Validación de anticuerpos

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No todos los anticuerpos son válidos para todos los experimentos y condiciones, deben ser validados para la aplicación y la especie específicas. En la actualidad, no existe un medio estándar de «validación de anticuerpos», lo que puede afectar en gran medida a la reproducibilidad y fiabilidad de los experimentos. Las revistas y los organismos que conceden subvenciones han tomado medidas para subsanar esta carencia. Muchas de ellas exigen ahora que se indique explícitamente cómo se va a validar un anticuerpo para un uso específico. Por desgracia, no existen criterios universalmente aceptados para la validación de anticuerpos. Por lo tanto, depende de cada investigador validar todos y cada uno de los anticuerpos para la aplicación prevista.

Validación básica

Los métodos estándar de validación de anticuerpos incluyen western blot, ELISA, citometría de flujo e IHC. La mayoría de los investigadores se sienten cómodos con estos métodos de eficacia probada. El proceso de validación puede llevar mucho tiempo porque el investigador o el fabricante deben validar el anticuerpo para cada aplicación. Esta dificultad se agrava porque las condiciones de cada ensayo son diferentes. Por ejemplo, un western blot depende de la desnaturalización de las proteínas. Por lo tanto, un anticuerpo validado para western blot puede funcionar bien en condiciones de desnaturalización, pero puede no reconocer los antígenos en su conformación nativa (es decir, ELISA).1 Del mismo modo, un anticuerpo validado para la afinidad con la proteína nativa podría no unirse al mismo antígeno después de la desnaturalización o la fijación.

Los métodos anteriores desempeñan un papel necesario en la validación de anticuerpos. Sin embargo, no podemos confiar únicamente en estos métodos, ya que no representan las aplicaciones en constante expansión. El nivel de confianza de los anticuerpos validados puede aumentarse incluyendo otras técnicas de validación.

Técnicas antiguas, usos nuevos

Para abordar las deficiencias de la validación básica de anticuerpos, un grupo de científicos se reunió recientemente para «proponer un conjunto de directrices estándar para la validación de anticuerpos».2 Sugieren que, además de los métodos básicos de validación de anticuerpos, los investigadores comiencen a apoyarse en pilares conceptuales. Entre ellos se encuentran las estrategias genéticas, las estrategias de anticuerpos independientes y la expresión de proteínas marcadas.2

• Estrategias genéticas: CRISPR-Cas9 y más

  Las estrategias genéticas consisten en técnicas comoCRISPR-Cas9, RNAi y siRNA knockdown, utilizadas junto con un ensayo de detección de proteínas. Estos métodos detectan cualquier unión no específica por parte del anticuerpo en cuestión después de eliminar o reducir el gen apropiado. Si el anticuerpo es específico, entonces no debería detectarse ninguna señal del anticuerpo o una señal reducida en las líneas celulares eliminadas o reducidas, respectivamente.

• Enfoque de anticuerpos independientes

  El uso de anticuerpos independientes es otro método que podría detectar la unión no específica. El enfoque de anticuerpos independientes emplea dos anticuerpos diferentes (independientes) que se unen al mismo antígeno pero a diferentes epítopos. Por lo tanto, los dos anticuerpos deberían mostrar el mismo patrón de detección y ninguna unión no específica.2 Esta técnica requiere múltiples muestras para las pruebas a fin de controlar la expresión variable de la proteína diana, lo que podría resultar caro y llevar mucho tiempo.2 Además, la técnica de validación depende de la disponibilidad de múltiples anticuerpos que reconozcan diferentes epítopos en la misma proteína diana. GenScript ofrece servicios de binning de epítopos enMonoExpress™ mAb que incluyen «anticuerpos independientes» para antígenos proteicos.

• Expresión de proteínas marcadas

  El análisis de la detección de proteínas diana marcadas también puede proporcionar una forma de medir la unión no específica de los anticuerpos. En este método, las proteínas diana se modifican con una etiqueta de afinidad (es decir, FLAG) o una proteína fluorescente (es decir, GFP). A continuación, de forma similar al método de anticuerpos independientes, se compara el patrón de detección del anticuerpo que se está validando con el del anticuerpo específico de la etiqueta. Aunque es sencillo, uno de los problemas de este método es garantizar que las proteínas marcadas se expresen a niveles endógenos, ya que «la sobreexpresión podría enmascarar la detección de eventos de unión fuera del objetivo».2

  ¿Anticuerpos recombinantes como alternativa a los anticuerpos monoclonales?

  Una reciente llamada de atención sobre la validación de anticuerpos sugirió que los investigadores utilizaran únicamente anticuerpos recombinantes, en lugar de anticuerpos policlonales o incluso monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen utilizando líneas celulares de hibridoma. Desgraciadamente, las líneas celulares de hibridoma pueden morir, perder sus genes codificadores de anticuerpos o no crecer cuando se sacan de su almacenamiento congelado.3 Además, los anticuerpos monoclonales producidos por hibridoma podrían unirse a más de una diana. Por lo tanto, determinar la secuencia del anticuerpo codificado por el hibridoma y producir el anticuerpo recombinantemente supera estos problemas. Además, debido a la secuencia definida, los anticuerpos recombinantes pueden proporcionar otra capa de validación en comparación con el uso de las técnicas anteriores solamente.3

  Estos métodos de validación adicionales proponen «proporcionar pruebas de que un anticuerpo se une a su diana y, en la mayoría de los casos, también deberían permitir la evaluación de la posible reactividad cruzada en las condiciones probadas».2 Sin embargo, es probable que las estrategias antiguas y nuevas deban realizarse en combinación para validar adecuadamente el anticuerpo.

Elegir el método de validación de anticuerpos apropiado

Con todas estas cuestiones que rodean a los anticuerpos, ¿cómo se elige el método apropiado?

En primer lugar, hay que decidir en qué ensayo se va a utilizar el anticuerpo. Por ejemplo, el método CRISPR-Cas9 no implica la modificación de la proteína objetivo y valida que el anticuerpo carece de reactividad cruzada con otras proteínas. Por lo tanto, puede utilizar esta técnica para validar anticuerpos para una amplia variedad de ensayos, incluyendo western blot, IHC, inmunocitoquímica (ICC), citometría de flujo, ELISA, inmunoprecipitación (IP), inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y ensayos de proteínas en fase inversa.2 Sin embargo, debido a las dificultades de expresar una proteína modificada, la validación de un anticuerpo utilizando la expresión de la proteína marcada se sugiere sólo para western blots, IHC, ICC y citometría de flujo.

En segundo lugar, el investigador debe ser consciente de las limitaciones de la muestra de tales métodos de validación. Como ejemplo, tanto las técnicas CRISPR-Cas9/KO como las de expresión de proteínas marcadas no pueden utilizarse para validar anticuerpos en muestras de tejidos humanos y fluidos corporales, como el plasma y el suero.2 Esto se debe a que no se puede realizar una manipulación genética en humanos, a diferencia de lo que ocurre con las líneas celulares.

Por último, independientemente del anticuerpo y del método de validación respectivo utilizado por el proveedor de anticuerpos, el investigador debe realizar al menos una estrategia de validación en su aplicación o contexto de muestra particular.2

La validación de cada anticuerpo para su aplicación y especie específicas es clave para lograr resultados reproducibles y fiables. La información le ayudará a guiar su decisión en cuanto a los métodos apropiados a utilizar en su laboratorio. Para obtener más ayuda con la validación de anticuerpos u otras aplicaciones, visiteGenScript Antibody Technical Resources.

Adaptado del contenido creado por BitesizeBio en nombre de GenScript.