Una tira de flujo lateral basada en nanopartículas de oro para detectar 6-monoacetilmorfina en fluido oral

Introducción

El abuso de opioides ha aumentado drásticamente en los últimos años y es una causa importante de morbilidad y mortalidad. Según el Informe Mundial sobre las Drogas 2017 publicado por la Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito, el consumo de opiáceos y opioides de venta con receta puede no estar tan extendido como el del cannabis, pero los opioides siguen siendo drogas importantes con posibles daños y consecuencias para la salud . Por lo tanto, la detección fácil y rápida de los opioides es una necesidad urgente.

El consumo ilícito de heroína es una de las formas más comunes de adicción a los opioides. La heroína (diacetilmorfina, diamorfina o Diagesil®) es un derivado semisintético de la morfina y un potente analgésico opioide. El metabolismo de la heroína se visualiza en la figura 1 . La heroína se hidroliza rápidamente en 6-monoacetilmorfina (6-MAM) y finalmente en morfina. Como la heroína se hidroliza rápidamente tras su administración, sus metabolitos suelen emplearse para confirmar el consumo. Además, la 6-MAM es el único indicador específico del consumo reciente de heroína frente a la morfina, y ha despertado un gran interés en la comunidad investigadora.

Se han descrito varios métodos para detectar la 6-MAM, que pueden dividirse en las siguientes categorías: (1) análisis cromatográfico, incluyendo la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alto rendimiento ; (2) análisis espectroscópico, como la espectroscopia Ramen, la espectroscopia infrarroja, la quimioluminiscencia , etc.; (3) electroforesis capilar ; y (4) métodos de inmunoensayo (antígeno-anticuerpo) . Las complejas técnicas de instrumentación suponen una enorme presión para el cribado básico de medicamentos, debido a la necesidad de contar con equipos sofisticados y operadores profesionales. En ocasiones, el laboratorio está cerrado o alejado. Ni siquiera las comisarías de policía pueden albergar estos complejos y costosos equipos. Sin embargo, un agente de policía tiene que juzgar inmediatamente si un material sospechoso contiene heroína o no y necesita reaccionar rápidamente. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de métodos específicos, fiables y sencillos para detectar drogas ilícitas en muestras biológicas.

De los métodos para la detección rápida, las tiras de flujo lateral (LFS) basadas en nanopartículas de oro coloidales (AuNP) han sido ampliamente adoptadas para el cribado rápido debido a la propiedad óptica de las AuNP que depende del tamaño y de la distancia, con el primer informe de Mirkin y colaboradores . El principio de los ensayos semicuantitativos de flujo lateral es que el color rojo de las AuNPs puede verse a simple vista a partir de la combinación antígeno-anticuerpo en varios minutos . Existen varios kits comerciales para la detección del consumo de heroína, como los de las empresas NovaBios y Wondfo. Sin embargo, la mayoría de los kits de detección de heroína sólo miden la morfina pero no la 6-MAM, porque es difícil discriminar entre la 6-MAM y la morfina. La morfina podría ser metabolizada a partir de otras drogas o podría haber sido recetada. La 6-MAM es únicamente rastreable hasta la heroína.

Las muestras incluyen sangre, plasma, orina, pelo, fluidos orales, así como en el aliento, el sudor, la leche materna, los dientes, etc. . Las muestras más comunes utilizadas para el análisis de la heroína ilícita son la sangre, la orina y los fluidos orales. De ellas, el análisis de sangre es el más preciso y fiable, pero también es invasivo. El análisis de orina es el más cómodo y el más utilizado en la detección de drogas de abuso. Los fluidos orales se utilizan cada vez más para las pruebas en los puntos de atención, ya que son fáciles de recoger en público. Sin embargo, los fluidos orales son muy viscosos y tienen bajas concentraciones de objetivo; por lo tanto, la mayoría de las pruebas utilizan la orina para las pruebas de 6-MAM. Todos los desarrollos de pruebas de fluidos orales se enfrentarán al mismo problema para la recogida de muestras y la mejora de la sensibilidad. Un estudio anterior demostró que la 6-MAM se detecta con frecuencia en el fluido oral. El estándar de detección de LFS en el fluido oral 6-MAM es de 4 ng ml-1 . Aquí, desarrollamos un ensayo de flujo lateral para la heroína en muestras de fluido oral.

Exploramos AuNPs como etiquetas de anticuerpos en un ensayo de flujo lateral para la detección rápida y sensible de 6-MAM a través de una señal colorimétrica. En primer lugar, sintetizamos la 6-MAM y luego la conjugamos con albúmina de suero bovino (BSA) para poder recubrirla en una línea T. Además, para superar las dificultades en el tratamiento de las muestras de fluidos orales, se eligieron los tipos de membranas de nitrocelulosa (NC), la fórmula de la solución de la almohadilla de la muestra y la almohadilla adsorbente de esponja para buscar las mejores condiciones para las LFS de fluidos orales. Finalmente, se validó la LFS de 6-MAM y se demostró que tenía una sensibilidad y especificidad extraordinarias.

Experimental

2.1. Materiales

Los anticuerpos contra la 6-MAM fueron suministrados por Bioventure (Shanghai). La BSA y la polivinilpirrolidona (PVP) se compraron a Sigma (Barcelona, España). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) y STANDAPOL ES-1 (S7) se adquirieron de BASF (Alemania). El agua destilada (resistividad 18,2 MΩ cm-1) se hizo con un sistema de agua ultra pura RephiLe PURIST UV (China). El sistema de dispersión Reel era de Doyesgo (China). El espectrómetro de masas Vion IMS Q-Tof era de Waters (Estados Unidos). Todos los materiales estándar, como la 6-MAM y la morfina, se obtuvieron de los Institutos Nacionales de Control de Alimentos y Medicamentos (China). El microscopio era de Motic AE2000 (Xiamen, China). Todos los demás reactivos químicos e inmunológicos no especificados aquí eran productos comerciales estándar de grado analítico/reactivo.

2.2. Los componentes de la tira de flujo lateral

Las LFS consisten en un soporte de plástico, una tira adsorbente de esponja (almohadilla de esponja), una almohadilla de muestra, una almohadilla conjugada, membranas NC y una almohadilla absorbente. La tira de esponja adsorbente está especialmente diseñada para la recogida de fluidos orales y transporta rápidamente el fluido oral a la almohadilla de muestra. La almohadilla de muestra contiene un sistema de tampón y algunos tensioactivos. Los conjugados anticuerpo-AuNP se rociaron en la almohadilla de conjugado para que reaccionaran con la muestra y se liberaran de la almohadilla y entraran en la membrana NC recubierta con 6-MAM-BSA en la línea T y anticuerpos de cabra anti-conejo en la línea C. La almohadilla absorbente es un papel de filtro situado en el extremo de la tira; mantiene el flujo capilar. El LFS sólo necesita ser colocado en la boca o insertado en un vaso para muestras de fluidos orales. En la figura 2 se muestra una vista esquemática del LFS. En la figura 3 se muestra un diagrama esquemático del LFS para la detección de 6-MAM.

2.3. Síntesis del conjugado 6-monoacetilmorfina-albúmina de suero bovino

La 6-MAM se preparó como se ha descrito previamente en trabajos de investigación . Brevemente, la morfina se produjo primero por hidrólisis alcalina de la heroína. A continuación, se añadió un grupo éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) a la molécula de 6-MAM para conjugarla con las proteínas portadoras (figura 4). La 6-MAM activada se aseguró con un espectrómetro de masas Waters® Vion IMS Q-Tof. A continuación, se realizó la síntesis tal y como se ha descrito (figura 5) con algunas modificaciones. En primer lugar, se dejaron enfriar 80 mg de BSA en 6 ml de tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH = 7,5) hasta 0°C. A continuación, se añadieron 20 mg de 6-MAM activada en 1 ml de dimetilformamida (DMF) anhidra, gota a gota, a 0°C. La mezcla se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El conjugado 6-MAM-BSA resultante se dializó contra un tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH = 7,5) con seis cambios de tampón (al menos 6 h cada uno a 4°C).

2.4. Preparación de los conjugados nanopartículas de oro-anticuerpo

Las AuNPs de 20 nm se prepararon mediante un método de reducción de citrato . Aquí, se añadieron 2 ml de solución de HAuCl4 al 1% en 100 ml de agua hirviendo con agitación vigorosa, y luego se añadieron inmediatamente 2 ml de solución de citrato de sodio al 1%. Cuando la solución se volvió roja, se hirvió durante otros 15 minutos. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se almacenó a 4°C para su uso posterior.

Después de ajustar el valor del pH de la solución de AuNPs a 9,0 mediante K2CO3 0,1 M, se añadieron 30 µg de anticuerpos 6-MAM en 10 ml de solución de AuNPs y se incubaron durante 30 min. A continuación, se añadieron 20 µl de 100,0 g l-1 de BSA durante 15 minutos para bloquear los sitios reactivos. La solución se centrifugó a 3740g durante 15 min, y el sobrenadante se volvió a centrifugar a 12 100g durante otros 30 min. Todos los precipitados de oro se mezclaron y se midieron para identificar la absorbencia máxima mediante espectroscopia UV-visible. A continuación se almacenó a 4°C para su uso posterior.

Se utilizó el mismo método para conjugar AuNPs con anticuerpos IgG de conejo. Al hacer la almohadilla de conjugación, los conjugados de anticuerpos se diluyeron hasta la absorbancia cinco con tampón (0,05 M Tris-HCl que contenía 10,0 g l-1 de BSA, 0,4% de Triton X-100, 5% de trehalosa, 10% de sacarosa, pH 8,2). Por último, se pulverizaron 500 µl de conjugados mixtos AuNPs-anticuerpo sobre una fibra de vidrio de 20 mm2 y luego se secaron a 37°C durante la noche.

2.5. Preparación de la membrana de nitrocelulosa recubierta

Para hacer la tira de prueba de flujo lateral, se dispensaron antígenos 6-MAM-BSA (0,6 mg ml-1) en las membranas NC como las líneas de prueba (línea T). Las líneas de control (línea C) se recubrieron con anticuerpos policlonales anti-conejo de cabra (0,15 mg ml-1). Las membranas NC recubiertas se secaron a 37°C durante la noche. Se evaluaron nueve membranas NC comerciales de cuatro empresas: Millipore (HF90, HF135 y HF180), GE-Whatman (FF120HP y AE100), Sartorius (CN95 y CN150) y Pall (Vivid90 y Vivid170). Sensibilidad y especificidad

La tira es un ensayo competitivo, y ambas posiciones tenían tiras de 6-MAM. Cuando la muestra contiene 6-MAM, se une al anticuerpo marcado con nanogold en la almohadilla conjugada. El exceso de anticuerpos sigue avanzando a lo largo de la dirección cromatográfica debido a la acción capilar y luego se une al antígeno 6-MAM en la línea T. La intensidad de la señal de la línea T está directamente relacionada con la concentración de 6-MAM en la muestra. Un color más oscuro indica una menor concentración de 6-MAM.

Se recogieron fluidos orales negativos de seis personas y se les añadió 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) para detectar su sensibilidad. Se utilizaron diez drogas de abuso común para verificar la especificidad de los LFS. Estas drogas eran la morfina (MOP, 100 µg ml-1), la codeína (COD, 100 µg ml-1), el tetrahidrocannabinol (THC, 10 µg ml-1), la metilendioximetanfetamina (MDMA, 100 µg ml-1), la ketamina (KET, 100 µg ml-1), metilanfetamina (MET, 100 µg ml-1), cocaína (COC, 100 µg ml-1), metadona (MTD, 100 µg ml-1), efedrina (EPH, 100 µg ml-1) y pseudoefedrina (PEPH, 100 µg ml-1).

Resultados y discusión

3.1. Síntesis del conjugado 6-monoacetilmorfina-albúmina de suero bovino

Las membranas de CN suelen recubrirse primero con una proteína portadora antes de la conjugación del anticuerpo. Los enlazadores se utilizan para mantener la especificidad estructural. Aquí, se añadió primero un grupo éster NHS a la molécula de 6-MAM como enlazador para la proteína portadora. Esto se validó con un espectrómetro de masas Waters® Vion IMS Q-Tof. Encontramos un pico amplio en los cromatogramas de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) de la 6-MAM activada a los 8,8 minutos con un m/z de 706,27645 (figura 6) frente a un m/z predicho de 706,2758. Esto indica que el enlazador se unió con éxito a la 6-MAM. La importancia de una síntesis precisa es evidente, ya que sólo se establece correctamente la estructura, lo que podría conducir al emparejamiento con anticuerpos de 6-MAM.

No utilizamos diálisis de gradiente de dimetilsulfóxido porque el producto es soluble y el protocolo de conjugación anterior es demasiado complejo. La BSA tenía varios picos en el cromatograma de UPLC (datos no mostrados) debido a los diversos análogos. Esto condujo a una gama de relaciones de conjugación. Por lo tanto, había varios picos en el cromatograma de UPLC correspondientes a las diferentes relaciones de conjugación. Los resultados de la conjugación podían confirmarse más eficazmente mediante el emparejamiento antígeno-anticuerpo que la relación de conjugación.

3.2. Tipos de selección de membranas de nitrocelulosa

Las membranas de NC se unen a las proteínas electrostáticamente a través de las interacciones del dipolo fuerte del éster de nitrato con el dipolo fuerte de los enlaces peptídicos de la proteína. Se evaluaron las propiedades, como la velocidad de flujo capilar, la intensidad de la señal y el fondo, ya que podrían influir en el rendimiento final del LFS. Además, se presta más atención a la velocidad de flujo porque podría afectar a la capacidad de adsorción de la proteína e incluso a la sensibilidad. La velocidad de flujo de una membrana depende de las propiedades agregadas de las estructuras porosas, como el tamaño de los poros, la distribución del tamaño de los poros y la porosidad. Un tamaño de poro más grande conduce a una adsorción de proteínas más débil.

Comparamos nueve membranas NC (tabla 1). Cada prueba se repitió tres veces y se registró el resultado medio. Los resultados de la LFS se midieron en 3 min, y la mejor velocidad de flujo de la muestra fue inferior a 20 s cm-1. También era necesario que la intensidad de la señal en la línea T estuviera en el nivel normal. Un color de fondo más intenso dificultaba la precisión. La membrana Millipore HF135 fue la mejor elección para la 6-MAM después de considerar exhaustivamente la tasa de flujo de la muestra, la intensidad de la señal en la línea T y el color de fondo.

3.3. La almohadilla de la muestra

La solución para el tratamiento de la almohadilla de la muestra es muy importante para la prueba porque sirvió como sistema de tampón de reacción cuando las muestras de fluidos orales rehidrataron la almohadilla. La solución suele incluir un sistema tampón con una fuerza iónica y un valor de pH adecuados; algunos materiales de bloqueo y tensioactivos pueden acelerar la velocidad de flujo del fluido oral en la membrana. La almohadilla para muestras se encarga de las complejidades de los efectos de la matriz del fluido oral y la hace compatible con la membrana del CN. Además, el sistema tampón asegura la liberación de analitos y estabiliza la tasa de flujo porque el fluido oral es demasiado viscoso.

Se consideraron cuatro fórmulas diferentes. Las fórmulas de las soluciones se indican en la tabla 2. Los resultados indicaron que el sistema tampón 4 con el surfactante STANDAPOL ES-1 (S7) dio el mejor rendimiento a un caudal de muestra de 17 s cm-1, con una intensidad de señal normal y un fondo blanco. El tensioactivo S7 es un tensioactivo aniónico fuerte que ofrece una mayor capacidad de lavado que S17 y S9.

3.4. Recogida de fluidos orales

Los fluidos orales son más difíciles de recoger que la orina debido a su alta viscosidad. Hay muchos tipos de dispositivos de recogida de fluidos orales: bastoncillos de algodón, esponjas, tubos de plástico y vasos. Algunos métodos estimulan los fluidos orales mediante vinagre, enjuagues bucales, pastillas, etc. Sin embargo, esta estimulación puede cambiar la concentración de analitos en el fluido oral y es más complicada y requiere más tiempo. Finalmente, recogimos el fluido oral directamente de la boca mediante un adsorbente de esponja (ESSENTRA, Reino Unido), que es una mezcla de fibras poliméricas con un tamaño de poro adecuado.

Se diseñaron a medida dos tipos de adsorbentes de esponja (K1 y K2), y las estructuras de ambas almohadillas de esponja se muestran en la figura 7. La K2 era mucho más suelta y regular que la K1. Ambas se evaluaron probando el rendimiento del manejo de fluidos, incluyendo la caída de agua en la almohadilla de esponja, la introducción de la LFS final en el tampón de fosfato de potasio negativo (pH = 7,0) y la introducción de la LFS final en la boca. La esponja K2 tenía una velocidad de flujo de muestra dos veces más rápida (media de 20 s cm-1) que la esponja K1 para el agua, el tampón PBS o los fluidos orales reales. Esta es una cuestión muy importante para las pruebas de fluidos orales. En conclusión, se eligió la K2 por su distinguido rendimiento en el tratamiento de muestras de fluidos orales.

3.5. Sensibilidad y especificidad

Las moléculas pequeñas suelen detectarse mediante un ensayo competitivo en los LFS. Aquí, no hay señal (línea roja) en la línea T. Esto representa una concentración de 6-MAM en la muestra que está por encima del valor de corte. La sensibilidad de las pruebas de fluidos orales debería ser mucho mayor que la de las pruebas de orina debido a la baja concentración de metabolitos de drogas en los fluidos orales. En este caso, realizamos con éxito una LFS cualitativa para 6-MAM con una sensibilidad de 4 ng ml-1, que cumple con los requisitos para los límites de detección generales de fluidos orales . Los resultados se muestran en la figura 8. Además, la figura 9 muestra la especificidad frente a las drogas de uso común. El LFS de 6-MAM fue específico para 6-MAM sin reacción cruzada especialmente con morfina o codeína.

Conclusión

La 6-MAM es el metabolito específico de la heroína. Informamos aquí de un LFA para 6-MAM a través de un conjugado especial emparejado con un anticuerpo específico. Hicimos un conjugado que unía la 6-MAM a la proteína portadora a través de un grupo éster NHS en la posición C3 (figura 10). Aquí, el anticuerpo identificó el grupo acetilo de la 6-MAM. Este es un requisito previo para la especificidad de la 6-MAM. Por último, realizamos una prueba LFS muy sensible sin reacción cruzada con 10 drogas de uso común, incluyendo la morfina y la codeína. Identificamos las membranas NC adecuadas, la almohadilla de la muestra, el tamaño del poro y la esponja adsorbente para hacer una prueba que utiliza fluidos orales en el punto de atención.

Con las ventajas mencionadas, el LFS de 6-MAM para la muestra de fluidos orales podría aplicarse tanto a la investigación como a los usos industriales. Podría ayudar a la policía a ahorrar mano de obra y tiempo/costes en el cribado preliminar. Los fluidos orales son convenientes y menos invasivos y son adecuados para el cribado de tráfico. En conclusión, un fluido oral LFS para el abuso de heroína dirigido a la 6-MAM es un producto prometedor para combatir la conducción bajo los efectos de las drogas.

Etica

El uso de las muestras de heroína para la investigación fue supervisado por el Tercer Instituto de Investigación del Ministerio de Seguridad Pública de China. Todos los autores declaran que cumplen las normas éticas.

Accesibilidad de los datos

Los datos están depositados en el repositorio digital Dryad: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Contribuciones de los autores

L.Z. concibió este estudio, y X.H y J.Z. ayudaron a realizar los experimentos de las figuras 4 y 5. F.C. e Y.Z. realizaron los estudios de la figura 6. J.L. analizó los datos y escribió el artículo. Todos los autores dieron su aprobación final para la publicación.

Intereses en competencia

Declaramos que no tenemos intereses en competencia.

Financiación

No se ha recibido financiación para este artículo.

Descargo de responsabilidad

Todas las opiniones, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas aquí son de los autores.

Notas a pie de página

Este artículo ha sido editado por la Royal Society of Chemistry, incluyendo el encargo, el proceso de revisión por pares y los aspectos editoriales hasta el punto de aceptación.