A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: Combining in situ Congo Red Staining and Immunohistochemistry

Abstract

Amyloidoosi on erilaisten, eri tavoin lähestyttävien sairauksien seurausta. Amyloidiesiintymien alatyypittäminen on elintärkeää, jotta perussairaus voidaan todeta ja lopulta hoitaa asianmukaisesti. Luokitteluun tarvitaan klassisen kongopunavärjäyksen lisäksi muita menetelmiä, kuten immunohistokemiallisia värjäyksiä. Tässä esitellään tarkempi lähestymistapa, jossa käytetään kongopuna/immunohistokemiallista kaksoisvärjäystä, jota voidaan helposti soveltaa rutiinidiagnostiikassa. Kongopunavärjäystekniikkaan ja immunohistokemiallisiin menetelmiin tarvittiin muutoksia, jotta molemmat värjäysmenetelmät voitiin yhdistää yhdelle objektilasille. Arviointi tehtiin käyttämällä tavanomaista valo- ja fluoresenssimikroskopiaa. Lyhentämällä kongopunavärjäysaikaa 10 sekuntiin ja muuttamalla endogeenisen peroksidaasin estämistä koskevia muutoksia saatiin tarkkoja tuloksia kongopunavärjäyksen ja immunohistokemian kaksoisvärjäyksen arvioimiseksi fluoresenssimikroskoopilla. Arvioinnissa käytettiin 2 μm:n paksuisia leikkeitä 4 μm:n sijasta, koska ne paransivat värjäysspesifisyyttä. Kongopuna- ja immunohistokemian yhdistelmä in situ -kaksoisvärjäyksenä yhdellä objektilasilla on toteuttamiskelpoinen lähestymistapa amyloidoosin diagnosoinnissa. Sen avulla voidaan immunohistokemian arvioinnissa keskittyä fluoresoiviin Kongo-puna-positiivisiin alueisiin, jolloin vältetään väärien positiivisten tulosten allekirjoittaminen. Lisäksi se lisää immunohistokemiallisesti värjättyjen leikkeiden signaali-kohinasuhdetta tavanomaisessa mikroskopiassa.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Esittely

Amyloidoosi on morfologinen kuvaus väärin taitettujen valkuaisaineiden laskeumasta, jota esiintyy monissa eri kudostyypeissä . Amyloidia muodostavat proteiinit ovat peräisin lukuisista eri lähteistä, jotka vaihtelevat kasvaimista, kuten plasmasolujen kasvaimista tai medullaarisista kilpirauhaskarsinoomista, kroonisiin infektioihin, tai niitä esiintyy ikääntymisen seurauksena. Harvoissa tapauksissa amyloidoosi johtuu geneettisesti periytyvistä proteiinien vääränlaisesta taittumisesta . Amyloidoosin kliininen merkitys ulottuu ruumiinavausten satunnaislöydöksistä hengenvaarallisiin sairauksiin. Kudosnäytteitä tutkiessaan patologien on tärkeää pitää mielessä amyloidikerrostumien todennäköisyys, koska se voi olla ensimmäinen vihje vielä tuntemattomasta vakavasta perussairaudesta. On tärkeää, että vaikka itse amyloidikerrostumiin kohdistuvista hoidoista on saatu lupaavia tuloksia, amyloidoosin hoitokeinot tähtäävät edelleen pääasiassa perussairauteen, ja useimmissa tapauksissa tämä puolestaan voidaan ja on määriteltävä amyloidin alatyypityksen perusteella.

Klassinen histokemiallinen värjäysmenetelmä amyloidille on kongonpunainen värjäys, jonka Bennhold esitteli vuonna 1922 ; tyypillinen polarisaatiota käyttävä ”omenanvihreä” kaksoiskirjavuus kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1927 . Kongopunavärjäyksen herkkyyden ja spesifisyyden lisäämiseksi on käytetty useita menetelmiä, mukaan lukien kongopunavärjättyjen leikkausten arviointi fluoresoivalla valolla kongopunan tunnettujen fluoresoivien ominaisuuksien vuoksi . Aivan äskettäin amyloidin havaitsemiseen on ehdotettu lähestymistapoja, joissa käytetään digitaalisesti vahvistettua hematoksyliini-eosiinipolarisaatiotekniikkaa , mikä on erityisen hyödyllistä amyloidin tunnistamisessa tapauksissa, joissa kudosta on saatavilla niukasti.

Ammyloidin alatyypin määrittämisen kultainen standardi on immunohistokemia, mukaan lukien useat vakiintuneet protokollat ; siinä on kuitenkin joitain puutteita, erityisesti kun otetaan huomioon amyloidogeenisen kevytketju lambda:n vasta-aineiden heikompi spesifisyys. Uusi lähestymistapa erityisesti harvinaisten amyloidoosivarianttien alatyypittelyyn on massaspektrometria ; valitettavasti tätä lupaavaa menetelmää ei ole toistaiseksi käytetty laajalti kustannusten ja saatavuuteen liittyvien ongelmien vuoksi, ja lisäpuutteena on sen ilmeinen rajoittuneisuus tapauksissa, joissa kudosta on saatavilla niukasti tai joissa amyloidin määrä on vähäinen. Toinen viimeaikainen saavutus on vatsaontelon rasva-aspiraattien immunoelektronimikroskopian käyttö amyloidiesiintymien alatyypittelyssä ; tämä on kuitenkin monimutkainen menetelmä.

Muutamissa aikaisemmissa tutkimuksissa on keskitytty fluoresenssin ja immunohistokemian yhdistelmään. Tässä esitämme lisätodisteita tällaisen lähestymistavan käytännöllisyydestä ja raportoimme helposti rutiinikäyttöön siirrettävän protokollan, jonka avulla pystyimme käsittelemään tarkasti amyloidin alatyypitystä formaliiniin kiinnitetyissä ja parafiiniin upotetuissa kudoksissa. Kongopuna/immunohistokemiallinen kaksoisvärjäys mahdollistaa keskittymisen Kongopuna-positiivisiin alueisiin immunohistokemian arvioinnissa ja lisää immunohistokemiallisesti värjättyjen leikkeiden signaali-kohinasuhdetta tavanomaisessa valomikroskooppisessa arvioinnissa, mikä parantaa sekä menettelyn spesifisyyttä että herkkyyttä ja vähentää diagnostiikkaan tarvittavaa kudosmäärää.

Materiaalit ja menetelmät

Tapausten valinta

Uuden tekniikan vakiinnuttamiseen käytettiin arkistostamme peräisin olevia näytteitä, joilla oli osoitettu amyloidoosidiagnoosi. Ne on lueteltu taulukossa 1, mukaan lukien vaiheet, joihin kyseistä kudosta käytettiin.

Kongopunavärjäyksen lähestymistavat

Kongopunavärjäys suoritettiin aluksi laitoksessamme vakiintuneen protokollan mukaisesti: Kudos leikataan 6 μm:n paksuisiksi leikkeiksi, deparafinoidaan ja värjätään Kongon punaisella 30 minuutin ajan – 2.5 g Kongonpunaista (Merck Millipore, Darmstadt, Saksa) ja 1 g kaliumhydroksidia (Merck Millipore) liuotetaan 500 ml:aan 80-prosenttista etanolia; tämän jälkeen leikkeet huuhdellaan vesijohtovedellä ennen niiden vastavärjäystä hematoksyliinillä (Merck Millipore) 4 minuutin ajan. Seuraavassa vaiheessa leikkeet eriytetään 0,5-prosenttiseen HCl/etanoli-liuokseen ja huuhdellaan uudelleen vesijohtovedellä 10 minuutin ajan, ennen kuin ne dehydratoidaan ja kiinnitetään.

Tutkimuksessamme protokollaa muutettiin Kongon punaisen värjäysajan osalta, jotta nähtäisiin, mikä vaikutus lyhyemmillä värjäysajoilla voisi olla myöhempään immunohistokemialliseen värjäykseen. Myös 2 ja 4 μm:n paksuisia leikkeitä testattiin.

Immunohistokemiallinen värjäys ja endogeenisen peroksidaasin esto

Taulukossa 2 on lueteltu immunohistokemialliset värjäysolosuhteet eri amyloidin alatyypeille. Valmistajan suosituksen mukaisesti amyloidogeenisten kevytketjujen kappa ja lambda osoittamiseen käytettiin kahta eri kloonia. Immunohistokemia suoritettiin kongopunavärjäyksen jälkeen. Lyhyesti sanottuna deparafinoidut ja endogeenisen peroksidaasin estämät objektilasit (ks. myöhemmin) inkuboitiin normaalissa hevosseerumissa (AA-amyloidivärjäystä varten) tai normaalissa vuohen seerumissa (kaikkia muita värjäyksiä varten) / tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (900 μl seerumia / 60 ml TBS) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (molemmat seerumit ovat peräisin Vector Lab:lta, Burlingame, Kalifornia), USA) ja inkuboitiin sitten yön yli primaarivasta-aineen kanssa 4 °C:ssa, huuhdeltiin ja inkuboitiin biotinyloidulla antihiiri IgG:llä (amyloidi AA:n värjäystä varten) tai biotinyloidulla anti-kani IgG:llä (kaikkia muita värjäysmenetelmiä varten) liuoksella (300 μl IgG/900 μl normaalia hevos- tai vuohen seerumia / 60 ml TBS:ää; kummatkin IgG:t ovat peräisin yrityksestä Vector Lab.) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä; lopuksi ne huuhdeltiin ja inkuboitiin avidiini-biotiini-peroksidaasipakkauksella (Vectastain, Vector Lab.) 30 minuutin ajan ja visualisoitiin käyttämällä käyttövalmista 3-amino-9-etyylikarbatsolia (AEC; Dako, Glostrup, Tanska) kromogeenina (10-20 minuuttia hetkellisessä optisessa kontrollissa) ja Meyerin hematoksyliiniä (Medite, Dietikon, Sveitsi). AEC:tä käytettiin mieluummin, koska aiemmat kokeet osoittivat, että AEC:n visualisoinnissa signaali-kohina-tulos on parempi kuin diaminobentsidiinin visualisoinnissa. Koska AEC liukenee veteen ja alkoholiin, objektilasit peitettiin Medi-Mountilla (Medite, Burgdorf, Saksa) 30 minuutiksi ennen peittämistä.

Tavanomainen kongopunavärjäyksen jälkeinen kudosten endogeenisen peroksidaasin estokäsittely (3-prosenttinen H2O2-liuos 70-prosenttisessa etanolissa) johti kongopunavärjäyksen valmistumisen jälkeen kongofilian menetykseen, testattiin muita endogeenisen peroksidaasin estomenetelmiä, kuten: Tämän vaiheen siirtäminen ennen kongopunavärjäystä ja 70-prosenttisen etanolin korvaaminen tislatulla vedellä.

Arviointi

Kongopuna/immunohistokemian kaksoisvärjättyjä leikkeitä arvioitiin ensisijaisesti tavanomaisella valomikroskoopilla sen arvioimiseksi, näkyikö kyseinen immunohistokemiallinen kromogeenituote odotetusti, huonommin vai paremmin verrattuna diagnostiseen rutiinivärjäykseen (ilman Kongopuna-esivärjäystä). Tämän jälkeen käytettiin fluoresenssimikroskooppia, jossa oli rodamiinisuodatin (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Saksa), kongopunaisen väriaineen fluoresenssin arvioimiseksi. Alueet, jotka osoittivat spesifistä intensiivistä fluoresenssia, arvioitiin edelleen valomikroskoopilla sen selvittämiseksi, voitiinko näillä alueilla havaita amyloidikerrostumia myös immunohistokemiallisesti.

Tulokset

Vaihe 1: Kongopunavärjäysprotokollan muutokset

Testattiin Kongopunavärin värjäysaikoja eri tavoin. Tämä oli tarpeen, koska vasta-aineiden kyky sitoutua antigeeneihin heikkeni Kongonpuna-värjäysmenetelmällä ja täysi-intensiivinen Kongonpuna vaikeutti samanaikaista arviointia, koska immunohistokemiassa käytettiin punaista kromogeeniä (AEC), jolla oli samanlainen väri kuin Kongonpunalla. Alkuperäistä 30 minuutin värjäysaikaa soveltaen amyloidikerrostumien kaksoiskuvioisuus voitiin havaita käyttämällä polarisoitua suodatinta tavanomaisessa valomikroskopiassa. Kun kongopunavärjäys kesti vain 5, 10 tai 20 sekuntia, positiivisia signaaleja voitiin aina havaita, kun käytettiin fluoresenssimikroskoopin rodamiinisuodatinta, kun taas tavanomaisessa mikroskopiassa havaittiin vain satunnaisesti kongofiliaa ja kaksihaaraisuutta, kun käytettiin polarisoitua suodatinta (kuva 1). Jatkotutkimuksia varten kongopunavärjäysaika lyhennettiin mieluiten 10 sekuntiin, jotta vältettäisiin ylivärjäytyminen. 10 sekuntia on valittu käytännöllisyyssyistä (helpompi noudattaa tasaisesti verrattuna 5 sekuntiin) märkälaboratoriossa.

Vaihe 2: Immunohistokemiallisten protokollien muutokset Kongopunapunavärjäyksen ja immunohistokemiallisen värjäyksen yhdistämiseksi yhdellä objektilasilla

Ensimmäisessä vaiheessa suoritettiin immunohistokemiallinen värjäys erillisille leikkeille tässä tutkimuksessa käytettävien kudosten antigeenisyyden vahvistamiseksi, mikä osoitti tyydyttäviä värjäystuloksia käyttäen vakiintuneita rutiiniprotokollia, jotka on eritelty yksityiskohtaisesti taulukossa 2.

Kun yhdistettiin kongopunavärjäys (kongopunavärjäysaika 10 s) ja immunohistokemiallinen värjäys samoista leikkeistä, havaittiin, että kongofilia hävisi immunohistokemiallisten menetelmien päätyttyä käyttämällä kudosten endogeenisen peroksidaasin estoon tarkoitettua tavanomaista käsittelyä (3-prosenttista H2O2-liuosta 70-prosenttisessa etanolissa), koska kongopunaväriaine oli pesty pois. Sen vuoksi kolmannessa vaiheessa muutettiin endogeenisen peroksidaasin estokäsittelyä. Endogeenisen peroksidaasin esto tavanomaisella menetelmällä, mutta sitä sovellettiin ennen kongopunavärjäystä, sekä 70-prosenttisen etanolin korvaaminen tislatulla vedellä, kun endogeeninen peroksidaasin esto suoritettiin kongopunavärjäyksen jälkeen, johti tyydyttäviin tuloksiin sekä kongopunavärjäyksen arvioinnissa että immunohistokemiallisessa värjäyksessä. Jotta tavanomaisessa märkälaboratoriotyöskentelyssä pysyttäisiin mahdollisimman hyvin, sovellettiin edelleen menetelmää, jossa etanoli korvataan tislatulla vedellä. Yritys jättää endogeeninen peroksidaasin esto pois vähensi kohtalaisesti AEC:n visualisoinnin signaali-kohina-tuloksia (olettaen, että estämättömät endogeeniset entsyymit hyödynsivät AEC:tä ja toisaalta värjäytyivät hieman taustavärjäytyneiksi ja toisaalta riistivät ABC-peroksidaasikompleksilta kromogeenin asianmukaista visualisointia varten), ja siksi sitä ei hyödynnetty enempää. Immunohistokemiallisten värjäysten laatu kongonpunaisella esivärjäyksen jälkeen oli sama kuin immunohistokemiallisten värjäysten laatu ilman edeltävää kongonpunaisella värjäystä; näin ollen päädyimme siihen, että immunohistokemian suorittaminen leikkeistä, jotka on esivärjätty kongonpunaisella 10 s:n ajan, ei johda antigeenisyyden menetykseen tai epäspesifisiin värjäystuloksiin.

Vaihe 3: Leikkauspaksuuksien muutokset

Viimeiseksi tutkimme eri leikkauspaksuuksien (2 ja 4 μm) merkitystä. Yleisesti ottaen immunohistokemiallisten värjäysten spesifisyys ja arvioitavuus (signaali-kohinasuhde) oli parempi ohuemmissa leikkeissä; lisäksi oli vähemmän artefakteja, jotka liittyivät kudoksen irtoamiseen objektiolevyistä värjäysten aikana. Kaikissa tapauksissa saatiin samat tulokset kuin amyloidiesiintymien alustavassa diagnostisessa alatyypittelyssä.

Esimerkkejä kuvatun lähestymistavan soveltamisesta rutiinidiagnostiikkaan

Kuvissa 2 ja 3 on esitetty kaksi rutiinitapausta, joissa amyloidien alatyypittely voitiin tehdä tässä tutkimuksessa ehdotetulla uudella algoritmilla; pelkkää tavanomaista tekniikkaa soveltaen tulkinnanvaraisia tuloksiakaan ei ole saatu.

Keskustelu

Tässä esitämme ja validoimme yhdistetyn kongopuna/immunohistokemiallisen kaksoisvärjäysmenetelmän, joka mahdollistaa keskittymisen kongopunapositiivisiin alueisiin immunohistokemian arvioinnissa, mikä parantaa in situ-pohjaisen amyloidien alatyypityksen spesifisyyttä. Se auttaa myös säästämään kudosta, mikä on ongelma, koska biopsiamateriaali on yhä rajallisempi johtuen muuttuneista diagnostisista lähestymistavoista, joissa käytetään ohuita neulansydämiä ja biopsianäytteitä.

Toisin kuin muissa ehdotetuissa uusissa arviointitekniikoissa, joissa keskitytään pitkälle kehitettyyn digitalisoituun kuva-arviointiin , lähestymistapamme voidaan helposti sisällyttää rutiinidiagnostiikkaan. Edellytykset käsittävät vain vakiintuneen kongopunavärjäyksen muuttamisen, saatavilla olevan amyloidi-immunohistokemian sekä fluoresenssimikroskoopin, jossa on rodamiinisuodatin. Ihannetapauksessa olisi käytettävä mikroskooppeja, jotka on varustettu sekä fluoresenssi- että tavanomaista valomikroskopiaa varten, koska tämä yksinkertaistaa immunohistokemian arvioinnissa amyloidikerrostumien samojen (fluoresoivien) kiinnostuksen kohteena olevien alueiden todentamisprosessia yksinkertaisella valonlähteen ja suodattimen vaihdolla. Voidaan kuitenkin käyttää myös kahta eri mikroskooppia, mutta vaikeissa tapauksissa voidaan kuitenkin ehdottaa, että otetaan valokuva vastaavista alueista fluoresenssi- ja valomikroskopiassa arvioinnin helpottamiseksi.

Yhtäpitävästi aiempien tutkimusten kanssa voimme osoittaa, että Kongonpunainen ei häiritse tai häiritse immunohistokemiaa . Lisäksi useimmissa tähänastisissa tutkimuksissa käytettyihin 4-6 μm:n leikkauspaksuuksiin verrattuna pystyimme osoittamaan, että käyttämällä ohuempia 2 μm:n leikkauksia, jotka ovat edullisia immunohistokemian kannalta (parempi signaali-kohinasuhde, vähemmän irtoamisartefakteja), voidaan myös johtaa tyydyttäviin tuloksiin kongopunavärjäyksen osalta, jos ne luetaan fluoresenssimikroskoopilla.

Viime aikoina on julkaistu useita artikkeleita, joissa propagoidaan fluoresenssin käyttöä amyloidikerrostumien arvioinnissa ja osoitetaan sen paremmuus polarisoituun valomikroskopiaan verrattuna, koska se on sekä spesifisempi että herkempi . Tässä tutkimuksessa olemme tarkentaneet ja optimoineet tätä lähestymistapaa useilla tavoilla työskentelemällä mukautetun protokollan parissa, joka koskee värjäysaikaa, värjäysmenetelmiä sekä leikkauksen paksuutta. Nämä muutokset mahdollistivat lopulta in situ -kaksoisvärjäyksen sekä amyloidikerrostumien herkän ja spesifisen havaitsemisen että näiden kerrostumien alatyypittelyn, mikä on ratkaisevan tärkeää amyloidikerrostumiin johtavan perussairauden erottamiseksi. Kaksoisvärjäysmenetelmämme mahdollistaa amyloidin herkän havaitsemisen fluoresenssin avulla ja samalla näiden kerrostumien spesifisen luokittelun, mutta myös sen, että voidaan säästää materiaalia välttämällä sarjapoikkileikkauksia, joista joskus pienet amyloidikerrostumat on jo saatettu leikata pois. Tämän kaksoisvärjäyksen käyttöönoton jälkeen olemme jo käyttäneet tätä lähestymistapaa useissa tapauksissa, joissa lopullista diagnoosia ei ole voitu tehdä muilla menetelmillä. Kuvat 2 ja 3 kuvaavat kahta tällaista tapausta.

Lisätäydentämiselle saattaa kuitenkin olla vielä tilaa. Koska immunoalkaliinifosfataasipohjaisia detektiojärjestelmiä, jotka eivät tarvitse endogeenisen peroksidaasin estoa, ei tällä hetkellä käytetä immunohistokemiallisessa työnkulussamme, immunoperoksidaasipohjaisten detektiojärjestelmien korvaaminen ensiksi mainituilla järjestelmillä voi parantaa tuloksia entisestään ja keventää laboratorion työnkulkua.

Johtopäätöksinä esitämme optimoidun ja hiotun lähestymistavan Kongo-puna/immunohistokemialliseen kaksoisvärjäykseen. Tämä lähestymistapa on edullinen spesifisyyden, kustannusten ja tarvittavan kudosmäärän suhteen. Sen vaatimukset ovat minimaaliset, ja sen pitäisi mahdollistaa laajamittainen käyttö.

Kiitokset

Thomas Menter saa tukea Nuovo-Soldatin syöpätutkimussäätiöltä (Nuovo-Soldati Cancer Research Foundation, Vaduz, Liechtenstein).

Eettiset periaatteet

Tutkimuksessa on mukana vain Baselin patologian instituutin arkistoitua ihmismateriaalia, ja sen on hyväksynyt Luoteis-Keski-Sveitsin etiikkakomitea (EKNZ 2014-252). Tutkimukseen ei osallistunut eläimiä.

Disclosure Statement

Tekijät ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

Tekijän yhteystiedot

Artikkelin / julkaisun tiedot

Tekijänoikeudet / Lääkkeiden annostelu / Vastuuvapauslauseke

Tekijänoikeudet: Kaikki oikeudet pidätetään. Mitään tämän julkaisun osaa ei saa kääntää muille kielille, jäljentää tai käyttää missään muodossa tai millä tahansa tavalla, elektronisesti tai mekaanisesti, mukaan lukien valokopiointi, tallentaminen, mikrokopiointi tai millä tahansa tiedon tallennus- ja hakujärjestelmällä, ilman kustantajan kirjallista lupaa.
Lääkeannostus: Kirjoittajat ja kustantaja ovat pyrkineet kaikin tavoin varmistamaan, että tässä tekstissä esitetyt lääkevalinnat ja annostukset vastaavat julkaisuhetkellä voimassa olevia suosituksia ja käytäntöjä. Jatkuvan tutkimuksen, viranomaismääräysten muutosten sekä lääkehoitoon ja lääkevaikutuksiin liittyvän jatkuvan tiedonkulun vuoksi lukijaa kehotetaan kuitenkin tarkistamaan kunkin lääkkeen pakkausselosteesta mahdolliset muutokset käyttöaiheissa ja annostelussa sekä lisätyt varoitukset ja varotoimet. Tämä on erityisen tärkeää silloin, kun suositeltu lääke on uusi ja/tai harvoin käytetty lääke.
Vastuuvapauslauseke: Tämän julkaisun sisältämät lausunnot, mielipiteet ja tiedot ovat yksinomaan yksittäisten kirjoittajien ja kirjoittajina olleiden henkilöiden eivätkä kustantajien ja päätoimittajan (päätoimittajien) omia. Mainosten ja/tai tuoteviittausten esiintyminen julkaisussa ei ole takuu, suositus tai hyväksyntä mainostetuille tuotteille tai palveluille tai niiden tehokkuudelle, laadulle tai turvallisuudelle. Julkaisija ja päätoimittaja(t) eivät ole vastuussa mistään henkilö- tai omaisuusvahingoista, jotka johtuvat sisällössä tai mainoksissa mainituista ideoista, menetelmistä, ohjeista tai tuotteista.