Adventitious Root
Methods for Rooting Microshoots
Jos mikroversot eivät muodosta juuria lisääntymisvaiheessa, niille on annettava erityiskäsittelyjä adventitious root systemin käynnistämiseksi ja kasvattamiseksi. Mikroversot voidaan juurruttaa in vitro ja sen jälkeen akklimatisoida ympäristöön, tai ne voidaan juurruttaa ex vitro, jolloin juurruttaminen ja akklimatisointi yhdistyvät.
Juurruttamisen helppous ja onnistumisprosentti määräävät, mitä menetelmää käytetään tiettyyn lajikkeeseen. Kustannustehokkaampi menetelmä on juurruttaa mikroversot ex vitro. Ex vitro -juurruttaminen säästää ylimääräiseltä in vitro -siirrolta juurrutusalustaan ja nopeuttaa akklimatisoitumista tehden mikropropagoinnista tehokkaampaa. In vitro -juurruttamista käytetään, jos ex vitro -juurruttamis- ja akklimatisointimahdollisuudet puuttuvat, jos ex vitro -juurruttamisen onnistumisprosentti on alhainen ja laboratorion johtajan harkinnan mukaan.
In vitro -juurruttaminen. Kasvualustan ainesosia ja inkubaatio-olosuhteita on helppo muuttaa, kun käytetään in vitro -olosuhteita juurtumisen ja varhaisen kehityksen edistämiseksi. Ravinnesuolojen koostumukset voivat pysyä samoina, niitä voidaan muuttaa tai niitä voidaan vähentää, usein puolivahvuisiin makrosuoloihin, ja suhteellista kosteutta voidaan vähentää käyttämällä tuuletettuja kansia (kuva 5). Valo- ja lämpötilakulttuurin inkubaatio-olosuhteita voidaan muuttaa juurtumista varten. Monia mikroversoja inkuboidaan pimeässä jonkin aikaa juurtumisen aloittamiseksi ja siirretään sitten valaistuihin olosuhteisiin.
Kuvio 5. Juurtuminen. Kirurginen mikrohuokosteippi huolehtii tuuletuksesta tässä juurrutettavien versojen astiassa; tämä auttaa vähentämään suhteellista kosteutta ja valmistelee uusia kasveja kasvihuoneympäristöön.
Juurrutusravinnealusta, johon juuri leikatut mikroversot asetetaan, sisältää yleensä auxiinia. Yleensä väliaineeseen lisätään mikromolaarisia pitoisuuksia IBA:ta ja/tai NAA:ta ennen autoklavointia. Auxiinipitoisuus riippuu lajista ja lajikkeesta. Nämä tiedot ovat yleensä saatavilla verkossa käyttäen tieteellistä hakukonetta, kuten Google Scholar http://scholar.google.com/. Tyypillisesti kasvin nimi, sanat ”vitro” ja ”root” (tai adventitious root) hakusanoissa antavat tarkat tiedot. Jos kirjallisuutta ei löydy tietystä kasvista, käytä lähisukulaisia hakusanoissa selvittääksesi, miten ne reagoivat.
Koska tiedetään, että samat auxiinipitoisuudet, jotka stimuloivat adventitious rootin käynnistymistä, voivat estää juurten kehittymistä, jotkut käyttävät kahden väliaineen lähestymistapaa. Kun Cotinus coggygria -lajin mikroversot olivat 10 µM IBA:ta sisältävällä väliaineella 5 päivän ajan ennen siirtoa auxiinittomaan väliaineeseen, 100 % juurtui, kun taas vain 40 % juurtui, kun viljelyä jatkettiin väliaineella, jossa oli 10 µM IBA:ta (Metivier ym., 2007). Padilla ja Burgos (2010) viljelivät oliivin mikroversoja väliaineessa, joka sisälsi enintään 4 µM IBA:ta kahden viikon ajan, minkä jälkeen ne siirrettiin perusalustalle, jossa ei ollut auxiinia, mikä johti 65-93 %:n juurtumiseen lajikkeesta riippuen.
Jossain tapauksissa IBA-liuoksia on annettu mikroversoille peruskalvokastikkeena minuutin ajan tai kauemmin. Tsvetkov ym. (2007) saivat parhaan juurtumisen Sorbus domestican mikroversoista, kun ne kastettiin 14,8 µM:n IBA-liuokseen 80 sekunnin ajaksi ennen niiden sijoittamista basaalialustalle.
Pimeys juurtumisen aikana tai ennen juurtumista voi lisätä juurtumisen onnistumista ja juurtumisen synkronisuutta mikroversojen välillä. Etiolaatio, versojen kehittyminen ilman valoa, lisää solujen kompetenssia adventiivista juurtumista varten (Murray et al., 1994). Kun saksanpähkinän mikroversot olivat etioloituneet, juurtuminen oli parempaa ja juuret kehittyivät nopeammin kuin vihreistä versoista (Leslie et al., 2010); etioloituneet versot olivat kuitenkin hauraita ja vaativat varovaisempaa käsittelyä.
Vihreiden mikroversojen kasvattaminen juurtumisalustalla pimeässä suhteellisen lyhyen ajan voi parantaa juurtumista huomattavasti. Pimeässä 4-7 päivän ajan puolivahvassa Murashige ja Skoog -alustassa, joka sisälsi 1 µM floroglukinolia ja 1,4 µM IBA:ta, ja sen jälkeen inkubointi valoisissa olosuhteissa johti ”Delicious”-omenan mikroversojen parempaan juurtumiseen kuin jos niitä kasvatettiin vain valossa tai pimeässä pidempiä aikoja (Zimmerman, 1984). Kun ”MM106”-omenan juuriston mikroversoja kasvatettiin 4 µM IBA:ta sisältävällä väliaineella pimeässä 0-10 päivän ajan, histologisen tutkimuksen avulla havaittiin, että juurten induktio tapahtui pimeässä enintään kolmen ensimmäisen päivän aikana ja että kartiomaiset juurten alkujuuret olivat näkyvissä 7. päivään mennessä (Naija et al., 2008). Pimeäkäsittelyn ajoitus on kriittinen ja se on ehkä määriteltävä kullekin viljelykasville tai genotyypille; se voi kuitenkin parantaa juurtumisen onnistumista huomattavasti.
Joidenkin lajien juurtuminen onnistuu parhaiten, jos mikroversojen latvat valaistaan ja tyviosa on pimeässä kasvualustassa, samaan tapaan kuin makroversot juurtuvat kasvihuoneen kasvualustassa sumun alla. Kasvualustan pimentäminen voidaan toteuttaa maalaamalla kasvatusastioiden ulkopuoli mustaksi hieman kasvualustan tason yläpuolelle ja peittämällä kasvualusta steriilillä polykarbonaattirakeella tai muulla valoa pois sulkevalla aineella tai pimentämällä itse kasvualusta lisäämällä siihen aktiivihiiltä. Toisinaan in vitro -juurruttamiseen käytetään kasvihuonealustaa, kuten vermikuliittia, joka myös sulkee pois valon, sen jälkeen kun se on kostutettu ravintoalustalla.
On osoitettu, että pelkkien mikroversojen tummuus lisäsi mantelin, persikan ja oliivin juurtumista (Rugini, 1988) sekä omenan (Mencuccini ja Rugini, 1993) juurtumista verrattuna kontrolleihin, joita inkuboitiin joko pimeässä tai valossa. Erillisessä tutkimuksessa Mencuccini ja Rugini (1993) kuitenkin raportoivat, että tyven tummumisella oli vain vähäinen vaikutus mantelin, aprikoosin, kastanjan, jojoban ja oliivin mikroversojen juurtumiseen ja että se esti pähkinän juurtumista. Jos juurtumisen onnistuminen jää toivottua vähäisemmäksi, tyvitummennuksesta voi siis olla apua.
Ex vitro -juurtuminen. Jos juurtumisprosentit ovat samanlaiset, ex vitro -juurtuminen voi olla tehokkaampaa ja kustannustehokkaampaa kuin in vitro -juurtuminen (Leva, 2011). Kustannukset ovat korkeammat in vitro -juurruttamisessa ainesosien, valmistusaikojen, autoklavoitavan kasvualustan, viljelmien siirtoihin ja siirtämiseen tarvittavan työvoiman sekä inkubointitilan vuoksi. Kasvihuoneeseen siirtäminen on samanlaista in vitro- ja ex vitro -juurruttamisen välillä, ja siirtoaika voi olla samanlainen tai hitaampi, kun mikroversoissa on juuria (kuvat 4 ja 6). Tehokkuutta saavutetaan juurruttamalla ex vitro. On raportoitu, että pähkinän mikrotaimien juuriston laatu on parempi, kun juuret muodostuvat ex vitro sumussa kuin in vitro geelimäisessä elatusaineessa (Leslie ym., 2010).
Kuva 6. Pähkinän mikrotaimien juuriston laatu. (a) ja (b) In vitro juurrutetut mikropropagoidut kirsikan taimet valmiina istutettavaksi sphagnum-turpeiseen kasvihuonealustaan ennen akklimatisaatiota varten tapahtuvaa korkeaan suhteelliseen kosteuteen sijoittamista. (c) Kirsikan taimet istutetaan kasvihuoneeseen akklimatisoinnin ensimmäisenä vaiheena. (d) Pähkinän taimet istutetaan tasoon ennen niiden sijoittamista korkeaan suhteelliseen kosteuteen kasvihuoneessa.
Ex vitro -juurtuminen voi olla parannus in vitro -juurtumiseen. Vaikka Gardenia jasminoidesin in vitro -mikroversot juurtuivat 10 päivässä verrattuna 14 päivään ex vitro -mikroversojen kohdalla, kaikki ex vitro -juurtuneet mikroversot selvisivät akklimatisaatiosta verrattuna siihen, että in vitro -juurtuneiden mikroversojen kohdalla eloonjäämisaste oli 80 % (Hatzilazarou et al., 2006). In vitro juurtuneiden mikroversojen huonompi selviytyminen verrattuna ex vitro juurtuneisiin mikroversoihin raportoitiin myös saksanpähkinän osalta (Leslie et al., 2010).
Voi olla tarpeen käsitellä mikroversoja auxiinilla ennen istuttamista juurrutusalustaan ex vitro juurtumista varten. Pistaasien mikroversot, joita käsiteltiin 2 %:lla IBA:lla talkissa, juurtuivat ex vitro 79 %:sti verrattuna 48 %:n juurtumisprosenttiin kontrolleissa (Benmahioul ym., 2012).
Parannettu ex vitro -juurtuminen voidaan saada aikaan myös auxiinilla, jota levitetään nestemäisenä dippinä mikroversojen tyviosaan. 15 minuutin pulssi 250 µM IBA:ssa sai 90 % puulajin Melia azedarachin mikroversoista juurtumaan verrattuna siihen, että kontrollien mikroversot eivät juurtuneet (Husain ja Anis, 2009). Kahden tunnin upotus 588 µM IBA:ta sisältävään vesiliuokseen sai 90 % Malus zumin mikroversoista juurtumaan verrattuna 20 %:n juurtumiseen kontrolleissa (Xu et al., 2008).
Ehkä nuoruusvaiheen palautumisen vuoksi in vitro -monistamisajan lisääminen voi lisätä mikroversojen juurtumista. Leva ja Petruccelli (2012) testasivat juurtumista seitsemään aluskasvatukseen asti ja havaitsivat, että juurtuminen oli parasta seitsemännen aluskasvatuksen jälkeen.
Tilat, laji, lähetystapa, asiakaskysyntä ja johdon mieltymykset sanelevat, miten mikroversot juurtuvat. Lajit, jotka juurtuvat hyvin helposti tai juurtuvat verson lisääntymisvaiheessa, voidaan akklimatisoida ex vitro -ympäristöön nopeasti. Haastaviin lajeihin kiinnitetään erityistä huomiota valaistuksen, auxiinikäsittelyn, in vitro- tai ex vitro -juurruttamisen ja muiden tekijöiden osalta. Vaikeasti juurtuvat kloonit vaativat asiakkailta korkeampia hintoja, koska juurtuminen haittaa tehokasta tuotantoa. Juurtumista voidaan parantaa, jos sitä lähestytään monivaiheisena prosessina, johon kuuluu pätevyyden hankkiminen, juurten käynnistyminen ja sitä seuraava juurten kasvu. Kaikki nämä vaiheet on otettava huomioon ja niihin on puututtava erityisesti vaikeammin juurtuvien kloonien kohdalla.