Adenyylisyklaasi

• 2.1 Syklinen adenosiinimonofosfaatti
• 2.2 Pyrofosfaatti

• 3.1 Tyyppi II
  • 3.1.1 Rakenne
  • 3.1.2 Yli-ilmentymishäiriöt

• 4.1 Rakenne
  • 4.1 Rakenne
    • 4.1.1 C-terminaalinen katalyyttinen domeeni
      • 4.1.1.1 α1-kytkin
    • 4.1.2 N-terminaalinen säätelydomeeni
      • 4.1.2.1 αN10-kytkin
  • 4.2 Säätely pH:n mukaan
  • 4.3 Biologinen rooli
• 5 Adenyylisyklaasin 3D-rakenteet

Toiminta

Adenyylisyklaasi (ADCY, EC-numero 4.6.1.1), joka tunnetaan myös nimellä adenylaattisyklaasi, on entsyymi, joka katalysoi syklisoitumista . Se tapahtuu yhdessä vaiheessa, jossa ATP:n 3′ hydroksyyliryhmän happi hyökkää nukleofiilisesti alfa-fosfaatin kimppuun muodostaen fosfodiesterisidoksen ja pilkkomalla pyrofosfaattiryhmän. Useimmissa aktiivisissa paikoissa 3’OH:n lähellä on hapan jäännös, joka toimii sen deprotonoinnissa, ja β-fosforin vieressä on emäksisiä jäännöksiä, jotka alentavat ryhmän energiaa halkaisua varten. Adenyylisyklaasin katalysoiman reaktion reaktantti on ATP; ATP on useimmissa soluissa runsain nukleotiditrifosfaatti, jonka tyypilliset pitoisuudet vaihtelevat välillä 1-10 mM. Tämä korkea solunsisäinen pitoisuus mahdollistaa sen, että cAMP-pitoisuudet nousevat nopeasti vastauksena tiettyyn signaaliin, mikä on tärkeää monissa signaalinsiirto- ja aineenvaihduntareiteissä. Tämän reaktion päätuote on cAMP ja sivutuotteena PPi. ADCY:n sytoplasmiset alueet koostuvat sen N-terminaalista, C1a:sta, C1b:stä, C2a:sta ja C2b:stä. C1a ja C2a muodostavat katalyyttisen domainin. Tällä sivulla painotetaan mikrobien adenylyysisyklaasia Rv1264, mutta myös nisäkkäiden adenylyysisyklaaseja käsitellään vähemmän yksityiskohtaisesti.

Adenyylisyklaasiin assosioitunut proteiini (CAP) säätelee aktiinisytyoskelettiä ja solujen adheesiota kaikissa eukaryooteissa.

Kalmoduliinille herkästä adenylaattisyklaasista ks. kohta Anthrax-ödeema factor.

Johdanto

Nisäkkäillä on kymmenen adenylyylisyklaasien isotsyymiä, adenylyylisyklaasityyppiä I-X, (ADCY I-X), ja muilla eliöillä monia muita. Kaikki nisäkkäiden ja useimmat muut adenyylisyklaasit kuuluvat luokkaan III; useimmat ovat integraalisia kalvoproteiineja, ja kaikki tuottavat cAMP:ia, jonka kyky voidaan aktivoida tai inaktivoida vasteena tiettyihin olosuhteisiin tai ligandeihin. Kaikki nisäkkäiden kalvoon sidotut adenylyylisyklaasit aktivoituvat G-proteiinien alfa-alayksiköiden vaikutuksesta, mutta reagoivat eri tavoin ligandeihin, kuten magnesiumioneihin, kalsiumioneihin ja G-proteiinien beeta-gamma-alayksiköihin. Yksi nisäkkäiden isotsyymeistä ja jotkut prokaryoottiset adenylyylisyklaasin muodot reagoivat ympäristöolosuhteisiin, lähinnä pH:han.

Syklinen adenosiinimonofosfaatti

Nisäkkäillä cAMP toimii sekundaarisena viestiaineena, ja yksi sen tehtävistä on kontrolloida proteiinikinaasi A:n (PKA) toimintaa. PKA:lla puolestaan on varsin monipuolisia tehtäviä soluissa, vaikka useimmat niistä liittyvät aineenvaihduntaan, PKA:lla on myös tärkeitä tehtäviä transkription, solusyklin ja apoptoosin kannalta. CAMP:n lopullinen kohtalo on sen muuttuminen AMP:ksi 3′,5′-syklisen adenosiinimonofosfaatin fosfodiesteraasin pilkkomalla fosfodiesterisidoksella.

Pyrofosfaatti

Tämän reaktion sivutuotteen, PPi:n, pilkkominen pyrofosfataasilla tuottaa kaksi molekyyliä epäorgaanista fosfaattia (Pi). ATP-syntaasi voi yhdistää tämän epäorgaanisen fosfaatin uudelleen adeniinidifosfaatiksi (ADP) ja valmistaa näin ATP:tä käyttäen protonien käyttövoiman energiaa.

Nisäkkäiden adenyylisyklaasi

Nisäkkäillä on kymmenen adenyylisyklaasien isotsyymiä, adenyylisyklaasi tyyppi I-X, (ADCY I-X); Nisäkkäillä adenyylisyklaasilla on tärkeä rooli signaalinsiirtoreiteissä, joissa cAMP on toissijainen lähettiläs.

ADCY I-IX:llä on kaikilla yhteinen yleinen rakenne; ne koostuvat kahdesta transmembraanialueesta (M1, M2), jotka koostuvat kuudesta membraanin kattavasta heliksistä ja joiden tehtävänä on pitää entsyymi ankkuroituneena membraaniin, ja kahdesta sytoplasman alueesta (C1, C2), jotka voidaan jakaa edelleen (C1a, C1b, C2a, C2b) ja jotka vastaavat kaikesta katalyyttisestä aktiivisuudesta ja G-proteiinien ja forskoliinin aikaansaamasta sääntelystä. Liuoksessa C1a- ja C2a-domeenit voivat muodostaa heterodimeerejä keskenään joko samassa tai eri entsyymeissä, tai ne voivat muodostaa homodimeerejä identtisten yksiköidensä kanssa eri entsyymeissä. C1b-domeeni on hyvin suuri (≈15 kDa) ja sillä on monia säätelykohteita, ja sen rakenne vaihtelee eri isotsyymien välillä, kun taas C2b-domeeni on lähes olematon monissa isotsyymeissä, eikä sitä ole vielä yhdistetty tiettyyn toimintoon.

Tyyppi II

Rakenne

C2-domeenin monomeeri on sisäinen, hydrofobinen, antiparalleelinen, jota ympäröi useita, amfipaattisia , lukuun ottamatta aluetta, jota tarvitaan homodimeerin muodostamiseen toisen C2-domeenin kanssa. Tyypin II adenyylisyklaasin C2-domeenin kaksi monomeeria sitoutuu liuoksessa toisiinsa muodostaen , joka on välttämätön ATP:n katalyyttiseen muuntamiseen cAMP:ksi ja PPi:ksi. Kun ne ovat sitoutuneet, ne luovat syvän rakoilun, joka ulottuu niiden sitoutumiskohdan keskelle; tämä rakoilu soveltuu sitomaan kaksi molekyyliä sen päihin. Forskoliinin happiatomien ja ympäröivän peptidirungon välille syntyy vahvoja vetysidoksia, ja muut vuorovaikutukset ovat erittäin hydrofobisia, sillä forskoliinin sitoutumiskohta sisältää kymmenen alifaattista ja aromaattista jäämää. Tämä forskoliinin sitoutuminen luo hydrofobisen sidoksen monomeerien välille, joista jokaisella on kaksi erilaista hydrofobista pintaa, jotka sitoutuvat forskoliiniin; ja juuri tämä vuorovaikutus tekee homodimeeristä vakaan. Forskoliini on myös vuorovaikutuksessa Asn 1025:n kanssa, joka on välttämätön katalyyttisen aktiivisuuden kannalta, ja se saattaa olla jopa suoraan vuorovaikutuksessa ATP:n kanssa. Tämä homodimeeri-forskoliini-kompleksi voi edelleen aktivoitua vastauksena signaaliin sitoutumalla G-proteiinin βγ-alayksikköön. Tämä βγ-alayksikkö sitoutuu, jotka muodostavat osan α-kierteestä kompleksin uloimmassa kerroksessa.

Tämän homodimeerin sisäpuolella on kaksi erittäin konservoitunutta polaaristen jäännösten joukkoa (Arg 997 (vihreä), Asn 1025 (punainen), Ser1028 (vaaleanpunainen), Arg 1029 (oranssi), Asp 1031 (keltainen) ja Ser 1032 (violetti)). Yksi näistä sarjoista sijaitsee kussakin monomeerisessa alayksikössä, homodimeerissä ne järjestäytyvät antiparalleelisesti, jolloin ne osoittavat toisiaan kohti.

Yli-ilmentymishäiriöt

Nisäkkäiden aivoissa muistiin perustuvien toimintojen suorittaminen tapahtuu prefrontaalisella aivokuorella (PFC). Neuronien hyperpolarisaation aktivoimat syklisen nukleotidin portilla varustetut (HCN) kanavat sulkeutuvat, jotta sähkökemialliset signaalit voivat virrata aksonia pitkin synapsiin; kun HCN-kanavat ovat auki, sähköpotentiaalinen signaali ei pääse kulkemaan solun läpi. Näiden kanavien altistaminen cAMP:lle saa ne avautumaan, mikä pysäyttää signaalien välittämisen ja heikentää siten korkeampia kognitiivisia ajatuksia. Skitsofreniapotilailla cAMP-säätelymolekyyli, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1), on mutatoitunut eikä pysty säätelemään cAMP-tasoja; näin ollen kohonneet cAMP-tasot voivat aiheuttaa skitsofreniaa. HCN-kanavien sulkeutumisen uskotaan vaikuttavan myös muihin häiriöihin, kuten ADHD:hen ja kaksisuuntaiseen mielialahäiriöön. Näin ollen on järkevää, että cAMP-tuotannon säätely kohdistamalla se tyypin II adenyylisyklaasiin, koska sitä esiintyy aivoissa, voi toimia näiden häiriöiden hoitona.

Rv1264 Adenyylisyklaasi

Vaikka adenyylisyklaasia esiintyy kaikkialla eliöissä yleismaailmallisella tasolla, kaukana toisistaan sukua olevilla eliöillä on entsyymin erilaisia modifikaatioita, joista kukin on erikoistunut tiettyyn tehtävään tietyssä ympäristössä. Kuten aiemmin todettiin, ihmisellä on 10 tunnettua adenyylisyklaasin isotsyymiä, kun taas Escherichia coli -bakteerilla on vain yksi isotsyymi ja Mycobacterium tuberculosis -bakteerilla 15. Yhdellä erityisen mielenkiintoisella M. tuberculosis -bakteerin omistamalla adenyylisyklaasilla, Rv1264:llä, on N-terminaali, joka toimii tavallaan pH-anturina, koska se säätelee entsyymin aktiivisuutta ympäröivän liuoksen pH:n perusteella. Tämä adenyylisyklaasi, kuten useimmat muutkin, kuuluu luokkaan III, tämän luokan adenyylisyklaaseilla on useita domeeneja, ainakin yksi katalyysiä varten ja toinen säätelyä varten.

Rakenne

Adenyylisyklaasi on 363 jäännöksen pituinen valkuaisaine, joka koostuu katalyyttisestä ja säätelyyn tarkoitetusta proteiinista, joka sisältää joustimen, joka yhdistää nämä kaksi. Aktiivinen rakenne on nisäkkäiden II-tyypin homodimeeria muistuttava homodimeeri, jossa yhden monomeerin (ketju A) α-kierre on sijoitettu toisen monomeerin (ketju B) keskimmäisen kierukan läpi. Tämä dimerisaatio asettaa ketjun A säätelydomeenin ketjun B katalyyttisen domeenin läheisyyteen ja päinvastoin. Proteiinissa on kaksi kytkinelementtiä, toinen C-terminaalisessa domeenissa (α1-kytkin) ja toinen linkkialueella (αN10-kytkin), jotka mahdollistavat suuret konformaatiomuutokset entsyymissä suhteellisen pienten ympäristömuutosten seurauksena.

C-terminaalinen katalyyttinen domeeni

Katalyyttistä aktiivisuutta Rv1264:ssä harjoittavat jäännökset: Asp 222 (punainen), Lys 261 (sininen), Asp 265 (oranssi), Arg 298 (vaaleanpunainen), Asp 312 (keltainen), Asn 319 (violetti), Arg 323 (vihreä). Kaikki nämä jäännökset luovat erittäin polaarisen ympäristön, joka on varaukseltaan ja polariteetiltaan komplementaarinen reaktion välituotteeseen nähden. ATP:n fosfaatteja ohjaavat jäännökset, arginiini 298 ja 323, sitoutuvat aktiiviseen keskukseen. Tämä sulfaatti-ioni sijaitsee paikassa, jonka ATP:n β-fosfaatti vie katalyysin aikana. Katalyysin aikana β-fosfaatti irtoaa α-fosfaatista; tämä reaktio voidaan tehdä suotuisammaksi alentamalla energiaa β-fosfaatin ja arginiinien 298 ja 323 välisten komplementaaristen varausyhdistelmien avulla. Toinen jäännös, , sitoo molekyylin sähköstaattisten vuorovaikutusten avulla. Tämän assosiaation erityinen tehtävä ei ole tiedossa, mutta koska se on lähellä aktiivista aluetta, sillä voi olla merkitystä katalyysissä.

Aminohapposekvensointi on osoittanut, että Rv1264:n adenyylisyklaasien katalyyttisen domeenin ja nisäkkäiden adenyylisyklaasien katalyyttisen domeenin välinen sekvenssi ei ole hyvin konservoitunut, ja vain noin 25 %:n osuus vastaa edellä käsiteltyä nisäkkäiden tyypin II adenyylisyklaasia. Nämä kaksi erilaista isotsyymiä muistuttavat kuitenkin edelleen toisiaan siinä mielessä, että toistensa päällekkäisyyksillä on huomattava päällekkäisyys, kun keskimääräinen neliöllinen poikkeama (rmsd) on alle 1,76Å 79 %:n välillä kaikista . Merkittävä ero Rv1264:n ja tyypin II adenyylisyklaasin katalyyttisten domeenien välillä on niiden suhteellinen koko; Rv1264:llä ei ole dimerisaatiohaaraa, ja useita sen silmukoita on lyhennetty. Tämä johtaa siihen, että Rv1264:n adenyylisyklaasin katalyyttinen domeeni assosioituu dimeeriksi, jonka rajapinta-ala on pienempi kuin nisäkkäiden II-tyypin domeenin, jonka rajapinta-alat ovat vastaavasti 1900Å2 ja 3800Å2. Rv1264:n ja nisäkkäiden tyypin II adenylyylisyklaasien aktiiviset alueet ovat vieläkin konservoidumpia; aktiivisen alueen rmsd on vain 0,69Å ja aktiivisen alueen rmsd on 1,17Å.

Kaikki edellä esitetyt rakenteelliset tiedot C-terminaalisesta katalyyttisestä domeenista pitävät paikkansa vain, kun entsyymi on aktiivisessa tilassaan. Entsyymin inaktiivisessa tilassa aktiivinen alue on hajonnut, joten katalyyttistä aktiivisuutta ei ole. Suhteessa kiinteisiin N-terminaalisiin domeeneihin kukin C-terminaalinen monomeerinen domeeni voi siirtyä jopa 6 Å:n etäisyydelle ja kiertyä 55o. Tämä massiivinen muutos C-terminaalisen domeenin tertiäärirakenteessa purkaa aktiivisen alueen ja siirtää katalyyttiset jäännökset jopa 25 Å:n päähän katalyyttisesti aktiivisesta paikastaan. Sen lisäksi, että C-terminaalisen domeenin aktiivinen alue on hajonnut, kahden monomeerin välinen rajapinta-ala pienenee 1900Å2 :stä 930Å2 :iin.

α1-kytkin

Kytkin sijaitsee C-terminaalisen katalyyttisen domeenin sisällä, ja se on kompakti α-kierre, kun entsyymi on aktiivisessa tilassaan. Inaktivoituessaan α1-kytkimen α-helikaalinen konformaatio muuttuu epävakaaksi ja se muuttuu satunnaiseksi kelaksi. Koska tämä kytkin on aktiivisen keskuksen välittömässä läheisyydessä, suuri muutos rakenteessa häiritsee suuresti aktiivista keskusta ja tekee entsyymistä inaktiivisen.

Tämä rakenne on säilynyt nisäkkäiden adenylyylisyklaaseissa, joissa se toimii ATP-substraatin βγ-fosfaattien sitoutumiskohdan tukijana. Se toimii myös nisäkkäiden adenyylisyklaasien säätelyssä, yhdessä toisen α-helixin kanssa se muodostaa sitoutumiskohdan Gsα- ja Giα-G-proteiinien alayksiköille, jotka säätelevät adenyylisyklaasien aktiivisuutta.

N-terminaalinen säätelydomeeni

N-terminaalinen domeeni toimii säätelyssä; sillä on ainutlaatuinen mekanismi, joka määrittää ympäröivän liuoksen pH:n perusteella, tuleeko entsyymi aktiiviseksi vai ei. Katalyyttisesti aktiivisen dimeerin jokaisella monomeerillä on kymmenen , kun ne ovat dimeroituneet, ne muodostavat levymäisen rakenteen. Yksittäinen molekyyli sitoutuu hydrofobiseen taskuun. Tämän polyetyleeniglykolin tehtävä näyttää olevan rakenteellinen; sen spesifinen sijoittuminen ja liikkuminen entsyymin aktiivisen ja inaktiivisen muodon välillä viittaa kuitenkin siihen, että se voi toimia myös ympäristön hydrofobisten muutosten havaitsemisessa.

αN10-kytkin

Kytkin sijaitsee linkkialueella, ja sen konformaatiomuutoksella on jyrkempi vaikutus entsyymin kokonaisuuteen kuin α1-kytkimellä. Kun entsyymi on aktiivinen, αN10-kytkin koostuu satunnaisesta kierteestä, jossa on lyhyt α-kierre; tämä konformaatio mahdollistaa vain heikon vuorovaikutuksen N-terminaalisen säätelydomainin ja C-terminaalisen katalyyttisen domeenin välillä, jolloin entsyymillä on katalyyttinen aktiivisuus. Kierre voi ulottua jopa 24 Å:n päähän, mikä erottaa dimeerin monomeeriset C-terminaaliset katalyyttiset domeenit toisistaan. Kuten edellä on todettu, nämä muutokset johtavat entsyymin inaktivoitumiseen, ja näin ollen entsyymin inaktiivisen tilan tärkein ominaisuus on pidentynyt αN10-kytkentä. Kun αN10-kytkin laajenee, se siirtyy ulospäin, ja pentaetyleeniglykoli siirtyy αN10-kierteen muodostamaan uuteen onteloon. Tämä tukee entisestään ajatusta siitä, että pentaetyleeniglykolin ligandi toimii rakenteen lisäksi myös säätelyssä.

Säätely pH:n mukaan

Linkkialueen alussa on jäännös, , jolla on huomattava vaikutus pH:n säätelyyn. Emäksisessä pH:ssa jäännöksellä ei ole varausta ja sillä on minimaalinen vuorovaikutus kahden katalyyttisesti tärkeän jäännöksen kanssa, jotka sijaitsevat 14 Å:n ja 21 Å:n etäisyydellä niiden katalyyttisesti aktiivisista paikoista. Entsyymi on tässä tilassa inaktiivinen paitsi Lys 261- ja Asp 312 -jäännösten vuoksi myös siksi, että katalyyttisen kohdan muut tärkeät rakenteelliset osat ovat hajonneet. Happamassa pH:ssa Rv1264:stä tulee aktiivinen (optimaalinen pH~5,8)ja sen aktiivisuus kasvaa jopa 40-kertaiseksi. Tässä happamassa pH:ssa His 192:sta tulee protonoitunut ja positiivisesti varautunut, mikä aiheuttaa suuria rakenteellisia muutoksia koko proteiinissa, mukaan lukien sekä αN10-kytkimen että α1-kytkimen tiivistyminen, α4-kierteen supistuminen, mikä puolestaan aiheuttaa paraetyleeniglykoliligandin siirtymisen. Positiivisesti varautunut His 192 hylkii sähköstaattisesti Lys 261- ja Asp 312 -jäämiä, mikä yhdessä muiden rakenteellisten muutosten kanssa siirtää ne 14 Å:n ja 21 Å:n verran katalyyttisesti aktiivisiin asentoihinsa.

, jäännös, joka organisoi monia C-terminaalin ja N-terminaalin välisessä vuorovaikutuksessa tärkeitä jäännöksiä vetysidosten välityksellä, on myös tärkeä säätelyn kannalta. Kun tämä jäännös mutatoidaan, pH:n perusteella tapahtuva säätely häviää ja entsyymi on jatkuvasti aktiivinen.

Monet muutkin jäännökset vaikuttavat pH:n perusteella tapahtuvaan säätelyyn; C-terminaalisen – N-terminaalisen domeenin rajapinnassa olevat sähköstaattiset vuorovaikutukset ja vetysidokset mahdollistavat sen, että Rv1264-adenyylisyklaasi on herkkä pH:lle.

Biologinen rooli

M. tuberculosis on patogeeninen bakteeri, ja siten se kohtaa isännän immuunivasteiden joukon, jolla siitä yritetään päästä eroon. Yksi isännän puolustusmekanismeista, joita M. tuberculosis kohtaa, on fagolysosomeissa kohdattu happamoituminen. Kyky pystyä havaitsemaan tämä hapan ympäristö ja saada siihen asianmukainen vaste voi suuresti auttaa M. tuberculosis -bakteeria tartuttamaan isännän. Kun cAMP-tasoja nostetaan, muiden rakenteiden happamoituminen viivästyy ja kohonneet cAMP-tasot aktivoivat cAMP-reseptoriproteiineja, jotka puolestaan säätelevät transkriptiota.

Adenyylisyklaasin 3D-rakenteet

3D Adenyylisyklaasin 3D-rakenteet