AmpR lisää karbapeneemiresistentin Klebsiella pneumoniae -bakteerin virulenssia säätelemällä kapselisynteesin alkuvaihetta

Esittely

Klassinen K. pneumoniae (cKp) ja hypervirulentti K. pneumoniae (hvKp) ovat kaksi maailmanlaajuista K. pneumoniae-patotyyppiä, jotka ovat tällä hetkellä liikkeellä.1,2 Pohjois-Amerikassa ja Euroopassa suurimman osan K. pneumoniae -infektioista aiheuttavat cKp-isolaatit, jotka ovat tavallisimmin opportunistisia patogeenejä, jotka aiheuttavat infektioita pääasiassa terveydenhuollossa immuunipuutteisille isännille. Tämän patotyypin ongelmallisin ominaisuus on kyky hankkia yhä enemmän mikrobilääkeresistenssiä aiheuttavia tekijöitä. Karbapeneemiresistentti K. pneumoniae (CRKP), johon liittyy plasmidikoodattuja karbapenemaaseja, aiheuttaa erityisiä kliinisiä haasteita ja aiheuttaa invasiivisia infektioita, joihin liittyy korkea kuolleisuus.3,4

Taiwanista tulleissa raporteissa on kuvattu ainutlaatuista kliinistä oireyhtymää, jossa terveillä yksilöillä esiintyy yhteisöllinen, kudosinvaasioihin tarttuva K. pneumoniae -infektio, joka esiintyy usein useissa eri paikoissa tai joka leviää myöhemmin, mukaan luettuna pyogeeniset maksan paiseet.5,6 Tämän patotyypin erottamiseksi cKp:stä nimettiin hvKp:ksi, ja hvKp:stä johtuvien infektioiden esiintyvyys on kasvanut tasaisesti viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana Aasian ja Tyynenmeren maissa.7-11 hvKp on tavallisesti herkkä mikrobilääkkeille, mutta sen on todettu olevan vastustuskykyinen, ja raportoitiin jopa laajalti lääkkeille vastustuskykyisestä cKp-isolaatista, joka oli hankkinut osan hvKp:n virulenssiplasmidista ja joka aiheutti kuolemaan johtaneen sairaalainfluenssapurkauksen.12-15

Ominaisuus, jonka alun perin uskottiin olevan herkkä ja spesifinen hvKp-isolaateille, oli hypermukoviskoottinen fenotyyppi, joka määriteltiin positiivisella string-testillä.16 Se aiheutti kuitenkin jonkin verran sekaannusta, koska kaikkia hvKp-isolaatteja ei määritetty hypermukoviskoottisiksi, ja joillakin cKp-isolaateilla oli tämä ominaisuus.17 Äskettäin on osoitettu, että useat biomarkkerit, mukaan lukien peg-344, iroB, iucA, plasmidikoodatut rmpA ja rmpA2 sekä kvantitatiivinen sideroforituotanto, ennustavat tarkasti hvKp-isolaatteja; näitä biomarkkereita voitaisiin käyttää diagnostisen testin kehittämiseksi kliinisille laboratorioille optimaalista potilashoitoa varten sekä epidemiologisessa seurannassa ja tutkimuksessa.18 Tässä tutkimuksessa tunnistimme kuitenkin uudenlaisen ryhmän muita kuin hypermukoviskoottisia hvKp-isolaatteja, joista puuttui suurin osa hvKp:n spesifisistä geeneistä. Pani genominlaajuinen assosiaatiotutkimus (Pan-GWAS), proteomianalyysi ja virulenssitesti eläinmallissa osoittivat, että AmpR lisää näiden isolaattien virulenssia säätelemällä kapselisynteesin käynnistymistä. Lisäksi havaitsimme, että tässä tutkimuksessa K-lokus 47:n (KL47) kantojen kantama AmpR ei pystynyt lisäämään KL1-hypermukoviskoottisen K. pneumoniaen virulenssia.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset isolaatit ja tiedonkeruu

Ei toistuvia kliinisiä K. pneumoniae -isolaatteja kerättiin rutiiniluonteisesti havaituista ja varastoitavista näytteistä 5 sairaalan laboratoriolääketieteellisestä osastosta Guangdongin ja Anhuin maakunnissa vuosina 2018-2019. Kaikki isolaatit säilytettiin -80 °C:ssa ennen käyttöä. Potilaista saatiin kliiniset tiedot. Lajien tunnistaminen ja mikrobilääkeherkkyysmääritykset tehtiin VITEK-2 compact -järjestelmällä (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Ranska). Tulokset tulkittiin Clinical and Laboratory Standards Instituten (CLSI; asiakirja M100-S26) julkaisemien ohjeiden mukaisesti.19 Kaikkien isolaattien tunnistetut lajit vahvistettiin matriisiavusteisella laserdesorptio-/ionisaatiomassaspektrometrillä (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Ranska). CRKP määriteltiin resistentiksi imipeneemille tai meropeneemille.

Hypermukoviskoosin fenotyyppinen karakterisointi

Hypermukoviskoosin fenotyypin tunnistamiseksi narutestillä isolaatit inokuloitiin agarlevyille, jotka sisälsivät 5 % lampaanverta, ja niitä inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa yön yli. Narutesti katsottiin positiiviseksi, kun yksittäistä pesäkettä koskettamalla tavallisella inokulaatiosilmukalla ja vetämällä pesäkettä ylöspäin saatiin aikaan yli 5 mm:n pituinen viskoosinen lanka.2

Whole Genome Sequencing (WGS)

Genomisen DNA:n (gDNA) uuttamiseen käytettiin 1 ml:n viljelmätilavuutta (optinen tiheys 600 nm:ssä 0,6) (Sangon, Shanghai, Kiina). gDNA sekvensoitiin Illumina HiSeq 2500 -sekvenssilaitteella (Illumina, San Diego, CA, USA) käyttäen pareittain päättyviä 150-bp:n lukuja. Genomin kokoaminen suoritettiin de novo SPAdes Genome Assembler -ohjelmalla (versio 3.12.0).20 Kaptive-ohjelmalla (versio 0.5.1) suoritettiin kapselityypitys kootuille sekvensseille.21 Mikrobilääkeresistenssigeenit ja virulenssitekijät identifioitiin isolaateista skannaamalla genomikontigit ResFinder- ja VFDB-tietokantoja vastaan ABRicate-ohjelmalla (versio 0.8.7). Monilokuksinen sekvenssityypitys (Multilocus sequence typing, MLST) ja ydingenomin MLST (core genome MLST, cgMLST) -genotyyppianalyysi suoritettiin Ridom SeqSphere+ -ohjelmalla (versio 5.1.0).22 Kompleksityyppi (CT) määriteltiin noudattamalla K. pneumoniae cgMLST-suunnitelmaa (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Ydingenomin yksittäisiin nukleotidivariantteihin (SNV) perustuvan fylogeneettisen puun rakentaminen suoritettiin Harvest suite -ohjelmalla (versio 1.2), jossa käytettiin 1000-bootstrap-testiä.23 Online-työkalua iTOL käytettiin fylogeneettisen puun näyttämiseen, käsittelyyn ja kommentointiin.24 Annotoimme genomisekvenssit Prokka-ohjelmalla (versio 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) -analyysi (Pan-GWAS)

Käytimme pan-genomiputkipalvelua Roary (versio 3.12.0), jolla laitoimme annotoidut assembliot GFF3-muotoon (Prokka tuotti ne valmiiksi) ja laskimme pan-genomin.26 Käytimme Scoarya (versio 1.6.16) ottaaksemme tiedoston ”https://sanger-pathogens.github.io/Roary/”, luodaksemme ominaisuustiedoston ja laskiaksemme assosiaatioita kaikkien liitännäisgenomin geenien ja ominaisuuksien välillä. Raportoimme luettelon geeneistä, jotka oli lajiteltu assosiaation voimakkuuden mukaan P-arvolla < 0,01, joka oli korjattu Benjamini-Hochbergin menetelmällä moninkertaisten vertailujen korjausta varten.27

Proteomianalyysi

Proteiinien uuttamiseen käytettiin 1 ml:n viljelmätilavuutta (optinen tiheys 600 nm:ssä 0,6). Näyte sonikoitiin kolme kertaa jäällä käyttäen korkean intensiteetin ultraääniprosessoria (Scientz) lyysipuskurissa (8 M urea, 1 % proteaasi-inhibiittorikoktail). Jäljelle jääneet jäännökset poistettiin sentrifugoimalla 12 000 g:ssa 4 °C:ssa 10 minuutin ajan. Lopuksi supernatantti kerättiin, ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA-kitillä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sulattamista varten proteiiniliuos pelkistettiin 5 mM ditiotreitolilla 30 minuutin ajan 56 °C:ssa ja alkyloidaan 11 mM jodoasetamidilla 15 minuutin ajan huoneenlämmössä pimeässä. Tämän jälkeen proteiininäyte laimennettiin lisäämällä 100 mM TEAB:ia ja ureaa alle 2 M:n pitoisuuteen. Lopuksi lisättiin trypsiiniä 1:50 trypsiinin ja proteiinin massasuhteessa ensimmäistä sulatusta varten yön yli ja 1:100 trypsiinin ja proteiinin massasuhteessa toista 4 tunnin sulatusta varten. Tryptiset peptidit liuotettiin 0,1-prosenttiseen muurahaishappoon (liuotin A) ja ladattiin suoraan kotitekoiseen käänteisfaasianalytiikkapylvääseen (15 cm pitkä, 75 μm i.d.). Gradientti suoritettiin seuraavasti: nousu 6 prosentista 23 prosenttiin liuotin B:stä (0,1 % muurahaishappo 98-prosenttisessa asetonitriilissä) 26 minuutissa, nousu 23 prosentista 35 prosenttiin liuotin B:stä 8 minuutissa, nousu 80 prosenttiin liuotin B:stä 3 minuutissa ja pitäminen 80 prosentissa liuotin B:stä viimeiset 3 minuuttia tasaisella virtausnopeudella 400 nl/min EASY-nLC 1000 UPLC -järjestelmässä. Peptideille tehtiin NSI-lähde ja sen jälkeen tandem-massaspektrometria (MS/MS) Q ExactiveTM Plus -laitteessa (Thermo), joka oli kytketty online UPLC:hen. Käytetty sähkösumutusjännite oli 2,0 kV. M/z-skannausalue oli 350-1800 täydessä skannauksessa, ja ehjät peptidit havaittiin Orbitrapissa 70 000:n resoluutiolla. Tämän jälkeen peptidit valittiin MS/MS:ää varten käyttäen NCE-asetusta 28, ja fragmentit havaittiin Orbitrap-laitteessa resoluutiolla 17 500. Datasta riippuvassa menettelyssä vuorottelivat yksi MS-skannaus ja sen jälkeen 20 MS/MS-skannausta 15,0 s:n dynaamisella poissulkemisella. Automaattinen vahvistuksen säätö (AGC) asetettiin arvoon 5E4. Kiinteäksi ensimmäiseksi massaksi asetettiin 100 m/z. Tuloksena saadut MS/MS-tiedot käsiteltiin MaxQuant-hakukoneella (v.1.5.2.8). Käytimme InterProScania (versio 5.37-76.0) proteiinidomeenien merkitsemiseen. Korjattu p-arvo < 0,05 ja kertaistunut muutos > 1,2 katsottiin merkitseväksi.

AmpR-komplementtimutaation rakentaminen

K. pneumonia ampR (Supplementary Materials) syntetisoitiin ja sitä reunustettiin 5ʹXbaI- ja 3ʹHindIII- restriktiokohdilla. Tämä fragmentti digestoitiin ja kloonattiin pUC57:ään. Rekombinantti-DNA talteenotettiin Escherichia coli DH5α:ssa ampisilliiniselektiolla. Rajoitusmädätyksen jälkeen ampR-fragmentti ligatoitiin pBAD33-ekspressiovektoriin (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. pBAD33-ampR:ää käytettiin transformaatioon käyttäen elektroporaatiota laboratorio-eristetyn E. colin standardina. AmpR-komplementtikannat vahvistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) (taulukko S1). AmpR:n ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 100 μg/ml arabinoosia.

Hiiren keuhkoinfektiomallit

Isolaattien virulenssin testaamiseen käytettiin K. pneumoniae:n keuhkokuumemallia hiirillä. Kuuden tai kahdeksan viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c-hiiret, jotka olivat spesifisesti patogeenivapaita, ostettiin Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.:ltä. Hiiret nukutettiin vatsansisäisesti pentobarbitaalinatriumilla (75 mg/kg) ja niihin istutettiin 1,0 × 107 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (CFU) K. pneumoniae -bakteeria noninvasiivisella intratrakeaalisella instillaatiolla suorassa näkyvyydessä. Hiirten eloonjäämistä tarkkailtiin 7 päivän ajan tartunnan jälkeen. Keuhkojen bakteeritaakan arvioimiseksi tartunnan saaneiden hiirten elimet homogenisoitiin ja liuotettiin 1 ml:aan fosfaattipuskuriliuosta (PBS); 50 μL inokuloitiin nestemäiseen liemeen (LB) agarmaljoille ja CFU-laskenta suoritettiin. Histopatologista analyysia varten keuhkojen segmentit kiinnitettiin 10 prosentin neutraalilla formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla valomikroskopiaa varten. Bakteeritaakka ja histopatologinen analyysi tehtiin 24 tunnin kuluttua infektiosta.

Kapselipolysakkaridien uuttaminen ja kvantifiointi

Kapselipolysakkaridit uutettiin Zwittergent 3-14 -pesuaineella. Tämän jälkeen uronihapon määrä mitattiin aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti.28 Samanaikaisesti bakteeriviljelmän sarjalaimennoksia viljeltiin CFU:n määrän määrittämiseksi, ja kapselipolysakkaridin pitoisuus ilmaistiin glukuronihapon määrän (μg) mukaan 109 CFU/ml näytettä kohti. Kukin koe tehtiin kolmena kappaleena.

Statistinen analyysi

Statistinen analyysi tehtiin GraphPad Prism -ohjelmiston versiolla 8 (La Jolla, Kalifornia).

Tulokset

Isolaattien ominaisuudet

Tässä tutkimuksessa käytettiin CRKP:n ei-toistuvia isolaatteja (n = 135). Kaikki isolaatit olivat sekvenssityyppiä 11 (ST11) ja ilmentivät K. pneumoniae -karbapenemaasia (KPC-2), ja yksi isolaatti kantoi sekä OXA-23:ta että KPC-2:ta (kuva S1). Isolaatit luokiteltiin 16 CT:hen käyttäen cgMLST-järjestelmää. Yleisimmät CT:t olivat CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) ja CT2410 (n = 11), ja seuraavaksi yleisimpiä CT:itä oli 11 muuta CT:tä, joita oli kussakin alle 10 isolaatissa (kuva 1). Kaikki isolaatit luokiteltiin kahteen KL-tyyppiin, KL64 (n = 86) ja KL47 (n = 49) (kuva S2). Hypermukoviskoottisia isolaatteja ei löydetty. Virulenssigeenianalyysi osoitti, että yhtään kaikkia hvKp- ja cKp-isolaattien erottamiseen tarvittavia biomarkkereita kantavaa isolaattia ei ollut raportoitu aiemmin (kuva 1, kuva S2). 18

Kuvio 1 Tämän tutkimuksen 135 isolaatin fylogeneettinen analyysi. Eri CT-tyyppisten isolaattien oksat on esitetty väreillä. Kutakin CT-tyyppiä vastaavat isolaatit ovat CT1291 (P1291-1-P1291-20), CT1313 (P1313-1-P1313-33, AH1313-1-AH1313-2), CT1689 (AH1689-1-AH1689-8), CT1772 (AH1772-1-AH1772-4), CT1814 (AH1814-1-AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1-P2405-9), CT2410 (P2410-1-P2410-11), CT2418 (P2418-1-P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1-P2445-6), CT3175 (AH3175-1-AH3175-2), CT3176 (AH3176-1-AH3176-14), CT3178 (AH3178-1-AH3178-4), CT3179 (AH3179-1-AH3179-2) ja CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 ja iucA tunnistettiin aiemmassa tutkimuksessa hypervirulenttisen K. pneumoniae -bakteerin erottamiseksi klassisesta K. pneumoniae -bakteerista18 .

Kliinisten tietojen analyysi

Klinikkatietojen analyysi

Klinikkatutkimusten välillä ei ollut merkitseviä eroja demografisissa tiedoissa, infektiotyypeissä, tärkeimmissä liitännäissairauksissa, invasiivisissa toimenpiteissä, Charlsonin komorbiditeetti-indeksissä ja Pittin bakteremiaskaala-asteikossa lukuun ottamatta keskuslaskimokatetrin käyttöä, eikä sairaalassa todetussa kuolleisuudessa kaikkien sairaalasairaalasairaaloiden välillä (P = 0,035 ja P = 0,001, tarkan testin avulla (P = 0,001). CT3176-infektion saaneiden potilaiden kuolleisuus oli merkitsevästi suurempi (78,6 % vs. 37,1 %, P = 0,012; 78,6 % vs. 20,0 %, P = 0,001; 78,6 % vs. 7,7 %, P = 0,0003; 78,6 % vs. 31,0 %, P = 0,004; Fisherin tarkka testi) verrattuna CT1313-, CT1291-, CT1814- ja muihin CT-ryhmiin. Keskuslaskimokatetrien käyttö CT1814-ryhmässä oli merkittävästi suurempaa kuin CT1313- ja CT1291-ryhmissä (84,6 % vs. 51,4 %, P = 0,049; 84,6 % vs. 35,0 %, P = 0,011, Fisherin tarkka testi) (taulukko 1).

Taulukko 1 Demografiset tiedot, komorbiditeetit, Invasiiviset toimenpiteet ja kuolleisuus potilailla, joilla on karbapeneemiresistentti Klebsiella pneumoniae -infektio

Pan-GWAS-analyysi

CT3176:n geneettisen perustan selvittämiseksi suoritimme Pan-GWAS-analyysin CT3176:n ja CT3176:n ulkopuolisten ryhmien välillä. Tunnistimme 39 geeniä, joilla on tunnettuja toimintoja, jotka liittyvät CT3176:een (Benjamini-Hochbergin menetelmällä korjattu P < 0,01) (kuva 2), mukaan lukien virulenssitekijät, kapselisynteesigeenit, mikrobilääkeresistenssigeenit ja monilääkkeiden effluksikuljettajat. Niistä ampR:llä oli suurin yhteys CT3176:een. Huomasimme kuitenkin, että myös muut CT:t, kuten CT3178 ja jotkin CT1689-isolaatit (AH1689-2 ja AH1689-6), kantoivat ampR-geeniä (kuva 1). Kaikki ampR-geeniä kantavat isolaatit kuuluvat KL47:ään.

Kuva 2 Pan-GWAS-analyysi CT3176- ja muiden kuin CT3176-ryhmien välillä. Pangenomi ja assosiaatiot laskettiin Roaryn ja Scoaryn avulla. Tonttikartta luotiin ggplot2:lla.

Proteomianalyysi

Proteomianalyysiin valittiin kolme ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 ja AH1689-2) ja kolme ampR- (AH1689-3, AH1689-4 ja AH1689-5) isolaattia. Molemmissa ryhmissä tunnistettiin yhteensä 3093 proteiinia 36 727 ainutlaatuisen peptidin perusteella. Lopuksi tunnistimme 24 eri tavoin ilmentynyttä proteiinia (DEP). Niistä 15 oli ylössäätelyä ja 9 alasäätelyä ampR+-isolaateissa verrattuna ampR-isolaatteihin (kuva 3A-C, taulukko S2). WcaJ:llä oli suurin kertainen muutos, ja siksi se korostettiin.

Kuva 3 Proteomianalyysi ja kapselivärjäys. (A) Volcano-kuvio, joka osoittaa ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 ja AH3178-1) ja ampR- (AH1689-3, AH1689-4 ja AH1689-5) Klebsiella pneumoniae -isolaattien kvantitatiivisen proteiiniekspression vertailun. (B, C) Erilaisesti ilmentyneet proteiinit, joiden kertainen muutos on yli 1,2, on merkitty värillä.

Virulenssi eläinmalleissa ja kapselin kvantitatiivinen määritys

Tarkoituksenamme oli selvittää ampR:n rooli ei-hypermukoviskoottisten CRKP-isolaattien virulenssissa, joten valitsimme kolme isolaattia (AH3176-1, AH1689-2 ja AH1689-3) ja testasimme virulenssia hiirimallissa. AH3176-1 ja AH1689-2 olivat kaksi ampR+-isolaattia, kun taas AH1689-3 oli ampR-isolaatti (kuva 1). Lisäksi valitsimme kokoelmastamme kaksi hypermukoviskoottista kantaa GM2 ja GM6 virulenssin testaamista varten. Sekä GM2 että GM6 kuuluvat KL1-kantaan, joista GM6:ssa on ampR-geeni ja GM2:ssa ei. KL47-kannan, joka ei ole hypermukoviskoosi, ampR-sekvenssi oli kuitenkin erilainen kuin KL1-kannan, joka on hypermukoviskoosi, joten ne nimettiin tässä tutkimuksessa ampRKL1- ja ampRKL47-kannoiksi.

Kuten kuvasta 4A käy ilmi, AH3176-1:n ja AH1689-3:ampRKL47:n sekä arabinoosin eloonjääminen oli 0 % 1 × 107 pesäkettä muodostavan yksikön (CFU) inokulaatiolla 4 d infektion jälkeen, kun taas AH1689-2:lla 20 %:n eloonjäämiskyky, 40 %:n eloonjäämiskyky AH1689-3:ampRKL47:llä ilman arabinoosia, 60 %:n eloonjäämiskyky AH1689-3:llä:llä:lla pBAD33:n ja ATCC70721:n kanssa, kun taas 80 %:n eloonjäämiskyky AH1698-3:lla havaittiin 7 d:n kuluttua infektion jälkeen. Eloonjäämisaste laski merkittävästi AH1689-3:n ampRKL47-geenillä täydentämisen jälkeen (n = 10; P = 0,033, log-rank Mantel-Cox-testi), mikä viittaa ampR:n tärkeään rooliin virulenssissa. Hiirien infektio AH3176-1:llä johti noin 10-100-kertaiseen CFU:n nousuun keuhkoissa muihin isolaatteihin verrattuna (kuva 4B). Keuhkojen patologiassa näkyi eriasteista alveolien seinämän paksuuntumista, lymfosyytti-infiltraatiota ja verisuonensisäistä verenvuotoa infektioryhmässä. Niistä AH3176-1:n aiheuttamat keuhkojen patologiset muutokset olivat vakavimmat, ja ne ilmenivät laajana keuhkojen konsolidoitumisena ja alveolinsisäisenä verenvuotona (Kuva 4D-F).

Kuva 4 Muiden kuin hypermukoviskoottisten Klebsiella pneumoniae -isolaattien virulenssipotentiaali hiiren keuhkoinfektiomallissa. (A) AH3176-1:n, AH1689-2:n, AH1689-3:n ja AH1689-3 ampRKL47-komplementtimutaation 1 × 107 pesäkettä muodostavan yksikön (CFU) vaikutus eloonjäämiseen arvioitiin. (B) 24 tuntia infektion jälkeen (hpi) infektoitujen hiirten keuhkot kerättiin ja bakteeritaakka määritettiin CFU-laskennalla (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, yksisuuntainen ANOVA). Tiedot edustavat 3 riippumatonta koetta. (C) Eri kantojen uroonihappotuotanto. Suoritettiin parittelematon kaksipuolinen Studentin t-testi. Jokainen datapiste toistettiin kolme kertaa (n = 3). Tiedot esitetään keskiarvona ± s.e.m. *P < 0.05, ns = ei merkitsevyyttä. Ilman infektiota (D) tai ATCC700721:llä (E) ja AH3176-1:llä (F) infektoitujen hiirten keuhkot kerättiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Kaikki kuvat ovat ×40 suurennoksella. Mittakaavapalkit: 250 μM.

Kuten kuvasta 5A käy ilmi, GM6:lla infektoitujen hiirten eloonjäämisaste oli huomattavasti alhaisempi kuin GM2:lla ja ATCC700721:llä infektoitujen. Eloonjäämisasteen laskua havaittiin ampRKL1:n täydentämisen jälkeen GM2:ssa. Lisäksi GM6:lla infektoitujen hiirten keuhkojen bakteerikuormitus oli huomattavasti suurempi kuin GM2:lla ja ATCC700721:llä infektoitujen hiirten keuhkoissa (kuva 5B); HE-värjäys osoitti, että GM6-infektio aiheutti laajamittaista konsolidaatiota keuhkoissa ja alveolinsisäistä verenvuotoa keuhkoissa (kuva 5E-G). Eloonjäämisasteeseen ei kuitenkaan vaikuttanut, jos GM2:een tuotiin ampRKL47 (kuva 5C).

Kuva 5 Hypermukoviskoottisten Klebsiella pneumoniae -isolaattien virulenssipotentiaali hiiren keuhkoinfektiomallissa. (A) GM2-, GM6- ja GM2 ampRKL1-komplementtimutaation 1 × 106 pesäkkeitä muodostavan yksikön (CFU) vaikutus eloonjäämiseen arvioitiin (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, log-rank Mantel-Cox-testi),). (B) 24 tuntia infektion jälkeen (hpi) infektoitujen hiirten keuhkot kerättiin ja bakteeritaakka määritettiin CFU-laskennalla (n = 10; **P < 0.01, yksisuuntainen ANOVA). Tiedot edustavat 3 riippumatonta koetta. (C) GM2- ja GM2 ampRKL47-komplementtimutaation 1 × 106 CFU:n vaikutus eloonjäämiseen arvioitiin. (D) Eri kantojen uroonihappotuotanto. Suoritettiin parittelematon kaksipuolinen Studentin t-testi. Jokainen datapiste toistettiin kolme kertaa (n = 3). Tiedot esitetään keskiarvona ± s.e.m. *P < 0,05, ns = ei merkitsevyyttä. Hiirten keuhkot, joissa ei ollut infektiota (E) tai joissa oli GM2- (F) ja GM6-infektio (G), kerättiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Kaikki kuvat ovat ×40 suurennoksella. Mittakaavapalkit: 250 μM.

Koska kapseli on K. pneumonia -bakteerin tärkein virulenssitekijä ja proteomianalyysin tuloksen mukaan korostunut WcaJ säätelee kapselisynteesin alkuvaihetta, tutkimme kapselipolysakkaridien tuotannon määriä. Tulos osoitti, että ampR-komplementtikannat AH1689-3:ampRKL47 ja GM2:ampRKL1 sekä arabinoosi tuottivat huomattavasti enemmän kapselipolysakkaridia (uronihappoa) kuin AH1689-3 ja GM2 (Kuva 4C, Kuva 5D).

Keskustelu

MLST on ollut yleisimmin käytetty tekniikka K. pneumoniae -populaatioiden määrittelyssä. Nopean ja kohtuuhintaisen WGS:n avulla on mahdollista vertailla kokonaisia genomeja isolaattityypitystä varten eikä vain muutamia lokuksia, kuten perinteisessä MLST:ssä. Genotyypin määrityksessä cgMLST:llä käytetään tuhansia alleeleja koko genomissa, mikä johtaa korkeampaan eristystasoon. Tässä tutkimuksessa käytimme cgMLST:tä 135 kliinisen CRKP-isolaatin luokitteluun ja havaitsimme eroja CT-tyyppien välillä kliinisten tietojen perusteella. Tapausten vähäisen määrän vuoksi emme pystyneet saamaan yhteyttä CT-tyyppien ja kliinisen lopputuloksen välille. Kuolleisuusasteiden erojen ansiosta pystyimme kuitenkin tutkimaan tarkemmin CT3176-luokkaan kuuluvia isolaatteja. GWAS-analyysi osoitti, että ampR-geeni assosioitui merkitsevästi CT3176-isolaatteihin.

Varhaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että AmpC β-laktamaasia säätelevä AmpR-geeni, joka kuuluu transkriptiotekijöiden LysR-perheeseen, kontrolloi myös useita virulenssimekanismeja Pseudomonas aeruginosa -bakteerissa.29,30 Toistaiseksi vain yhdessä artikkelissa on raportoitu AmpR-geenin roolista K. pneumoniae -bakteerin virulenssin säätelyssä. K. pneumoniaen klonaalinen isolaatti osoitti, että vain harvat tunnetut virulenssigeenit olivat vastuussa vakavista infektioista. Näiden isolaattien AmpR osallistui kapselisynteesin säätelyyn, moduloi biofilmin muodostumista ja tyypin 3 fimbriogeenin ilmentymistä sekä hiiren ruoansulatuskanavan kolonisoitumista.31 Näiden isolaattien virulenssitaso on kuitenkin edelleen epäselvä, koska tietoja tappavista infektiomalleista ei ole. Tässä tutkimuksessa käytimme keuhkokuumemallia vahvistaaksemme näiden ampR:ää kantavien isolaattien lisääntyneen virulenssin. Tämä selittäisi, miksi näillä isolaateilla infektoituneilla potilailla oli korkea kuolleisuusaste.

Aiemmin oli tavallista, että ST11-tyypin K. pneumoniae oli resistentti karbapeneemeille mutta ei hypervirulentti. Vuonna 2017 raportoitiin kuitenkin ST11-tyypin karbapeneemiresistenttien hypervirulenttien K. pneumoniae -isolaattien aiheuttamista sairaalainfektioista. Näiden isolaattien hypervirulenssifenotyyppi johtui siitä, että ST11:een ja serotyyppiin K47 kuuluvat klassiset CRKP-isolaatit olivat hankkineet noin 170 kbp:n pituisen pLVPK:n kaltaisen virulenssiplasmidin.15 Toisin kuin edellä mainitussa raportissa, tässä tutkimuksessa lisääntynyttä virulenssia omaavista ST11 CRKP -isolaateista ei löytynyt virulenssiplasmideja, mikä viittaa siihen, että virulenssin voimistuminen ei perustunut klassiseen mekanismiin.32 Virulenssia lisäävästä pLVPK:n kaltaisesta pLVPK:n kaltaisesta pLVPK:sta huolimatta AmpR:llä on mahdollisuus lisätä virulenssia itsenäisesti. Tämä vahvistettiin ampR-komplementtikannan virulenssitesteillä.

WcaJ on entsyymi, joka käynnistää kolaanihapon synteesin ja lataa ensimmäisen sokerin (glukoosi-1-P) lipidikantajalle undekaprenyylifosfaatille. WcaJ:n mahdollinen rooli K. pneumoniaen virulenssissa määriteltiin äskettäin.33 Proteomianalyysin tulokset viittaavat siihen, että AmpR lisää K. pneumoniaen virulenssia säätelemällä kapselisynteesin alkuvaihetta. Säätäjänä AmpR:n on sitouduttava geenipromoottoriin voidakseen käyttää säätelytehtäväänsä. Tähän mennessä K. pneumoniae -bakteerista on tunnistettu monia kapselityyppejä,34 ja AmpR:n sitoutumiskohtien puuttuminen joistakin kapselityypeistä saattaa selittää, miksi KL1-isolaattien virulenssia ei voida lisätä KL47-isolaateista löytyvällä AmpR:llä.

Uudet todisteet ovat viitanneet siihen, että hypermukoviskositeetti ja hypervirulenssi ovat eri fenotyyppejä, joita ei tulisi käyttää synonyymisesti. Lisäksi on tärkeää todeta, että negatiivinen merkkijonotesti ei riitä määrittämään, onko isolaatti hypervirulentti.35 Työmme keskeinen havainto oli se, että tunnistimme ei-hypermukoviskoottisen ST11 CRKP:n alakloonin, jolla oli tehostunut virulenssi.

Tämän tutkimuksen tärkein rajoitus on se, että tapauksia on vain vähäinen määrä; siksi emme pysty tutkimaan kliinisten lopputulosten ja ei-hypermukoviskoottisen hypervirulentin CRKP-infektion välistä yhteyttä. Emme myöskään pystyneet rakentamaan ampR:n knockout-kantaa, ja tämä saattaa selittyä genomianalyysillä, joka osoitti, että ampR sijaitsi oletettavasti plasmidilla (kuva S3). Koska kantoja, joilla on ei-hypermukoviskoottinen fenotyyppi, tuskin erotetaan klinikassa, näiden uusien kantojen jatkuva seuranta ja tutkiminen on kiireellisesti tarpeen.