Aggregation of ampholine on heparin and other acidic polysaccharides in isoelectric focusing

Amfoliinin kompleksoitumisen mekanismia hepariiniin isoelektrisessä fokusoinnissa on tutkittu väriaineen sitomistekniikalla eri pH-arvoilla liuoksessa. Hepariinin ja amfoliinin välillä ei ole merkittävää vuorovaikutusta pH:ssa 6,7. Heikkoa eli selektiivistä sitoutumista esiintyy pH:ssa 5,1 ja erittäin voimakasta vuorovaikutusta pH:ssa 3,5. Jälkimmäisessä systeemissä amfoliinikomponentit näyttävät käyttäytyvän polykationeina johtuen niiden järjestäytyneestä positiivisten varausten järjestyksestä kahden metyleeniryhmän etäisyydellä toisistaan, mikä suosii vahvaa sitoutumista polyanioneihin. Lisäksi hepariinin ja amfoliinin välisessä voimakkaassa sitoutumisessa näyttää olevan vaihtelevia stoikiometrioita, jotka riippuvat niiden suhteellisista määristä. On ehdotettu, että pienessä hepariinin ja amfoliinin suhteessa (amfoliiniylijäämä) aggregaatio tapahtuu kohtisuoraan hepariiniketjuun nähden, jolloin kunkin amfoliinimolekyylin loppuosan ammoniumvaraus neutraloi yhden negatiivisen varauksen hepariinimolekyylin varrella; suuremmissa suhteissa (hepariiniylijäämä) sitoutunut amfoliinisegmentti suuntautuu hepariinimolekyylin suuntaisesti niin, että yksi amfoliinikomponentti neutraloivt keskimäärin n. kolme negatiivista varausta. Hepariinin kaistamaisuus isoelektrisessä fokusoinnissa pH-alueella 3,0-4,5 voidaan selittää eri komponenttien aggregoitumisella hepariiniin määrinä, jotka riippuvat amfoliinin nettovarauksesta kyseisessä pH:ssa ja muuttuvista stoikiometrioista, jotka riippuvat hepariinin ja amfoliinin suhteen vaihtelusta pH-gradientin varrella. Amfoliinin sitoutuminen polygalakturonaattiin osoitettiin myös ylimääräisessä amfoliinissa pH-alueella, joka riippuu tämän happaman polysakkaridin karboksyyliryhmien protonoitumisasteesta sekä amfoliinin positiivisesta nettovarauksesta. pH:ssa 4,2-4,5 havaittu aggregaatio johti ennusteeseen ja myöhempään osoitukseen siitä, että polygalakturonaatti sitoutuisi myös isoelektrisen fokusoinnin yhteydessä. Tämä tukee hypoteesia, jonka mukaan amfoliinin aggregoituminen polyanioneihin, joilla on riittävä varaustiheys, on yleinen ilmiö, joka voi johtaa tiettyjen polymeerien vääränlaiseen kaistoitumiseen sopivilla pH-alueilla isoelektrisessä fokusoinnissa. Niiden käyttäytymisen perusteella isoelektrisessä fokusoinnissa pH:ssa 3,0-4,5 tutkittujen polyanionien aggregaation voimakkuus näyttää olevan hepariini A = hepariini B suurempi kuin polyglutamaatti suurempi kuin karboksyyliredusoitu hepariini B suurempi kuin polygalakturonihappo.