Una estructura compleja de arrestina-2 unida a un receptor acoplado a proteína G

Caracterización funcional y determinación de la estructura del complejo Arr2-NTSR1

Las interacciones de las arrestinas con GPCR no visuales son relativamente débiles y altamente dinámicas, pero la obtención de un complejo estable es un paso esencial para los estudios estructurales. Por lo tanto, antes de nuestros estudios estructurales, caracterizamos la interacción de NTSR1 con arrestinas utilizando el sistema comercial NanoBiT, que es un método eficaz para detectar las interacciones proteína-proteína.17 Se descubrió que NTSR1 interactúa tanto con Arr2 como con Arr3, lo que se ve potenciado por el aumento de las concentraciones del agonista peptídico, la neurotensina (NTS). Los mutantes de arrestinas con tres residuos hidrofóbicos C-terminales mutados a alanina (mutantes 3 A; I386A, V387A y F388A en Arr2, y I387A, V388A y F389A en Arr3),18,19 que se conocen como forma preactivada de arrestinas, mostraron una mayor actividad de unión a NTSR1 (Fig. 1b).

Además, probamos la interacción arrestina-NTSR1 mediante el ensayo Tango, un ensayo basado en células que determina las actividades de unión de proteínas de membrana a socios de unión solubles.7,20 Nuestros ensayos Tango mostraron que la actividad de unión de NTSR1 a Arr2 se incrementaba entre dos y tres veces, respectivamente, cuando se añadía el péptido agonista NTS o la pequeña molécula agonista ML314, un conocido modulador alostérico positivo (PAM),21,22. La actividad de unión de Arr2 a NTSR1 se multiplicó aproximadamente por cuatro cuando se utilizaron tanto NTS como ML314. La unión de NTSR1 a Arr2 aumentó aún más al introducir las mutaciones 3A (Fig. 1c).

Basado en los resultados anteriores, realizamos estudios estructurales utilizando el mutante 3A de Arr2 en complejo con NTSR1 en presencia de NTS y ML314 pero el complejo se disoció en las rejillas de crio-EM debido a los efectos adversos asociados con la vitrificación de la muestra. Para superar este problema de disociación, fusionamos el NTSR1 humano de tipo salvaje con el Arr2 humano mutante 3A en su extremo C con un enlazador de tres aminoácidos (GSA). También se fusionó el dominio RIL del citocromo b562 (BRIL) al N-terminal del receptor para aumentar la expresión del complejo. Arr2 se estabilizó aún más fusionando la cadena ligera Fab30, un fragmento de anticuerpo utilizado para estabilizar la forma activa de Arr2,23 en su C-terminal con un enlazador de 12 aminoácidos (GSAGSAGSAGSA). El constructo del complejo de fusión se coexpresó con la cadena pesada Fab30 marcada con His8 y con una quinasa de GPCR, GRK5, que fosforila el receptor para mejorar la unión de la arrestina. La proteína del complejo se purificó utilizando una columna de afinidad de níquel en presencia de 2 µM de NTS y 10 µM de ML314, y a continuación se concentró y se purificó aún más mediante cromatografía de filtración en gel para realizar estudios estructurales (Fig. 1d, e, véase la sección «Materiales y métodos» para más detalles).

La proteína del complejo BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 purificada mostraba una temperatura de fusión (Tm) relativamente alta a 58 °C determinada mediante un ensayo de cambio de termoestabilidad24 (Fig. 1f). Mostró una distribución uniforme cuando se inspeccionó mediante tinción negativa EM (Fig. 1g). Los datos de crio-EM de una sola partícula se recogieron con un microscopio FEI Titan Krios. Se registraron un total de 17.206 micrografías, y se recogieron y clasificaron más de 5 millones de partículas complejas para su posterior procesamiento de datos. La clasificación 2D identificó múltiples conformaciones de partículas complejas. Tras una clasificación intensiva en 3D, se seleccionaron 220.464 partículas (~4,5% del total de partículas iniciales) para la reconstrucción de la estructura (Información suplementaria, Fig. S1). El mapa de densidad mostró una resolución media de 4,8 Å determinada por el criterio de correlación de la cáscara de Fourier (FSC) de 0,143, con la estructura central compuesta por Arr2 y la región variable Fab (Fv) mostrando un rango de resolución de hasta 4,5 Å (Fig. 2a e Información suplementaria, Figs. S1, S2). Sin embargo, la heterogeneidad conformacional entre NTSR1 y Arr2 sigue presente como se ilustra en el análisis multicuerpo (Información suplementaria, Fig. S3), a pesar de que se utilizó una fracción muy baja del conjunto de datos completo en la reconstrucción final.

A pesar de su moderada resolución, el mapa EM permitió determinar claramente la posición y orientación de NTSR1, Arr2 y Fab30 en el ensamblaje del complejo (Fig. 2). El modelo del complejo se construyó acoplando la estructura cristalina del complejo NTSR1-NTS (PDB: 4GRV),14 y la estructura de Arr2 unida al péptido C-terminal de la vasopresina fosforilada (V2Rpp) y a Fab30 (PDB: 4JQI)23 en el mapa de densidad, seguido de un ajuste manual del modelo, un refinamiento en el espacio real y ciclos iterativos de refinamiento Rosetta y reconstrucción del modelo contra el mapa EM.25 El modelo final del complejo contiene residuos de NTSR1 desde R49 hasta T416, de los cuales faltan ICL3 (A270 a P292) y la región de enlace entre la hélice 8 y la cola C-terminal (P384 a S404). El modelo de Arr2 incluye los residuos T6 a M352 y el modelo de Fab30 contiene un total de 409 residuos que comprenden tanto la cadena ligera como la cadena pesada del Fab. El BRIL fusionado N-terminal y la pequeña molécula ML314 no son visibles en el mapa de densidad y, por tanto, no se incluyen en el modelo del complejo. Las estadísticas y la geometría del modelo estructural se resumen en la información suplementaria, Tabla S1.

La estructura global del complejo Arr2-NTSR1

El complejo Arr2-NTSR1 está formado por un ensamblaje asimétrico de los dos componentes con el eje horizontal de Arr2 intersectando la superficie interna de la membrana celular a unos 20°, lo que resulta en la interacción de los bucles hidrofóbicos del borde C (L191 y M192, y L334 a L338) de la arrestina con la membrana celular (Fig. 2a, b). Esto concuerda con la estructura cristalina del complejo visual arrestina-rodopsina, que por primera vez mostraba el ensamblaje asimétrico arrestina-GPCR y confirmaba la función de los bucles hidrofóbicos del borde C de la arrestina como un anclaje de membrana que estabiliza la unión de la arrestina con el receptor embebido en la membrana, lo que posteriormente se confirmó experimentalmente.7,26,27 La interacción de los bucles hidrofóbicos del borde C de la Arr2 con la capa de la membrana celular sugiere que la capacidad de unión a lípidos es una propiedad general de los miembros de la familia de la arrestina.

A pesar de la similitud en el ensamblaje asimétrico del complejo Arr2-NTSR1 con el del complejo Arr1-rodopsina, la orientación relativa de la arrestina al receptor es dramáticamente diferente entre estos dos complejos arrestina-receptor. La superposición de los TMDs del receptor de estos dos complejos revela que la orientación de Arr2 está girada 90° alrededor del eje transmembrana con respecto a la arrestina visual (Fig. 2c). En esta nueva orientación, las posiciones de ICL3 y tanto el TM5 como el TM6 del receptor apuntan hacia el dominio N-terminal de Arr2, haciendo posible que ICL3 se asemeje a la cola C-terminal para interactuar con el dominio N de Arr2 (Fig. 2b).

Para evaluar la estabilidad conformacional del ensamblaje del complejo, realizamos seis simulaciones dinámicas moleculares independientes, de dos microsegundos de duración, del complejo Arr2-NTSR1 sin el estabilizador Fab30. A lo largo de la simulación, el bucle del borde C L334 a L338 permaneció en asociación con los lípidos de la membrana y la cola C-terminal de NTSR1 permaneció en interacción con el dominio N-terminal de Arr2 (Información suplementaria, Figs. S4 y S5). Sin embargo, la estructura del núcleo de la arrestina puede rotar alrededor de la estructura crio-EM hasta un punto limitado, y el bucle de dedo extendido puede desengancharse del núcleo TMD de NTSR1 (Información suplementaria, Fig. S5). Estos datos de simulación sugieren que el bucle de dedo, así como la interfaz del núcleo entre Arr2 y el receptor, son altamente dinámicos y que el ensamblaje del complejo Arr2-NTSR1 capturado por la estructura crio-EM probablemente representa uno de los muchos estados conformacionales, lo cual es coherente con el hecho de que la heterogeneidad conformacional del ensamblaje del complejo Arr2-NTSR1 sigue existiendo en las partículas de la clase 3D utilizada en la reconstrucción final crio-EM (Información suplementaria, Fig. S3).

La interfaz del núcleo de Arr2-NTSR1

El complejo Arr2-NTSR1 se ensambla a través de interacciones intermoleculares que consisten en dos interfaces principales separadas: una interfaz del núcleo que consiste en dos parches separados entre los bucles de la cresta central de la arrestina y el lado intracelular del TMD del receptor, y una interfaz de la cola entre el dominio N-terminal de Arr2 y la cola C-terminal del receptor (Fig. 2b). Una parte de la interfaz del núcleo entre Arr2 y NTSR1 es el bucle de dedo (de E66 a L71) de la arrestina, que se inserta en la cavidad intracelular del TMD del receptor y está rodeado por ICL1, ICL2, TM5 y 6, del receptor (Fig. 3a). En esta configuración, la superficie superior del bucle de dedo forma una interfaz directa con el giro entre el TM7 y la hélice 8 del receptor (Fig. 3a).

Para validar la interfaz de la estructura del complejo, realizamos experimentos de entrecruzamiento de disulfuros en células. En este conjunto de experimentos, se introdujeron residuos de cisteína específicos del lugar en la interfaz de Arr2 y NTSR1. Ambas proteínas con mutaciones de cisteína se coexpresaron en células como proteínas separadas. Los productos de entrecruzamiento se formaron tratando las células con un reactivo oxidante y se monitorizaron mediante SDS-PAGE seguido de western blotting para detectar la etiqueta Flag que se fusionó al C-terminal de Arr2. El mismo método se ha utilizado para validar la interfaz visual del complejo arrestina-rodopsina.7,9 Se realizaron reacciones de entrecruzamiento de un total de 177 pares de residuos, entre los cuales observamos fuertes señales de entrecruzamiento entre los residuos D67 y L68 de Arr2 en la región central del bucle de dedo, con los residuos V367 a N370 de NTSR1 situados en el giro entre TM7 y la hélice 8 (Fig. 3b, y las posiciones de esos residuos de la interfaz se presentan como esferas en la Fig. 3a). A modo de comparación, el residuo L71 en el extremo C-terminal del bucle de dedo no mostró ninguna señal de entrecruzamiento o una muy débil con esos residuos de NTSR1 (Fig. 3a, b). También se encontró que varios residuos del bucle de dedo se entrecruzaban con residuos en ICL1 (Q98) y TM6 (R294 y A297), que son componentes de la cavidad intracelular del TMD del receptor (información suplementaria, Fig. S6). Estos datos de reticulación validaron el parche de interfaz entre el bucle de dedo de Arr2 y el receptor y mostraron que el bucle de dedo de la arrestina sirve como componente clave de la interfaz central de este complejo Arr2-GPCR.

Las secuencias de aminoácidos del bucle de dedo de Arr2 están enriquecidas con residuos ácidos, similares a los de la arrestina visual (Fig. 3c), que se sabe que se une a la cavidad TMD cargada positivamente.7 Cuando se superponen NTSR1 y rodopsina, el bucle de dedo de Arr2 ocupa el mismo espacio que la región correspondiente de la arrestina visual, pero no se inserta tan profundamente en la cavidad de la TMD como la arrestina visual (Fig. 3d), lo que indica que la asociación del bucle de dedo de Arr2 con la cavidad intracelular de la TMD de NTSR1 podría ser más dinámica que la de la arrestina visual y la rodopsina.

El otro parche de la interfaz central entre Arr2 y NTSR1 es la interacción de las regiones de la cresta de Arr2 con ICL1 e ICL2 del receptor, que es diferente a la del complejo arrestina visual-rodopsina. En contraste con las orientaciones similares de los bucles de los dedos de las dos arrestinas, la superposición de los dos receptores dejó las estructuras del núcleo de las arrestinas en dos orientaciones que difieren en un ángulo de aproximadamente 90°, como se muestra en la Fig. 2c. Las diferentes orientaciones de las estructuras del núcleo de las arrestinas Arr2 y visual en sus complejos GPCR resultan en diferentes modos de unión de las regiones de la cresta de las arrestinas con los bucles intracelulares de los receptores, particularmente ICL1 e ICL2, en estos dos complejos arrestina-GPCR (Figs. 2c y 4).

La comparación estructural de NTSR1 y rodopsina revela que comparten una conformación conservada del TMD con su ICL1 adoptando un bucle extendido y el ICL2 formando una hélice corta en sus respectivos complejos unidos a la arrestina. La hélice ICL2 de la rodopsina se inserta en la hendidura formada por el bucle central, el bucle inferior y el bucle lariat de la arrestina visual (denominada hendidura MBL).7 Sin embargo, la misma hendidura MBL en Arr2 está ocupada por la ICL1 de NTSR1 (Fig. 4a) debido a la diferente orientación de la arrestina. En consecuencia, el ICL2 de NTSR1 se aleja de la hendidura MBL para reposicionarse en la parte superior del bucle lárico (Fig. 4a). Los experimentos de entrecruzamiento de disulfuro mostraron señales de entrecruzamiento entre los residuos receptores L94 a S96 en ICL1 de NTSR1 y el residuo G286 en el bucle inferior de Arr2, lo que es consistente con la interfaz de ICL1 de NTSR1 con esta región de cresta de Arr2 (Fig. 4b).

ICL3 del receptor, a pesar de ser invisible en el mapa de densidad, probablemente forma una interfaz con el dominio N de la β-arrestina basándose en la conformación del complejo Arr2-NTSR1 (Fig. 2b). Los datos de entrecruzamiento de disulfuro mostraron que los residuos de ICL3 Q275, C277, T278 y V279 de NTSR1 se entrecruzaron con los residuos T56, T58, V81 y N83 en la superficie superior del dominio N de Arr2 (Fig. 4c e información suplementaria, Fig. S6). Estos residuos de ICL3 también mostraron fuertes señales de entrecruzamiento con el residuo K160 de Arr2 (Fig. 4d). Se observaron señales adicionales de entrecruzamiento de disulfuros entre la mayoría de los residuos de Q273 a G280 del ICL3 de NTSR1 y el residuo P14 de Arr2 (Fig. 4d). Estos datos de entrecruzamiento indican que el ICL3 del receptor está posicionado cerca del dominio N y puede interactuar con residuos en la superficie del dominio N de Arr2 (Fig. 4e).

La interfaz de la cola de Arr2-NTSR1

Mientras que la interfaz del núcleo de Arr2-NTSR1 es altamente dinámica, la interfaz de la cola entre la cola C-terminal de NTSR1 y el dominio N de Arr2 parece similar a la del complejo visual arrestina-rodopsina9 (Fig. 5). Observamos la densidad electrónica a un nivel de contorno de 0,016 (en el que la densidad de la estructura global del complejo puede mostrarse adecuadamente) de unos diez residuos de la cola C-terminal de NTSR1 que se unen a la primera cadena β de Arr2 (Fig. 5a). Sin embargo, la información detallada sobre esta región de la cola C-terminal, incluyendo sus residuos específicos, es difícil de identificar debido a la limitada resolución del mapa de densidad. Los análisis de la proteína de fusión NTSR1-Arr2-Fab30 mediante espectrometría de masas (Fig. 5b e información suplementaria, Fig. S7) revelaron que siete residuos de serina o treonina desde S401 hasta T416 en la cola C-terminal de NTSR1 estaban fosforilados, lo que sugiere una posible implicación de esta región en la unión a la superficie cargada positivamente del dominio N de la arrestina. Los experimentos de entrecruzamiento de disulfuro mostraron que el residuo P14 de Arr2 en el giro C-terminal de la primera cadena β se entrecruzaba fuertemente con los residuos H406 a S410 del receptor (Fig. 5d e información suplementaria, Fig. S6), lo que indicaba que los residuos C-terminales del receptor a H406 son probablemente la región que se une al dominio N de la arrestina (Fig. 5c).

Un modelo para la interacción Arr3-GPCR

El genoma humano contiene dos subtipos de β-arrestina: Arr2 y Arr3, que comparten más del 53% de identidad de secuencia pero tienen tanto algunas funciones que se solapan como otras divergentes. Como Arr3 mostró una afinidad de unión a NTSR1 similar a la de Arr2 (Fig. 1b), quisimos comprobar si el modo de unión de Arr3 a NTSR1 se conserva con el de Arr2. Nuestros experimentos de entrecruzamiento de disulfuros mostraron que los residuos E67 a L72 del bucle de dedo de Arr3 (correspondientes a E66 a L71 de Arr2) se entrecruzaban con el conjunto correspondiente de residuos (A369 y N370) en el giro entre TM7 y la hélice 8 de NTSR1 (Información suplementaria, Fig. S8), lo que indica una interfaz conservada del bucle de dedo con TM7 y H8 del receptor entre estas dos β-arrestinas.

Además, los datos de entrecruzamiento de disulfuro mostraron que el residuo P15 de Arr3 (correspondiente a P14 de Arr2) se entrecruzó con los residuos N405 a T407 de la cola C-terminal del receptor, sugiriendo una interfaz de cola similar entre Arr3 y NTSR1 (Información suplementaria, Fig. S8). También se observó un patrón de entrecruzamiento similar entre los residuos ICL3 de NTSR1 y los residuos del dominio N de Arr3, incluyendo P15 en el C-terminal de la primera rama β y K161 (correspondiente a K160 de Arr2) en el bucle entre las ramas β superiores (Información suplementaria, Fig. S8). En conjunto, estos datos de reticulación sugieren que el ensamblaje global de Arr3 con NTSR1 es similar al de Arr2 con NTSR1 en esta configuración comprometida con el núcleo.

Un modelo para el reclutamiento de β-arrestinas por 5-HTR1A y 5-HTR1B

Muchos GPCRs, incluyendo los receptores de serotonina 5-HTR1A y 5-HTR1B así como varios receptores de dopamina, carecen o contienen una cola C-terminal muy corta y se ha propuesto que utilicen su ICL3 como una interfaz alternativa para reclutar β-arrestinas.28 Los receptores 5-HTR1A y 1B tienen ICL3s largos con múltiples sitios de fosforilación para una potencial interacción con los dominios N cargados positivamente de las β-arrestinas. Nuestros ensayos de unión bioquímica demostraron que ambos receptores se unían a Arr2 y 3 con una actividad similar a la de NTSR1 con Arr2 (Información suplementaria, Fig. S9). Sin embargo, cuando se utilizó la estructura del complejo visual arrestina-rodopsina como plantilla, fue difícil modelar el modo de unión del ICL3 fosforilado de 5-HTR1A o 1B a la hendidura cargada positivamente en el dominio N de las β-arrestinas. Esto se debe a que los TM5 y 6 así como el ICL3 de la rodopsina están posicionados en el sitio opuesto a la superficie cargada positivamente del dominio N de la arrestina en la estructura del complejo arrestina-rodopsina.

La estructura del complejo Arr2-NTSR1, sin embargo, muestra un ensamblaje complejo distinto con Arr2 rotado 90° desde la posición de la arrestina visual en el complejo arrestina-rodopsina (Fig. 2c). TM5 y TM6 de NTSR1 están, por tanto, posicionados por encima de la superficie frontal del dominio N de Arr2, permitiendo que ICL3 del receptor (no visible en la estructura) alcance el dominio N cargado positivamente de Arr2 (Fig. 4e). Nuestros datos de entrecruzamiento de disulfuros proporcionan pruebas de que el ICL3 de NTSR1 puede interactuar con la hendidura cargada positivamente del dominio N de Arr2 y 3 (Fig. 4c-e, Información suplementaria, Figs. S6 y S8). Por lo tanto, la estructura del complejo Arr2-NTSR1 puede servir como una plantilla adecuada para modelar la interfaz de las β-arrestinas con 5-HTR1A y 5-HTR1B.

Usando la estructura Arr2-NTSR1 como plantilla, y la estructura cristalina de la 5-HTR1B unida a ergotamina como modelo inicial para la 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 generamos un modelo homológico del complejo Arr2-5-HTR1B, en el que la interfaz central entre Arr2 y 5-HTR1B es similar a la del complejo Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, b). A continuación, realizamos experimentos de entrecruzamiento de disulfuros para comprobar el ensamblaje del complejo Arr2-5-HTR1B mostrado en el modelo de homología (Fig. 6c e información suplementaria, Fig. S10).

Observamos señales de entrecruzamiento entre los residuos del bucle de dedo D67 L68, V70 y L71 de Arr2 y los residuos N373, E374 y D375 en el giro entre el TM7 y la hélice 8 de 5-HTR1B (Fig. 6c). Los residuos D67, L68, V70 y L71 del bucle de dedo se entrecruzaron con los residuos R308 y K311 del receptor en la superficie interna del TM6 (información suplementaria, Fig. S10). Estos datos de entrecruzamiento apoyan un modo de unión conservado del bucle de dedo Arr2 con la cavidad intracelular del dominio TM de 5-HTR1B (Fig. 6a, b). Los datos de entrecruzamiento de disulfuro también mostraron señales de entrecruzamiento entre los residuos R285 y G286 de Arr2 en el bucle inferior de la arrestina con el residuo K79 de ICL1 de 5-HTR1B (Fig. 6c e información suplementaria, Fig. S10). Este entrecruzamiento específico sólo es consistente con la orientación de la arrestina en el modelo Arr2-NTSR1, pero no es compatible con el complejo visual arrestina-rodopsina. En conjunto, estos datos de entrecruzamiento apoyaron una interfaz central entre la región de la cresta de Arr2 y el lado intracelular del dominio TM de 5-HTR1B, que se conserva con el del complejo Arr2-NTSR1 (Fig. 6a-c).

5-HTR1B contiene múltiples residuos de serina y treonina en la zona central de su largo ICL3 que pueden ser fosforilados para unirse a la superficie del dominio N de la arrestina cargado positivamente (Fig. 6d). Diseñamos mutaciones de pares de cisteínas en la interfaz potencial entre ICL3 del receptor y el dominio N de Arr2 y descubrimos que los residuos T268, S295, L298 y E300 de ICL3 se entrecruzaban con los residuos de la superficie de la hoja β superior, incluyendo T56, V81, N83, K147 y K157 de Arr2 (Fig. 6e e información suplementaria, Fig. S10). Los residuos S260 y T268 de ICL3 mostraron señales de entrecruzamiento con los residuos K11 de la primera cadena β y N15 del giro que sigue a la primera cadena β de Arr2 (Fig. 6e e información suplementaria, Fig. S10). El residuo S260 está cerca del extremo C-terminal de TM5, y su entrecruzamiento con K11 en el lado cargado positivamente del dominio N de Arr2 sólo es posible en la orientación Arr2-NTSR1 pero no en la orientación arrestina visual-rodopsina porque en la estructura del complejo arrestina visual-rodopsina, tanto TM5 como 6 del receptor están posicionados en el sitio posterior de la superficie cargada positivamente del dominio N de arrestina.

También observamos un patrón de entrecruzamiento Arr2 casi idéntico entre 5HTR1A y 5-HTR1B. Se observaron señales de entrecruzamiento entre los residuos del bucle de dedo D67, L68, V70 y L71 de Arr2 y los residuos N404, K405 y D406 (correspondientes a N373, E374 y D375 de 5-HTR1B) en el giro entre el TM7 y la hélice 8 de 5-HTR1A (Información suplementaria, Fig. S11). Los residuos D67 y L68 del bucle de dedo también se entrecruzaron con los residuos del receptor R339 y K342 (correspondientes a R308 y K311 de 5-HTR1B) en la superficie interna del TM6 (Información suplementaria, Fig. S11). Además, observamos el entrecruzamiento de disulfuros entre los residuos R285 y G286 del bucle inferior de Arr2 y el residuo L67 de ICL1 de 5-HTR1A (correspondiente a K79 de 5-HTR1B) (Información suplementaria, Fig. S11). Estos datos de entrecruzamiento apoyan una interfaz central similar entre Arr2 con 5-HTR1A y 5-HTR1B, que se conserva con la del complejo Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, c).

El ICL3 de 5-HTR1A contiene más de 100 residuos de aminoácidos (233 a 336) con 12 residuos de serina o treonina que constituyen seis códigos parciales de fosforilación junto con residuos de ácido glutámico o ácido aspártico (Información suplementaria, Fig. S12). Diseñamos mutaciones de pares de cisteínas para mapear la posible interfaz entre ICL3 de este receptor y el dominio N de Arr2. Los datos de entrecruzamiento mostraron que los residuos V230, T240, P250, R261, K270 y D285 de ICL3 se entrecruzaban con V81 y K160 en el dominio N de Arr2 (Información suplementaria, Fig. S11). El residuo P14 de la primera cadena β de Arr2 se entrecruzó fuertemente con los residuos N300, P308, P315, P318, P321 y R323 de 5-HTR1A (Información suplementaria, Fig. S11).Estos datos de entrecruzamiento, junto con el modelo de homología del complejo Arr2-5-HTR1B, han proporcionado una imagen general de cómo 5-HTR1A y 5-HTR1B reclutan a Arr2.

En este trabajo, informamos de una estructura de Arr2 en complejo con NTSR1, un GPCR de clase A, mediante un análisis crio-EM de partícula única. Aunque el modo de unión de la interfaz de la cola entre la cola C-terminal del receptor y el dominio N de la arrestina cargado positivamente se conserva con el del complejo arrestina-rodopsina visual, esta estructura muestra una orientación de Arr2 diferente a la observada en el complejo arrestina-rodopsina visual. El modelado de homología y el mapeo de la interfaz de reticulación de disulfuros demuestran que esta interfaz central se conserva en los complejos Arr2 con la subfamilia 5-HTR1A y 1B. En estos modelos de complejos, la orientación de Arr2 permite que el ICL3 del receptor alcance la superficie del dominio N de Arr2, proporcionando la posibilidad de que un GPCR que carece de cola C-terminal utilice su ICL3 para interactuar con el dominio N de la arrestina. Como Arr2 y Arr3 son socios proteicos de expresión ubicua para la transducción de señales de muchos GPCRs no visuales, nuestros estudios estructurales y bioquímicos de la interacción de Arr2 con miembros de la subfamilia NTSR1 y 5-HTR1 han proporcionado un modelo alternativo para entender la interacción de Arr2 y Arr3 con GPCRs no visuales.