ADAR

C Entsyymin ja substraatin tunnistaminen

Vähän tiedetään siitä, miten ADAR-entsyymit ovat vuorovaikutuksessa spesifisten substraattiensa kanssa ja miten RNA:ta sitovat domeenit ja katalyyttinen domeeni työskentelevät yhdessä editointireaktion aikana. Toisin kuin C-to-U RNA:n editointikoneisto, joka käyttää primääristä sekvenssimotiivia lähellä editointikohdetta kriittisenä tekijänä substraatin tunnistamisessa (Niswender, 1998), ADAR-entsyymeillä ei ole mitään ilmeistä sisäistä sekvenssispesifisyyttä. Itse asiassa, kun ADAR1- ja ADAR2-entsyymille tarjotaan täysin kaksisäikeisiä RNA-molekyylejä, ne deaminoivat lähes sekvenssivapaasti jopa 50-60 prosenttia kaikista sekvenssin sisältämistä adenosiineista (Nishikura, 2010). Silmukoiden, epäsuhtien ja pullistumien esiintyminen RNA-substraatin rakenteessa lisää kuitenkin paikkaselektiivisyyttä, ja kuten joidenkin fysiologisten ADAR-kohteiden kohdalla on havaittu, tällaisen substraatin monimutkainen RNA:n poimutus näyttää rajoittavan pääsyä sitoutumaan RNA:han ja tuottavaa katalyysiä usein vain yhteen adenosiiniin (Nishikura, 2010). Näin ollen suurin osa A-to-I-editoinnin kohdespesifisyydestä saattaa sijaita substraatin kolmiulotteisessa taitoksessa. Viimeaikaiset NMR-pohjaiset rakennetutkimukset ADAR-proteiinin RNA:ta sitovista domeeneista kompleksissa minimaalisten RNA-substraattien kanssa viittaavat kuitenkin siihen, että yksittäiset dsRNA:ta sitovat domeenit voivat olla mukana myös sekvenssispesifisissä kontakteissa, jotka voivat osaltaan vaikuttaa selektiivisyyteen tiettyjä RNA-kohteita kohtaan verrattuna toisiin (Stefl et al., 2006, 2011).

Toinen ADAR-proteiinien ominaisuus, jolla voi olla vaikutusta substraatin tunnistamiseen ja vuorovaikutukseen, on se, että tuottavaa ja korkea-aktiivista deaminointia varten ADAR-proteiinit muodostavat substraattiin dimeerin (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Mahdollisesti ADAR-proteiinien välille voi muodostua sekä homo- että heterodimeerejä (Chilibeck ym., 2006), ja ne edustavat siten toista säätelykerrosta, joka vaikuttaa substraattispesifiseen tunnistamiseen sekä RNA:n muokkausaktiivisuuteen. Koska ADAR3:lle ei toistaiseksi tunneta mitään muokkauskohdetta eikä tällä proteiinilla ole entsymaattista aktiivisuutta tavanomaisissa deaminaasimäärityksissä (Melcher ym., 1996a; Chen ym., 2000), sen roolin on ehdotettu olevan luonteeltaan säätelyä, joka tapahtuu heterodimeeristymisen kautta muiden ADAR:ien kanssa.

Yleisen muokkausaktiivisuuden kannalta tärkeiden ADAR-dimeerien muodostumiseen liittyy havainto, jonka mukaan tietyissä samassa substraatissa tapahtuvissa RNA:n muokkaustapahtumissa esiintyy positiivista tai negatiivista kytkeytymistä. Esimerkiksi suoraan toistensa naapurissa olevat adenosiinit tai sellaiset adenosiinit, jotka sijaitsevat RNA-dupleksirakenteen samalla puolella (noin 11 nt:n etäisyydellä A-muotoisen RNA:n sisällä), osoittavat usein kytkeytymistä ADAR:ien suorittamassa editoinnissa, mikä johtuu luultavasti siitä, että ne ovat lähempänä entsyymin katalyyttistä paikkaa tilassa (Koeris ym., 2005; Enstero ym., 2009).

Tämästä oivalluksesta huolimatta RNA:n primäärisekvenssin perusteella RNA:n editoinnin paikan ennakoiminen ei tällä hetkellä vielä ole mahdollista. Tämä johtuu lähinnä RNA:n tertiäärirakenteiden monimutkaisuudesta ja niiden dynaamisesta käyttäytymisestä. Vaikka otettaisiinkin huomioon, että dsRNA:ta sitovat domeenit saattavat pystyä erottamaan tietyt primäärisekvenssimotiivit muista, pienet muutokset ympäröivässä primäärisekvenssissä tai sekundaari- ja tertiäärirakenteessa voivat muokata tai jopa kumota sekvenssispesifiset kontaktit. Tämän seurauksena yritykset kehittää hakualgoritmeja, joissa yhdistetään useita molekulaarisia ominaisuuksia (mukaan lukien emäsparin todennäköisyys, sekvenssiympäristö, sekvenssikonservaatio), joiden tiedetään vaikuttavan editointitodennäköisyyteen tai -aktiivisuuteen, jotta voitaisiin ennustaa potentiaalisia editointikohteita, ovat johtaneet pitkiin luetteloihin ehdokkaista mRNA:ssa, mutta vain harvat uudenlaiset, paikkaselektiiviset ja korkeatasoiset modifikaatiokohteet on todettu aidoiksi in vivo -muodostuskohteiksi (Clutterbuck ym. 2005, Levanon ym. 2005, Gommans ym. 2008, Sie ja Maas 2009,). Epäsuhta tuhansien todennäköisten muokkauskohtien havaitsemisen molekulaaristen piirteiden perusteella pre-mRNA:ssa ja korkean tason muokkauskohtien vähäisyyden välillä viittaa siihen, että joko ennustusalgoritmit kärsivät suuresta väärien positiivisten tulosten määrästä ja suurin osa näistä ehdokaspaikoista ei ole ADAR:ien muokkaamia, tai sitten RNA:n muokkauksen kokeellisessa havaitsemisessa on ongelmaa ja monien todellisten muokkauskohtien kohdalla testataan vääriä kudoksia (solutyyppispesifinen muokkaus) tai testataan väärässä ajankohdassa (säätelymuokkaus). Vaihtoehtoisesti useimpien paikkojen in vivo -editointitasot ovat niin pieniä, että nykyiset osoitusmenetelmät eivät ole riittävän herkkiä todistamaan tai kumoamaan editointia.