Tecnología de ADN ramificado (ADNb)

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Introducción

El ensayo de ADN ramificado (ADNb) proporciona una herramienta única y potente para la cuantificación fiable de las moléculas de ácido nucleico. Fundamentalmente diferente de los métodos de amplificación de dianas como la PCR, el ensayo de bADN mide directamente las moléculas de ácido nucleico a niveles fisiológicos potenciando la señal del reportero, en lugar de replicar las secuencias diana como medio de detección, y por tanto evita los errores inherentes a la extracción y amplificación de las secuencias diana. El ensayo de ADNb emplea una amplificación lineal de la señal utilizando sondas de oligonucleótidos sintéticos y moléculas de ADNb, y puede medir con exactitud y precisión entre 500 y 10.000.000 de moléculas aproximadamente. Los nuevos avances en la tecnología de ADNb incluyen la adición de moléculas preamplificadoras y la incorporación de nuevos nucleótidos, isoC e isoG, en las secuencias de sondas de oligonucleótidos para mejorar aún más la señal y reducir el ruido causado por la hibridación no específica de los componentes del ensayo de ADNb. Estas mejoras han ampliado el límite de detección cuantitativa del ensayo de ADNb a un nivel tan bajo como 50 moléculas.

Historia de la tecnología de ADNb

El ensayo de ADNb, muy adecuado para el uso rutinario en un entorno clínico o de investigación, se ha aplicado con éxito en una serie de áreas, incluyendo el pronóstico y el seguimiento de pacientes con enfermedades virales. Al proporcionar un medio fiable para la cuantificación directa de la carga viral en muestras clínicas, se han desarrollado ensayos de ADNb para medir el ADN del virus de la hepatitis B, el ARN del virus de la hepatitis C, el ARN del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y el ADN del citomegalovirus. Con el diseño personalizado de sondas de oligonucleótidos, las aplicaciones potenciales del ensayo de ADNb van mucho más allá de la cuantificación de ácidos nucleicos virales. Mediante la creación de sondas de oligonucleótidos para secuencias específicas de moléculas de ácido nucleico objetivo, el ensayo de ADNb se ha adaptado a una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los investigadores han diseñado sondas para que el ensayo de ADNb mida los niveles de ARNm celular. Esto ha demostrado ser un enfoque fructífero para una serie de aplicaciones de investigación, incluyendo el seguimiento de los cambios en los niveles de ARNm de citoquinas en poblaciones de pacientes sanos e inmunocomprometidos, la investigación de los patrones de empalme de la insulina, y la evaluación de la inducción de genes de estrés para aplicaciones de toxicología molecular. Dada su versatilidad, facilidad de uso y alto nivel de rendimiento, el ensayo de ADNb se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para la cuantificación de ácidos nucleicos

Outline

El ensayo de ADNb utiliza un formato de microplaca de 96 pocillos, y se basa en una serie de reacciones de hibridación específicas y en la detección quimioluminiscente de las sondas hibridadas. En la superficie de cada micropocillo hay sondas de «captura» que contienen una secuencia de nucleótidos específica. Estas sondas de captura se unen a un subconjunto de «sondas objetivo» que se unen a secuencias de nucleótidos específicas en la molécula de ácido nucleico objetivo. Esta serie de hibridaciones ancla la molécula de ácido nucleico diana a la superficie del micropocillo. La detección del ácido nucleico diana y la amplificación de la señal se realiza mediante otra serie de hibridaciones.

Un segundo subconjunto de sondas diana une la molécula de ácido nucleico diana a moléculas amplificadoras de ADNb. Con la adición de moléculas preamplificadoras para proporcionar una capa adicional de mejora entre las sondas diana y las moléculas amplificadoras de bADN, se puede lograr una amplificación de la señal aún mayor. Cada molécula amplificadora de ADNb ha sido diseñada para contener 15 brazos, cada uno de los cuales contiene tres sitios de unión para «sondas de etiqueta» conjugadas con fosfatasa alcalina. Se genera una señal quimioluminiscente al introducir un sustrato de dioxetano que es activado por la fosfatasa alcalina. Esta señal se cuantifica fácilmente contando el número de fotones emitidos en un luminómetro. El ensayo de ADNb es inherentemente cuantitativo, ya que el número de fotones emitidos está directamente relacionado con la cantidad de ácido nucleico diana en la muestra.

Materiales

Equipo – Calentador de placas Chiron equipado con soporte de micropocillos de 8×12 – Luminómetro de lectura de placas Chiron

Reactivos para el día 1

  • Micropocillos modificados con oligonucleótidos

    • .micropocillos modificados

  • Diluyente de análisis
  • Reactivo de análisis (proteinasa K)
  • Sondas objetivo de captura
  • Sondas objetivo de etiquetado
  • Especímenes
  • Estándares y controles (opcional)

Reactivos para el día 2

Procedimiento

Día 1

  1. Prepare el reactivo de trabajo de la muestra combinando:
  • 6 ml de diluyente de lisis
  • 600 ml de reactivo de lisis
  • 32 ml de sondas objetivo de 500 fm/ml para la captura (20 fm/200 ml finales)
  • 96 ml de sondas objetivo de 500 fm/ml para la etiqueta (60 fm/200 ml finales)

Nota: Las concentraciones reales de las sondas objetivo variarán en función de la molécula de ácido nucleico objetivo.

  1. Para muestras de plasma o suero, pipetee 150 ml de reactivo de trabajo de muestras y 50 ml de suero o plasma en micropocillos modificados con oligonucleótidos por duplicado. Para las muestras de células o tejidos, prepare y extraiga los pellets de ARN en el reactivo de trabajo de las muestras como se describe y pipetee 200 ml de cada extracto de ARN en micropocillos modificados con oligonucleótidos por duplicado.
  2. Si se desea, pueden incluirse controles positivos y negativos con fines de especificidad. Los controles deben tratarse de la misma manera que se ha descrito para las muestras en el paso 2 (arriba) y ejecutarse por duplicado.
  3. Si se desea, pueden incluirse estándares para la cuantificación absoluta. Pipetear 150 ml de reactivo de trabajo de la muestra y 50 ml del miembro de la curva estándar apropiado en micropocillos modificados con oligonucleótidos por duplicado.
  4. Sellar los micropocillos con película Mylar e incubar los micropocillos durante la noche a 53°C en el calentador de placas Chiron. (Nota: La temperatura dependerá de la temperatura óptima definida para el ensayo específico.)

Día 2

  1. Sacar la placa del calentador de placas Chiron y dejarla reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Mientras la placa se enfría, prepare la solución de amplificación diluyendo el concentrado de amplificación a 200 fm/ml en diluyente de etiqueta. La concentración final debe ser de 10 fm/50 ml.
  2. Lavar los micropocillos dos veces con el Lavado A, y luego pipetear 50 ml de amplificador diluido en cada pocillo. Incube los micropocillos durante 30 minutos a 53 °C en el calentador de placas Chiron.
  3. Saque la placa del calentador de placas Chiron y déjela reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Mientras la placa se enfría, prepare la solución de trabajo de etiquetas diluyendo la sonda de etiquetas a 500 fm/ml en diluyente de etiquetas. La concentración final debe ser de 20 fm/50 ml.
  4. Lavar los micropocillos dos veces con el Lavado A, y luego pipetear 50 ml de la Solución de Trabajo de Etiquetas en cada pocillo. Incube los micropocillos durante 15 minutos a 53 °C en el calentador de placas Chiron.
  5. Saque la placa del calentador de placas Chiron y déjela reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, prepare la solución de sustrato hecha con LumiphosPlus al 99,7% v/v y SDS al 0,3% v/v al 10% (por ejemplo: 3 ml de LumiphosPlus, 9 ml de SDS al 10%).
  6. Lave los micropocillos dos veces con el lavado A y luego tres veces con el lavado B. Añada 50 ml de la solución de sustrato en cada pocillo.
  7. Medir la quimioluminiscencia en el luminómetro de lectura de placas. (Esto incluye la incubación de los micropocillos durante 30 minutos a 37°C antes de la medición para alcanzar la cinética de estado estacionario).

Solución de problemas

  • Los pocillos modificados con ligonucleótidos deben manipularse con cuidado. No rompa las tiras de pocillos en segmentos. Selle los pocillos de forma segura con un sellador de placas nuevo para evitar la evaporación durante las incubaciones. Cuando retire el sellador de placas después de las incubaciones, tenga cuidado de no sacar los pocillos del soporte de micropocillos.
  • Todas las muestras, estándares y controles deben ensayarse por duplicado para una cuantificación óptima. Anule las muestras lipémicas o turbias, ya que pueden dar resultados no concluyentes.
  • Para obtener resultados óptimos, todos los reactivos deben llevarse a la temperatura indicada en el procedimiento del ensayo antes de su uso. Añada el reactivo a los micropocillos tocando con la punta de la pipeta la pared cerca del punto medio del pocillo, por encima de la superficie del fluido en el pocillo.

Aplicación

La cuantificación viral o las pruebas de carga viral se han convertido en parte del manejo rutinario de los pacientes infectados por el VIH-1 o el virus de la hepatitis C (VHC). Actualmente existen varias tecnologías moleculares que están disponibles para su uso en el entorno del laboratorio clínico. De ellas, sólo los ensayos de ADN ramificado (ADNb) están aprobados por la FDA para las pruebas de carga viral del VIH-1 y el VHC. Esta tecnología de amplificación de señales se basa en una serie de reacciones de hibridación que son muy susceptibles de automatización total y, por lo tanto, reducen la cantidad de trabajo necesaria para realizar este tipo de análisis.

Los ensayos de diagnóstico molecular que utilizan la tecnología de ADNb para la detección de moléculas diana de ácidos nucleicos son herramientas sensibles, específicas y fiables en el diagnóstico de infecciones víricas y bacterianas y para el seguimiento de la progresión de la enfermedad durante el curso de la terapia. Los ensayos de ADNb han evolucionado desde las fases de desarrollo en el laboratorio de investigación hasta los ensayos cuantitativos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos con valiosas aplicaciones clínicas. Los ensayos de bADN requieren menos mano de obra que muchos procedimientos de base molecular, ya que son muy susceptibles de automatización total. Utilizando el ADNb, no se requiere la amplificación de una secuencia objetivo y, por lo tanto, la contaminación cruzada entre muestras replicadas debido a amplicones excesivos o arrastre es menos probable en los ensayos de ADNb. Además, dado que el ADNb es una tecnología de amplificación de señales, el ensayo es capaz de cuantificar con una variabilidad inferior a 0,5 log o 3 veces para todo su rango dinámico.

La tecnología de ADNb ha demostrado ser versátil porque se han desarrollado métodos para la detección de la infección por una amplia gama de microorganismos, incluyendo el parásito Trypanosoma

brucei, el citomegalovirus, las bacterias Staphylococcus sensibles a los antibióticos y resistentes a los antibióticos, el virus del papiloma humano y el virus de la hepatitis B. Sin embargo, los esfuerzos más recientes se han centrado en el desarrollo de ensayos de bADN para la cuantificación del ARN del VIH-1 y del virus de la hepatitis C (VHC), lo que ha llevado a la aplicación rutinaria de métodos de bADN en el laboratorio de diagnóstico molecular clínico. Al describir el avance de los métodos de ADNb, esta revisión hace hincapié en los ensayos de ADNb para el VIH-1 y el VHC.

Ensayos de ADNb de primera generación para el VIH-1

Se desarrollaron ensayos de ADNb de primera generación precisos y reproducibles para la detección del ARN del VIH-1 y el ARN del VHC en plasma humano (ensayo Quantiplex HIV-1 o HCV RNA 1.0, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 En uno de los primeros informes sobre el ensayo de ADNb Quantiplex, no se observó ninguna reactividad utilizando muestras de plasma de donantes seronegativos con el ensayo de ADNb de primera generación

, lo que indica una excelente especificidad.9 Se observaron resultados positivos en el ensayo de ADNb en el 83% de las muestras de 348 pacientes que eran seropositivos para el VIH-1.9 El rango dinámico para la cuantificación utilizando el ensayo Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 se extendió desde 104 (límite inferior de detección) hasta más de 106 copias de ARN del VIH/mL.9,11 Los cambios en la carga viral de 2 a 3 veces fueron estadísticamente significativos utilizando la prueba de ADNb, lo que indica que el ensayo Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 era muy preciso y reproducible.11 En comparación, eran necesarios cambios en la carga viral de al menos 3,7 a 5,8 veces antes de que los resultados fueran estadísticamente significativos utilizando las primeras versiones del ensayo RT-PCR.11 Por lo tanto, el ADNb se convirtió en el método de elección para la mayoría de los ensayos clínicos que evaluaban las pruebas de carga viral y la eficacia clínica de los nuevos inhibidores de la transcriptasa inversa y de la proteasa del VIH-1.

La sensibilidad del método de detección del ADNb se mejoró en el ensayo del VIH-1 de segunda generación (ensayo Quantiplex HIV-1 RNA 2.0, Bayer) al cambiar el diseño de las sondas objetivo y de captura y al añadir oligonucleótidos preamplificadores. El diseño mejorado de las sondas objetivo y de captura permitió aumentar la rigurosidad de la hibridación, disminuyendo así el fondo del ensayo. Los preamplificadores aumentan drásticamente la intensidad de la señal porque cada molécula de preamplificador tiene múltiples regiones para la hibridación con muchas moléculas de ADNb. Además, cada molécula de ADNb tiene múltiples secuencias repetidas para la hibridación de las sondas marcadas con AP. La señal de salida utilizando el ensayo Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 mostró linealidad desde aproximadamente 500 copias/mL hasta 1,6 × 106 copias/mL (el rango dinámico declarado fue de 500 a 8 × 105 copias/mL). La sensibilidad del ensayo de ADNb del VIH-1 de segunda generación se multiplicó por 20 en comparación con el ensayo de primera generación (los límites inferiores de detección fueron 500 copias/mL y 10 × 104 copias/mL, respectivamente). En un análisis exhaustivo de la precisión, se compararon los resultados de la prueba inicial y los resultados de la repetición de la prueba Quantiplex HIV-1 RNA 2.0. El ensayo de ARN del VIH-1 2.0 resultó ser altamente reproducible.14 De 174 muestras con cargas virales de más de 5.000 copias/mL, el 96% tuvo diferencias de menos de 0,3 log10 en el número de copias entre los resultados iniciales y los resultados de la repetición de la prueba. De 69 muestras con cargas virales entre 500 y 5.000 copias/mL, el 86% tuvo diferencias inferiores a 0,3 log10 entre los resultados iniciales y los de la repetición de la prueba. Sin embargo, entre los 5.339 pacientes que se sometieron a pruebas clínicas rutinarias durante un intervalo de 1 año, se observaron cargas virales de menos de 500 copias/mL en el 41,6% de las muestras.

Por lo tanto, se necesitaba un ensayo de ADNb con mayor sensibilidad (es decir, con un límite de detección inferior de <500 copias/mL) para una proporción sustancial de pacientes.

Se compararon las características de rendimiento del ensayo Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 y de una prueba de RT-PCR (ensayo Amplicor HIV-1 Monitor 1.0, Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) utilizando diluciones de muestras estándar que tenían números de copias del virus VIH-1 conocidos. Cuando se probaron diluciones de los mismos estándares en los dos ensayos, los números de copias del VIH-1 fueron generalmente más altos en el ensayo de RT-PCR que en el ensayo de ADNb. Por ejemplo, los rangos de números de copias de ARN fueron de 900 a 7,68 × 105 copias/mL en el ensayo de ADNb y de 3.360 a 1,88 × 106 copias/mL en el ensayo de RT-PCR. Ambos ensayos fueron lineales para los rangos dinámicos indicados.

La comparación de las pendientes de las líneas de regresión del número de copias del VIH-1 frente a la salida de la señal sugirió que la prueba de ADNb tenía un error sistemático menos proporcional. La variabilidad entre ejecuciones, utilizando una muestra estándar con 1.650 copias/mL del VIH-1, fue menor en la prueba de ADNb que en el ensayo de RT-PCR; los coeficientes de variación para los ensayos de ADNb y RT-PCR fueron del 24,3% y el 34,3%, respectivamente, lo que indica que el ensayo de ADNb fue ligeramente más preciso en este número de copias de ARN del VIH-1. En comparación con el uso del estándar de 1.650 copias/mL, los coeficientes de variación entre ejecuciones fueron mayores para una muestra que contenía 165 copias/mL de ARN del VIH-1 (44,0% y 42,5%).7% para los ensayos de ADNb y RT-PCR, respectivamente). Los resultados del ensayo fueron similares cuando se compararon números de copias del VIH-1 iguales entre los subtipos A a F del VIH utilizando la prueba de ADNb. Sin embargo, mediante esta versión de RT-PCR, los subtipos A, E y F se detectaron con menos eficacia que los subtipos B, C y D. Las diferencias entre la prueba de ADNb de segunda generación y la prueba de RT-PCR Amplicor Monitor para la cuantificación del VIH-1 indicaron que se requería coherencia en el método de prueba para cada paciente individual a lo largo del diagnóstico y el tratamiento.

Ensayos de ADNb del VHC

Mientras continuaba desarrollando un ensayo mejorado de ADNb del VIH-1 de tercera generación, Bayer reconoció la necesidad de desarrollar un ensayo de carga viral del VHC con una utilidad clínica emergente similar a la de las pruebas del VIH-1. Para la detección del VHC, el ensayo de ADNb de primera generación (ensayo Quantiplex HCV RNA 1.0, Bayer) tenía un rango dinámico de cuantificación en plasma humano de 3,5 × 105 a 1,2 × 108 copias de ARN del VHC/mL. Los genotipos 1 a 6 se detectaron utilizando este ensayo, aunque la sensibilidad fue menor para los genotipos 2 y 3 (tasa de detección del 67%: señal positiva para 60 de 89 muestras de suero que se sabía que contenían los genotipos 2 o 3 del VHC) en comparación con el genotipo 1 (tasa de detección del 97%: señal positiva para 67 de 69 muestras de suero que se sabía que contenían el genotipo 1 del VHC). Una comparación entre el ensayo Quantiplex HCV RNA 1.0 y una prueba de RT-PCR desarrollada por un laboratorio de investigación para el VHC mostró una mayor sensibilidad en la prueba de RT-PCR, que tenía un límite inferior de detección de 2,5 × 104 copias/mL de ARN del VHC. Sin embargo, la prueba de ADNb del VHC presentaba una mayor reproducibilidad y requería menos tiempo que la prueba de RT-PCR del VHC desarrollada por el laboratorio.

Para mejorar la tasa de detección de los genotipos 2 y 3 del VHC, se desarrolló un ensayo de segunda generación (ensayo Quantiplex HCV RNA 2.0, Bayer).15 El principal cambio en el diseño del ensayo de ARN del VHC de segunda generación fue el uso de sondas para las secuencias del genoma del VHC que estaban más conservadas entre los genotipos. Estas regiones conservadas eran secuencias 5′ no traducidas y secuencias en el gen central del genoma del VHC. El resultado de los cambios en las sondas objetivo y de captura fue la reducción drástica de la variación en la tasa de detección entre los genotipos del VHC en el ensayo de segunda generación. Cada uno de los 6 genotipos del VHC tuvo una alta tasa de detección, y hubo una notable mejora en la detección de los genotipos 2 y 3 del VHC (detección del 93% frente al 67% de las muestras que se sabía que contenían los genotipos 2 o 3 del VHC en los ensayos VHC 2.0 y VHC 1.0, respectivamente). Además, la sensibilidad del ensayo de ADNb de segunda generación aumentó ligeramente en comparación con el ensayo del VHC 1.0 (los límites inferiores de cuantificación fueron de 2,0 × 105 frente a 3,5 × 105 ).

Ensayos de ADNb de tercera generación para el VIH-1 y el VHC

En los ensayos de ADNb de primera y segunda generación, la hibridación inespecífica de las sondas de oligonucleótidos con secuencias no objetivo limitaba la sensibilidad del ensayo. La mejora tecnológica fundamental en el ensayo de ADNb de tercera generación (ensayo Quantiplex HIV-1 RNA 3.0, Bayer) fue el uso de bases no naturales, 5′-metil-2′-desoxiisoguanosina (isoG) y 5′-metil-2′-isodesoxicitidina (isoC), en la síntesis de todas las sondas del sistema de ADNb, con la excepción de los extensores de captura que median en la captura del ácido nucleico viral objetivo en la superficie de la placa. Dado que los oligonucleótidos que contienen isoG e isoC no están presentes en la naturaleza, la hibridación no específica se reduce significativamente. Así, las sondas modificadas con las bases no naturales no forman híbridos estables con la sonda de captura en ausencia del ARN diana. En la descripción inicial del ensayo de tercera generación, el límite de detección del VIH-1 en muestras de plasma de 11 pacientes fue de 50 copias por mL, lo que representa una mejora de 10 veces en el límite de detección en comparación con el ensayo de segunda generación. Durante el tratamiento con antirretrovirales de gran actividad, la carga viral del VIH-1 disminuyó por debajo del límite de detección en los 11 pacientes.

El ensayo VERSANT HIV-1 RNA 3.0 tiene un rango dinámico de 75 a 5 × 105 copias de ARN del VIH/mL. La versión 3.0 también ha sido aprobada hasta un límite inferior de detección igual a 50 copias/mL en varios otros países. Cuando se compararon muestras emparejadas en el ensayo de ADNb del VIH-1 de segunda generación (Quantiplex versión 2.0) y el ensayo de RT-PCR Amplicor Monitor 1.0, se obtuvieron números de copias del VIH-1 consistentemente más bajos utilizando el ensayo de ADNb. Sin embargo, se observó una estrecha correlación cuantitativa en los números de copias de ARN del VIH-1 entre el ensayo de tercera generación (versión 3.0) y la prueba de RT-PCR Amplicor Monitor 1.5.18 Los resultados de la carga viral en el ensayo de ADNb de la versión 3.0 y en el ensayo de RT-PCR Amplicor fueron aproximadamente 2 veces mayores que en el ensayo de la versión 2.0. Los resultados cuantitativamente similares en la prueba de ADNb de la versión 3.0 y en la prueba de RT-PCR son importantes en la atención a los pacientes debido a la probable posibilidad de que se utilicen métodos diferentes en las pruebas de muestras del mismo paciente para el curso de las terapias contra el VIH. Los datos recientes sugieren que puede no ser necesario volver a realizar un análisis de base para los pacientes analizados con un ensayo de RT-PCR.

De forma similar al ensayo de ADNb del VIH-1 versión 3.0, el ensayo de ADNb de tercera generación para el VHC también utilizó oligonucleótidos sustituidos por isoC e isoG para reducir la hibridación no específica. El uso de oligonucleótidos sustituidos por isoC e isoG aumentó la sensibilidad del ensayo aproximadamente 62 veces. El límite inferior de detección del ensayo HCV RNA 3.0 fue de 3,2 × 103 copias/mL en comparación con 2 × 105 copias/mL en el ensayo HCV RNA 2.0. El rango dinámico de cuantificación lineal del ensayo de ARN del VHC 3.0 se extendió de 3,2 × 103 copias/mL (615 UI/mL) a 4 × 107 copias/mL de ARN del VHC (7,7 × 106 UI/mL). El ensayo de ARN del VHC 3.0 tuvo una alta especificidad (98,2%) y, al igual que el ensayo de segunda generación, fue igualmente eficaz en la cuantificación del ARN del VHC en todos los genotipos. Las desviaciones estándar entre series y dentro de las series para las muestras repetidas fueron de 0,2 log10 y 0,14 log10, respectivamente, lo que indica que el ensayo de tercera generación fue altamente reproducible.

Además de la erradicación del VHC en el suero, un objetivo importante de las terapias contra el VHC es reducir los niveles del VHC en el hígado. La utilidad del ensayo HCV RNA 3.0 para la detección y cuantificación del ARN del VHC en muestras de biopsia hepática se estudió en 25 pacientes coinfectados por el VHC y el VIH.20 La reproducibilidad del ensayo de ADNb del VHC de tercera generación fue similar entre las muestras de biopsia hepática y las de suero. Además, la detección del ARN del VHC en muestras de hígado de pacientes infectados con los genotipos 1, 3 y 4 mediante el ensayo de ARN del VHC 3.0 fue altamente específica y sensible. En este estudio de 25 pacientes, los altos niveles de VHC intrahepático antes del tratamiento se correlacionaron con una baja frecuencia de respuesta a la terapia contra el VHC. Los niveles intrahepáticos de VHC antes del tratamiento fueron más altos en los pacientes infectados por el genotipo 1 del VHC. Los resultados de este estudio demostraron que importantes marcadores de la progresión de la enfermedad del VHC, los niveles del VHC en el hígado y en el suero, pueden cuantificarse de forma fiable mediante el análisis del ADNb durante el tratamiento. Los métodos de los ensayos de ADNb de tercera generación incluyen la preparación de la muestra, la hibridación y la detección de señales para el ARN del VIH-1 y el ARN del VHC. Los 3 s eps se realizan en los micropocillos de la plataforma System 340 para el ensayo HCV RNA 3.0 que no requiere un paso de extracción por separado. En la versión 3.0 del ensayo de ARN del VIH-1, la preparación de la muestra es diferente del método de ARN del VHC y se realiza fuera de la plataforma System 340. Un estudio reciente evaluó una adaptación del método de ARN del VIH-1 de la versión 3.0 en la que se modificó el paso de procesamiento de la muestra del VIH-1 para poder realizar pruebas simultáneas del VHC y del VIH-1 en la plataforma System 340. El método del VIH-1 se modificó omitiendo la incubación de 2 horas a 63°C para la lisis viral. En su lugar, la lisis del VIH-1 y del VHC se realizó en la plataforma System 340. Los métodos de prueba de ADNb del VHC no se modificaron en el ensayo combinado. La especificidad y la cuantificación mediante el método combinado de ADNb estuvieron dentro de las especificaciones para los ensayos individuales de VIH-1 y VHC. La realización de pruebas simultáneas para el VIH-1 y el VHC mejoró el flujo de trabajo en el laboratorio clínico y dio lugar a una reducción de los costes. Dado que la detección y cuantificación del ARN del VIH-1 y del ARN del VHC son cruciales para el diagnóstico y para la evaluación de las respuestas a la terapia, la capacidad de realizar pruebas simultáneas para ambos virus representa un avance significativo en el diagnóstico molecular.