Un enfoque más preciso para la detección y subtipificación de amiloides: Combinando la Tinción Rojo Congo in situ y la Inmunohistoquímica

Abstracto

La amiloidosis es el resultado de varias enfermedades de diferente abordaje. Es vital subtipificar los depósitos amiloides para establecer y finalmente tratar adecuadamente la enfermedad subyacente. Además de la clásica tinción con rojo Congo, se necesitan otros procedimientos como la tinción inmunohistoquímica para la clasificación. Aquí, presentamos un enfoque más preciso utilizando la doble tinción rojo Congo/inmunohistoquímica fácilmente aplicable en los diagnósticos de rutina. Fue necesario modificar la técnica de tinción con rojo Congo y los procedimientos inmunohistoquímicos para combinar ambos procedimientos de tinción en un solo portaobjetos. La evaluación se realizó mediante microscopía de luz y fluorescencia convencionales. Acortando el tiempo de tinción para el rojo Congo a 10 s y mediante una modificación relativa al bloqueo de la peroxidasa endógena, se pudieron obtener resultados precisos para evaluar la doble tinción rojo Congo/inmunohistoquímica utilizando un microscopio de fluorescencia. Las secciones de 2 μm en lugar de 4 μm de grosor fueron superiores para la evaluación, ya que aumentaron la especificidad de la tinción. La combinación de rojo Congo e inmunohistoquímica como doble tinción in situ en un portaobjetos es un enfoque factible en el diagnóstico de la amiloidosis. Permite centrarse en las áreas positivas al rojo Congo fluorescente cuando se evalúa la inmunohistoquímica, evitando así descartar resultados falsos positivos. Además, aumenta la relación señal-ruido de las secciones teñidas inmunohistoquímicamente en la microscopía convencional.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Introducción

La amiloidosis es la descripción morfológica de la deposición de proteínas mal plegadas que puede encontrarse en muchos tipos de tejidos diferentes . Las proteínas que forman el amiloide proceden de una plétora de fuentes, que van desde los tumores, como las neoplasias de células plasmáticas o los carcinomas medulares de tiroides, hasta las infecciones crónicas, o se observan como resultado del envejecimiento. En raras ocasiones, la amiloidosis se debe a trastornos de mal plegamiento de proteínas heredados genéticamente. La importancia clínica de la amiloidosis abarca desde el hallazgo incidental en las autopsias hasta las enfermedades potencialmente mortales. Al examinar las muestras de tejido, es importante que los patólogos tengan en cuenta la probabilidad de que se produzcan depósitos de amiloide, ya que podría ser la primera pista de una enfermedad subyacente grave aún desconocida. Es importante destacar que, aunque hay resultados prometedores en relación con las terapias dirigidas a los depósitos amiloides en sí mismos, los enfoques de tratamiento en la amiloidosis todavía tienen como objetivo principal el trastorno subyacente y, en la mayoría de los casos, esto, a su vez, puede y debe determinarse sobre la base de la subtipificación amiloide.

La tinción histoquímica clásica para el amiloide es el rojo Congo, tal como fue introducido por Bennhold en 1922; la birrefringencia típica «verde manzana» utilizando la polarización se describió por primera vez en 1927. Para aumentar la sensibilidad y especificidad de la tinción con rojo Congo, se han utilizado varios métodos, incluyendo la evaluación de las secciones teñidas con rojo Congo mediante luz fluorescente, debido a las conocidas propiedades fluorescentes del rojo Congo . Recientemente, se han propuesto enfoques que utilizan una técnica de polarización de hematoxilina-eosina reforzada digitalmente para la detección de amiloide, siendo particularmente útil para identificar el amiloide en casos con escaso tejido disponible.

El estándar de oro para la subtipificación del amiloide es la inmunohistoquímica, incluyendo varios protocolos bien establecidos; sin embargo, hay algunas deficiencias, especialmente teniendo en cuenta la menor especificidad de los anticuerpos contra la cadena ligera amiloidógena lambda. Un nuevo enfoque para la subtipificación de variantes especialmente raras de la amiloidosis es la espectrometría de masas; desgraciadamente, debido a problemas de coste y disponibilidad, este prometedor método no ha sido ampliamente utilizado hasta ahora, siendo un defecto adicional su evidente limitación en casos con escaso tejido disponible o con una cantidad limitada de amiloide depuesto. Otro logro reciente es el uso de la microscopía inmunoelectrónica de aspirados de grasa abdominal para la subtipificación de los depósitos de amiloide; sin embargo, se trata de un método sofisticado.

Varios estudios anteriores se han centrado en la combinación de fluorescencia e inmunohistoquímica . Aquí, presentamos pruebas adicionales de la viabilidad de dicho enfoque e informamos de un protocolo fácilmente traducible a la rutina, que nos permitió abordar con precisión la subtipificación amiloide en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. La doble tinción rojo Congo/inmunohistoquímica permite centrarse en las áreas positivas al rojo Congo cuando se evalúa la inmunohistoquímica y aumenta la relación señal-ruido de las secciones teñidas inmunohistoquímicamente en la evaluación convencional con microscopio de luz, mejorando tanto la especificidad como la sensibilidad del procedimiento, así como reduciendo la cantidad de tejido necesario para el diagnóstico.

Materiales y métodos

Selección de casos

Para establecer la nueva técnica se utilizaron especímenes con diagnóstico probado de amiloidosis de nuestro archivo. Se enumeran en la tabla 1 incluyendo los pasos para los que se utilizó el tejido respectivo.

Enfoques de tinción de rojo Congo

La tinción de rojo Congo se realizó inicialmente según el protocolo establecido en nuestro instituto: el tejido fijado en formol e incluido en parafina se corta en secciones de 6 μm de grosor, se desparafina y se tiñe con rojo Congo durante 30 min.5 g de rojo Congo (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) y 1 g de hidróxido de potasio (Merck Millipore) disueltos en 500 ml de etanol al 80%; después, las secciones se enjuagan con agua del grifo antes de teñirlas con hematoxilina (Merck Millipore) durante 4 minutos. En un siguiente paso, las secciones se diferencian en una solución de HCl/etanol al 0,5% y se vuelven a enjuagar con agua del grifo durante 10 minutos antes de deshidratarlas y montarlas.

Para nuestro estudio, se modificó el protocolo en lo que respecta al tiempo de tinción con rojo Congo para ver qué impacto podrían tener los tiempos de tinción más cortos en la tinción inmunohistoquímica posterior. También se probaron secciones con un grosor de 2 y 4 μm.

Tinción inmunohistoquímica y bloqueo de la peroxidasa endógena

Las condiciones de tinción inmunohistoquímica para los distintos subtipos de amiloide se enumeran en la tabla 2. Como sugiere el fabricante, se utilizaron dos clones diferentes para la detección de las cadenas ligeras amiloidógenas kappa y lambda, respectivamente. La inmunohistoquímica se realizó después del procedimiento de tinción con rojo Congo. Brevemente, los portaobjetos desparafinados y bloqueados con peroxidasa endógena (véase más adelante) se incubaron en suero normal de caballo (para la tinción de amiloide AA) o suero normal de cabra (para todas las demás tinciones) / solución salina tamponada con Tris (TBS) (900 μl de suero/60 ml de TBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente (ambos sueros de Vector Lab., Burlingame, Calif, EE.UU.) y, a continuación, se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario a 4 °C, se enjuagaron y se incubaron con una solución de IgG antiratón biotinilado (para la tinción de amiloide AA) o de IgG anti-conejo biotinilado (para todos los demás procedimientos de tinción) (300 μl de IgG/900 μl de suero normal de caballo o de cabra/60 ml de TBS; ambos IgG de Vector Lab.) durante 30 min a temperatura ambiente; finalmente, se enjuagaron y se incubaron con un kit de avidina-biotina-peroxidasa (Vectastain de Vector Lab.) durante 30 min y se visualizaron aplicando 3-amino-9-etilcarbazol (AEC; de Dako, Glostrup, Dinamarca) listo para usar como cromógeno (10-20 min bajo control óptico instantáneo) y hematoxilina de Meyer (de Medite, Dietikon, Suiza). Se prefirió el uso de AEC, ya que experimentos anteriores mostraron mejores resultados de señal-ruido para la visualización de AEC en comparación con la visualización de diaminobenzidina. Como la AEC es soluble en agua y alcohol, los portaobjetos se cubrieron con Medi-Mount (de Medite, Burgdorf, Alemania) durante 30 minutos antes de cubrirlos.

Dado que el tratamiento habitual para el bloqueo de la peroxidasa endógena de los tejidos (solución de H2O2 al 3% en etanol al 70%) después de completar la tinción con rojo Congo conducía a la pérdida de la congofilia, se probaron otros métodos para el bloqueo de la peroxidasa endógena, como: desplazar este paso antes de la tinción con rojo Congo y sustituir el etanol al 70% por agua destilada.

Evaluación

Las secciones teñidas con rojo Congo/inmunohistoquímica se evaluaron en primer lugar utilizando un microscopio de luz convencional para estimar si el producto cromógeno inmunohistoquímico respectivo se visualizaba como se esperaba, peor o mejor en comparación con la tinción rutinaria de diagnóstico (sin tinción previa con rojo Congo). Posteriormente, se utilizó un microscopio de fluorescencia con un filtro de rodamina (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Alemania) para evaluar la fluorescencia del colorante rojo Congo. Las áreas que mostraban una fluorescencia intensiva específica se evaluaron además mediante microscopía óptica para ver si los depósitos de amiloide también podían detectarse mediante inmunohistoquímica en estas áreas.

Resultados

Paso 1: Modificaciones del protocolo de tinción con rojo Congo

Se probaron varios tiempos de tinción para el colorante rojo Congo. Esto fue necesario ya que la capacidad de los anticuerpos para unirse a los antígenos se redujo por el procedimiento de tinción con rojo Congo y el rojo Congo de intensidad total dificultó la evaluación concomitante, ya que se utilizó un cromógeno rojo (AEC) con un color similar al del rojo Congo para la inmunohistoquímica. Aplicando el tiempo de tinción original de 30 minutos, se pudo detectar la birrefringencia de los depósitos amiloides utilizando un filtro polarizado en la microscopía de luz convencional. Cuando la tinción para el rojo Congo duraba sólo 5, 10 o 20 s, siempre se podían detectar señales positivas cuando se utilizaba el filtro de rodamina de un microscopio de fluorescencia, mientras que la microscopía convencional sólo mostraba ocasionalmente congofilia y birrefringencia utilizando el filtro polarizado (fig. 1). Para el análisis posterior, el tiempo de tinción con rojo Congo se redujo preferentemente a 10 s para evitar un exceso de tinción; se han elegido 10 s por razones de practicidad (más fácil de cumplir de forma constante en comparación con 5 s) en el laboratorio húmedo.

Paso 2: Modificaciones de los protocolos inmunohistoquímicos para combinar la tinción con rojo Congo y la tinción inmunohistoquímica en un portaobjetos

En un primer paso, se realizó la tinción inmunohistoquímica en secciones separadas para confirmar la antigenicidad de los tejidos utilizados para este estudio, que mostraron resultados de tinción satisfactorios utilizando los protocolos de rutina establecidos, como se detalla en la tabla 2.

Cuando se combinó la tinción con rojo Congo (tiempo de tinción con rojo Congo de 10 s) con la tinción inmunohistoquímica en las mismas secciones, se observó que la congofilia desaparecía después de completar los procedimientos inmunohistoquímicos utilizando el tratamiento común para el bloqueo de la peroxidasa endógena de los tejidos (solución de H2O2 al 3% en etanol al 70%), ya que el colorante rojo Congo se había lavado. Por lo tanto, en un tercer paso, se modificó el tratamiento para el bloqueo de la peroxidasa endógena. El bloqueo de la peroxidasa endógena utilizando el método convencional, pero aplicándolo antes del procedimiento de tinción con rojo Congo, así como la sustitución del etanol al 70% por agua destilada, al realizar el bloqueo de la peroxidasa endógena después de la tinción con rojo Congo, condujo a resultados satisfactorios, tanto para la evaluación de la tinción con rojo Congo como para la tinción inmunohistoquímica. Para ceñirse en lo posible al flujo de trabajo habitual del laboratorio húmedo, se aplicó además el método que sustituye el etanol por agua destilada. El intento de omitir el bloqueo de la peroxidasa endógena disminuyó moderadamente los resultados de la relación señal/ruido para la visualización de la CEA (suponiendo que las enzimas endógenas no bloqueadas utilizaran la CEA y, por un lado, mancharan ligeramente el fondo y, por otro, privaran al complejo ABC-peroxidasa del cromógeno para su correcta visualización) y, por tanto, no se siguió explotando. La calidad de la tinción inmunohistoquímica después de la tinción previa con rojo Congo fue la misma que la de la tinción inmunohistoquímica sin tinción previa con rojo Congo; por lo tanto, concluimos que la realización de la inmunohistoquímica en secciones teñidas previamente con rojo Congo durante 10 s no conduce a una pérdida de antigenicidad ni a resultados de tinción inespecíficos.

Paso 3: Modificaciones de los grosores de las secciones

Por último, examinamos el papel de diferentes grosores de sección (2 y 4 μm). En general, la especificidad y la evaluabilidad de la tinción inmunohistoquímica (relación señal/ruido) fueron mejores en las secciones más finas; además, hubo menos artefactos relativos al desprendimiento del tejido de los portaobjetos durante los procedimientos de tinción. Todos los casos mostraron los mismos resultados que se obtuvieron durante la subtipificación diagnóstica inicial de los depósitos amiloides.

Ejemplos de implementación del enfoque descrito en los procedimientos diagnósticos de rutina

Las figuras 2 y 3 ilustran dos casos de rutina, en los que se pudo lograr la subtipificación amiloide utilizando el nuevo algoritmo propuesto en este estudio; aplicando únicamente la técnica convencional, no se han obtenido resultados interpretables.

Discusión

Aquí, presentamos y validamos un procedimiento combinado de tinción doble de rojo Congo/inmunohistoquímica, que permite centrarse en las áreas positivas al rojo Congo cuando se evalúa la inmunohistoquímica, mejorando así la especificidad de la subtipificación amiloidea in situ. También ayuda a ahorrar tejido, lo cual es un problema ya que el material de biopsia es cada vez más limitado debido a los cambios en los enfoques de diagnóstico que utilizan núcleos de agujas finas y forceps de biopsia.

En contraste con otras nuevas técnicas de evaluación propuestas que se centran en la evaluación sofisticada de imágenes digitalizadas, nuestro enfoque puede ser fácilmente incorporado en los diagnósticos de rutina. Los requisitos previos sólo comprenden la modificación de la tinción roja Congo establecida, la inmunohistoquímica amiloide disponible, así como un microscopio de fluorescencia con un filtro de rodamina. Lo ideal sería utilizar microscopios equipados tanto para la microscopía de fluorescencia como para la microscopía de luz convencional, ya que esto simplifica el proceso de verificación en las mismas áreas (fluorescentes) de interés de la deposición de amiloide al evaluar la inmunohistoquímica mediante un simple cambio de fuente de luz y de filtro. Sin embargo, también podrían utilizarse dos microscopios diferentes, aunque en los casos difíciles, podría sugerirse tomar una foto de las áreas respectivas en microscopía de fluorescencia y de luz para facilitar la evaluación.

En concordancia con estudios anteriores, pudimos demostrar que el rojo Congo no interfiere ni perturba la inmunohistoquímica . Además, en comparación con los espesores de sección de 4-6 μm utilizados en la mayoría de los estudios hasta ahora , pudimos demostrar que el uso de secciones más delgadas de 2 μm, que son ventajosas para la inmunohistoquímica (mejor relación señal-ruido, menos artefactos de desprendimiento), también puede conducir a resultados satisfactorios con respecto a la tinción con rojo Congo, si se lee con un microscopio fluorescente.

Ha habido varios trabajos recientes que propagan el uso de la fluorescencia para evaluar los depósitos de amiloide y que demuestran su superioridad sobre la microscopía de luz polarizada por ser tanto más específica como más sensible . En este estudio, hemos refinado y optimizado este enfoque de varias maneras, trabajando en un protocolo adaptado en relación con el tiempo de tinción, los procedimientos de tinción, así como el espesor de la sección. Estos cambios finalmente permitieron realizar una doble tinción in situ para la detección sensible y específica de los depósitos amiloides, así como para la subtipificación de estos depósitos, que es crucial para distinguir la enfermedad subyacente que conduce a los depósitos amiloides. Nuestro enfoque de doble tinción no sólo permite detectar sensiblemente el amiloide por fluorescencia y al mismo tiempo categorizar específicamente estos depósitos, sino también ahorrar material evitando secciones seriadas, en las que los depósitos de amiloide, a veces diminutos, podrían haber sido ya cortados. Desde el establecimiento de esta doble tinción, ya hemos utilizado este enfoque en varios casos, en los que no se pudo llegar a un diagnóstico final por otros métodos. Las figuras 2 y 3 ilustran dos de estos casos.

Sin embargo, todavía puede haber espacio para un perfeccionamiento adicional. Como los sistemas de detección basados en la inmunoalcalina-fosfatasa que no necesitan el bloqueo de la peroxidasa endógena no se utilizan actualmente en nuestro flujo de trabajo inmunohistoquímico, la sustitución de los sistemas de detección basados en la inmunoperoxidasa por los primeros puede mejorar aún más los resultados y aligerar el flujo de trabajo del laboratorio.

Para concluir, presentamos un enfoque optimizado y refinado para la tinción doble de rojo Congo/inmunohistoquímica. Este enfoque es beneficioso con respecto a la especificidad, los costes y la cantidad de tejido necesario. Sus requisitos son mínimos y deberían permitir un uso generalizado.

Agradecimientos

Thomas Menter cuenta con el apoyo de la Fundación de Investigación del Cáncer Nuovo-Soldati, Vaduz, Liechtenstein.

Declaración de Ética

El estudio solo implica material humano de archivo del Instituto de Patología de Basilea y fue aprobado por el Comité de Ética del Noroeste y Centro de Suiza (EKNZ 2014-252). No se involucraron animales.

Declaración de divulgación

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

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