métodos basados en la PCR no específica de metilaciónEditar

Figura 3: Métodos de análisis de metilación del ADN no basados en la PCR específica de metilación. Tras la conversión a bisulfito, el ADN genómico se amplifica con una PCR que no discrimina entre secuencias metiladas y no metiladas. Los numerosos métodos disponibles se utilizan entonces para hacer la discriminación basándose en los cambios dentro del amplicón como resultado de la conversión al bisulfito.

Secuenciación directaEditar

El primer método reportado de análisis de metilación utilizando ADN tratado con bisulfito utilizó la PCR y la secuenciación estándar de dideoxinucleótidos del ADN para determinar directamente los nucleótidos resistentes a la conversión al bisulfito. Los cebadores están diseñados para ser específicos de la cadena, así como específicos del bisulfito (es decir, cebadores que contienen citosinas no-CpG, de manera que no son complementarios al ADN no tratado con bisulfito), flanqueando (pero no implicando) el sitio de metilación de interés. Por lo tanto, amplificará tanto las secuencias metiladas como las no metiladas, en contraste con la PCR específica de metilación. Todos los sitios de citosinas no metiladas se muestran como timinas en la secuencia amplificada resultante de la cadena sentido, y como adeninas en la cadena antisentido amplificada. Al incorporar adaptadores de secuenciación de alto rendimiento en los cebadores de la PCR, los productos de la PCR pueden secuenciarse con una secuenciación paralela masiva. Alternativamente, y con mucho trabajo, el producto de la PCR puede clonarse y secuenciarse. Se pueden utilizar métodos de PCR anidada para mejorar el producto para la secuenciación.

Todas las técnicas posteriores de análisis de metilación del ADN utilizando ADN tratado con bisulfito se basan en este informe de Frommer et al. (Figura 2). Aunque la mayoría de las otras modalidades no son verdaderas técnicas basadas en la secuenciación, el término «secuenciación con bisulfito» se utiliza a menudo para describir las técnicas de análisis de metilación del ADN con conversión en bisulfito en general.

La pirosecuenciaciónEdit

La pirosecuenciación también se ha utilizado para analizar el ADN tratado con bisulfito sin utilizar la PCR específica de metilación. Tras la amplificación por PCR de la región de interés, se utiliza la pirosecuenciación para determinar la secuencia convertida por bisulfito de sitios CpG específicos en la región. La proporción de C a T en sitios individuales puede determinarse cuantitativamente basándose en la cantidad de incorporación de C y T durante la extensión de la secuencia. La principal limitación de este método es el coste de la tecnología. Sin embargo, la pirosecuenciación permite la extensión a métodos de cribado de alto rendimiento.

Una mejora más de esta técnica fue descrita recientemente por Wong et al., que utiliza cebadores específicos para cada alelo que incorporan polimorfismos de un solo nucleótido en la secuencia del cebador de secuenciación, permitiendo así el análisis separado de los alelos maternos y paternos. Esta técnica es especialmente útil para el análisis de la impronta genómica.

Análisis de conformación de una sola hebra sensible a la metilación (MS-SSCA)Edit

Este método se basa en el método de análisis de polimorfismo de conformación de una sola hebra (SSCA) desarrollado para el análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). El SSCA distingue entre fragmentos de ADN monocatenario de tamaño idéntico pero de secuencia distinta, basándose en la migración diferencial en la electroforesis no desnaturalizada. En el MS-SSCA, esto se utiliza para distinguir entre las regiones tratadas con bisulfito y amplificadas por PCR que contienen los sitios CpG de interés. Aunque la SSCA carece de sensibilidad cuando sólo hay una diferencia de un solo nucleótido, el tratamiento con bisulfito suele realizar varias conversiones de C a T en la mayoría de las regiones de interés, y la sensibilidad resultante se aproxima al 100%. La MS-SSCA también proporciona un análisis semicuantitativo del grado de metilación del ADN basado en la relación de las intensidades de las bandas. Sin embargo, este método está diseñado para evaluar todos los sitios CpG en su conjunto en la región de interés en lugar de los sitios de metilación individuales.

Análisis de fusión de alta resolución (HRM)Edit

Un método adicional para diferenciar el ADN convertido del no convertido tratado con bisulfito es utilizar el análisis de fusión de alta resolución (HRM), una técnica cuantitativa basada en la PCR diseñada inicialmente para distinguir los SNP. Los amplicones de la PCR se analizan directamente mediante la rampa de temperatura y la consiguiente liberación de un colorante fluorescente intercalado durante la fusión. El grado de metilación, representado por el contenido de C a T en el amplicón, determina la rapidez de la fusión y la consiguiente liberación del colorante. Este método permite la cuantificación directa en un ensayo de un solo tubo, pero evalúa la metilación en la región amplificada como un todo en lugar de en sitios CpG específicos.

Extensión del cebador de un solo nucleótido sensible a la metilación (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE emplea el método de extensión del cebador diseñado inicialmente para analizar polimorfismos de un solo nucleótido. El ADN se convierte en bisulfito, y los cebadores específicos de bisulfito se anejan a la secuencia hasta el par de bases inmediatamente anterior al CpG de interés. Se permite que el cebador se extienda un par de bases hacia la C (o T) utilizando dideoxinucleótidos de terminación de la ADN polimerasa, y se determina cuantitativamente la proporción de C a T.

Se pueden utilizar varios métodos para determinar esta proporción C:T. Al principio, la MS-SnuPE se basaba en los ddNTPs radiactivos como indicadores de la extensión del cebador. También pueden utilizarse métodos basados en la fluorescencia o la pirosecuenciación. Sin embargo, se puede utilizar el análisis de espectrometría de masas por desorción láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para diferenciar entre los dos productos polimórficos de extensión del cebador, en esencia, basándose en el ensayo GOOD diseñado para el genotipado de SNP. También se ha utilizado la cromatografía líquida de fase inversa de pares de iones (IP-RP-HPLC) para distinguir los productos de extensión de los cebadores.

Escisión específica de base/MALDI-TOFEdit

Un método recientemente descrito por Ehrich et al. aprovecha además las conversiones de bisulfito añadiendo un paso de escisión específico de base para mejorar la información obtenida de los cambios de nucleótidos. Utilizando primero la transcripción in vitro de la región de interés en ARN (añadiendo un sitio promotor de la ARN polimerasa al cebador de la PCR en la amplificación inicial), se puede utilizar la RNasa A para escindir la transcripción del ARN en sitios específicos de las bases. Como la RNasa A escinde el ARN específicamente en los ribonucleótidos de citosina y uracilo, la especificidad de base se consigue añadiendo dTTP resistente a la escisión cuando se desea la escisión específica de citosina (específica de C), e incorporando dCTP cuando se desea la escisión específica de uracilo (específica de U). Los fragmentos cortados pueden ser analizados por MALDI-TOF. El tratamiento con bisulfito da lugar a la introducción/eliminación de sitios de corte por conversiones de C a U o al cambio de la masa del fragmento por conversiones de G a A en la cadena inversa amplificada. La escisión específica de C cortará específicamente en todos los sitios CpG metilados. Al analizar los tamaños de los fragmentos resultantes, es posible determinar el patrón específico de metilación del ADN de los sitios CpG dentro de la región, en lugar de determinar el grado de metilación de la región en su conjunto. Este método ha demostrado su eficacia para el cribado de alto rendimiento, permitiendo la interrogación de numerosos sitios CpG en múltiples tejidos de una manera rentable.

PCR específica de metilación (MSP)Edit

Figura 4: La PCR específica de metilación es un método sensible para amplificar y detectar de forma discriminada una región metilada de interés utilizando cebadores específicos de metilación en ADN genómico convertido en bisulfito. Dichos cebadores sólo se anejan a las secuencias que están metiladas y que, por lo tanto, contienen 5-metilcitosinas que son resistentes a la conversión por bisulfito. De forma alternativa, se pueden utilizar cebadores específicos no metilados.

Este método alternativo de análisis de metilación también utiliza ADN tratado con bisulfito pero evita la necesidad de secuenciar el área de interés. En su lugar, los pares de cebadores se diseñan ellos mismos para ser «específicos de metilación» incluyendo secuencias que complementan sólo las 5-metilcitosinas no convertidas o, a la inversa, «específicos de no metilación», complementando las timinas convertidas de las citosinas no metiladas. La metilación se determina por la capacidad del cebador específico para lograr la amplificación. Este método es particularmente útil para interrogar a las islas CpG con una posible alta densidad de metilación, ya que un mayor número de pares CpG en el cebador aumenta la especificidad del ensayo. La colocación del par CpG en el extremo 3’del cebador también mejora la sensibilidad. El informe inicial en el que se utilizaba la MSP describía una sensibilidad suficiente para detectar la metilación del 0,1% de los alelos. En general, el MSP y sus protocolos relacionados se consideran los más sensibles a la hora de interrogar el estado de metilación en un locus específico.

El método MethyLight se basa en el MSP, pero proporciona un análisis cuantitativo utilizando la PCR cuantitativa. Se utilizan cebadores específicos de metilación y también se utiliza una sonda de fluorescencia específica de metilación que se anuda a la región amplificada. De forma alternativa, los cebadores o la sonda pueden diseñarse sin especificidad de metilación si se necesita discriminar entre los pares CpG dentro de las secuencias implicadas. La cuantificación se realiza en referencia a un ADN de referencia metilado. Una modificación de este protocolo para aumentar la especificidad de la PCR para el ADN convertido en bisulfito con éxito (ConLight-MSP) utiliza una sonda adicional para el ADN no convertido en bisulfito para cuantificar esta amplificación no específica.

Otra metodología que utiliza el ADN amplificado con MSP analiza los productos utilizando el análisis de la curva de fusión (Mc-MSP). Este método amplifica el ADN convertido en bisulfito con cebadores específicos de metilación y no específicos de metilación, y determina la proporción cuantitativa de los dos productos comparando los picos diferenciales generados en un análisis de curva de fusión. Se ha introducido un método de análisis de fusión de alta resolución que utiliza tanto la PCR cuantitativa como el análisis de fusión, en particular, para la detección sensible de la metilación de bajo nivel

Métodos basados en micromatricesEditar

Los métodos basados en micromatrices son una extensión lógica de las tecnologías disponibles para analizar el ADN tratado con bisulfito para permitir el análisis de la metilación en todo el genoma. Los microarrays de oligonucleótidos se diseñan utilizando pares de sondas de hibridación de oligonucleótidos dirigidos a los sitios CpG de interés. Una es complementaria a la secuencia metilada inalterada, y la otra es complementaria a la secuencia no metilada convertida en C a U. Las sondas también son específicas para el bisulfito para evitar que se unan al ADN incompletamente convertido por el bisulfito. El ensayo de metilación de Illumina es uno de esos ensayos que aplica la tecnología de secuenciación por bisulfito a nivel de micromatriz para generar datos de metilación en todo el genoma.