Anakinra, ihmisen rekombinanttinen interleukiini-1-reseptoriantagonisti, estää apoptoosia kokeellisessa akuutissa sydäninfarktissa

Akuutti sydäninfarkti (AMI) on merkittävä sairastuvuus- ja kuolleisuussyynä maailmanlaajuisesti. AMI johtuu äkillisesti alkavasta sydänlihasiskemiasta ja sitä seuraavasta nekroosista. AMI:stä eloonjääneillä on suuri kuolemanriski indeksitapahtuman jälkeisinä vuosina. Koska AMI:n hoito on parantunut merkittävästi viime vuosina, yhä useammat potilaat selviytyvät AMI:sta. AMI:n yleisin komplikaatio on vasemman kammion toimintahäiriö ja sydämen vajaatoiminta. Sydänlihaksen alkuvaiheen iskeeminen vaurio käynnistää tapahtumaketjun, joka lopulta johtaa haitalliseen sydämen uudelleenmuodostukseen ja sydämen vajaatoimintaan, mikä lisää sairastuvuutta ja kuolleisuutta.1 Iskeemisessä ja ei-iskeemisessä sydänlihaksessa tapahtuvaa uudelleenmuodostusta välittävät sellaisten eri reittien ylös- ja alasregulaatio, jotka käynnistävät kardiomyosyyttien hypertrofian ja apoptoosin kuoleman ja eloonjäämisen välisessä herkässä tasapainossa.1,2 Interleukiini-1 (IL-1) -reseptorin antagonisti (IL-1Ra), joka kuuluu IL-1-perheeseen, on luonnossa esiintyvä tulehdusta ehkäisevä proteiini, joka toimii akuutin vaiheen reaktanttina.3,4 Muiden akuutin vaiheen reaktanttien tavoin IL-1Ra:n pitoisuudet nousevat AMI:n aikana, ja sen pitoisuudet korreloivat ennusteen kanssa.5,6 IL-1Ra:n lisääntymisen rooli AMI:n aikana on epäselvä, ja on esitetty spekulaatioita, joiden mukaan sen rooli vaihtelee pelkästä vaurion merkkiaineesta tulehdusreaktion modulaattoriin ja potentiaalisesta sytoprotektiivisesta aineesta.5,8,8 Hiljattain on osoitettu, että IL-1Ra:n pakotettu ilmentyminen eläinmallissa on kardioprotektiivista infarktin koon ja apoptoosin pienenemisen suhteen8 .

Tässä tutkimuksessa selvitimme anakinran, ihmisen eksogeenisen rekombinanttisen IL-1Ra:n, vaikutuksia kahdessa kokeellisessa mallissa, joissa jyrsijöillä käytettiin vasemman sepelvaltimon kirurgista ligointia: Tutkimus anakinran välittömästä antamisesta hiirimallissa sen vaikutusten arvioimiseksi apoptoosiin, infarktin kokoon ja uudelleenmuodostukseen ja tutkimus anakinran viivästyneestä (24 tuntia) antamisesta sen vaikutusten arvioimiseksi apoptoosiin riippumatta mahdollisista infarktia säästävistä vaikutuksista ja sydämen uudelleenmuodostukseen rotta-mallissa (arvioidaksemme myös mahdollisia lajien välisiä eroja). Lisäksi anakinran antiapoptoottista vaikutusta testattiin in vitro.

Menetelmät

Kirurgiset menetelmät

Kaikki eläimet toimitti Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind). Kaikki eläinkokeet tehtiin National Institutes of Healthin julkaisemien laboratorioeläinten humaania käyttöä ja hoitoa biolääketieteellisessä tutkimuksessa koskevien ohjeiden mukaisesti (nro 85-23, tarkistettu 1996). Aikuisille urospuolisille täysikasvuisille Institute of Cancer Research -hiirille (ikä 10 viikkoa; paino 26-38 g) ja aikuisille Wistar-rotille (ikä 10 viikkoa; paino 350-500 g) tehtiin sepelvaltimoiden ligointi. Kirurgiset toimenpiteet suoritettiin päivänä 1 kahden ammattitaitoisen operaattorin (F.N.S. ja S.S.) toimesta aiemmin kuvatulla tavalla.9,10 Anestesiassa (pentobarbitaali 50-70 mg/kg) olevat eläimet intuboitiin ja asetettiin oikeaan dekubitusasentoon, minkä jälkeen rintakehä avattiin kirurgisesti ja vasemman proksimaalisen sepelvaltimon ligaatio suoritettiin. Kahdeksalle hiirelle ja kahdeksalle rotalle tehtiin näennäisleikkaus, joka sisälsi kaikki vaiheet sepelvaltimon ligaatiota lukuun ottamatta; puolet hoidettiin päivittäisillä anakinra-injektioilla (1 mg/kg), ja loput puolet hoidettiin suolaliuosinjektioilla. Virginia Commonwealth Universityn laitoseläinten hoito- ja käyttökomitea hyväksyi tutkimuksen. Kymmenen hiirtä ja neljä rottaa kuoli välittömässä postoperatiivisessa vaiheessa, eikä niitä otettu mukaan mihinkään analyyseihin.

Hoito

Kaksi osatutkimusta suoritettiin: välitön anakinran anto iskemian aikana hiirellä ja viivästetty anakinran anto 24 tuntia iskemian jälkeen rotalla. Hiirimallissa anakinraa 1 mg/kg (vastaa nivelreuman hoidossa suositeltua annosta) annettiin vatsansisäisesti leikkauksen aikana ja sen jälkeen päivittäin 6 annoksen ajan 20 hiirelle (16:lle sepelvaltimoiden ligaation saaneelle ja 4:lle näennäisleikatulle). Rotta-mallissa anakinraa annettiin vatsansisäisesti päivänä 2 ja sen jälkeen päivittäin 5 annosta 8 rotalle (4:lle sepelvaltimoiden ligatoinnin saaneelle ja 4:lle näennäisleikatulle). Loput 24 hiirtä (20 hiirtä, joilla sepelvaltimoiden ligaatio ja 4 näennäisleikattua) ja 12 rottaa (8 hiirtä, joilla sepelvaltimoiden ligaatio ja 4 näennäisleikattua) saivat NaCl 0,9 %:n (keittosuolaliuos) injektioita. Mahdollisten lajien välisten erojen arvioimiseksi käytettiin kahta eri jyrsijälajia. Lisäksi 28 hiirelle tehtiin infarktin koon arviointi 24 tuntia leikkauksen jälkeen: 6 suolaliuosta saanutta hiirtä ja 22 hiirtä, joita hoidettiin kasvavilla anakinra-annoksilla (1 mg/kg , 10 mg/kg ja 100 mg/kg ), jotta voitaisiin arvioida anakinran mahdollisia annosriippuvaisia infarktia säästäviä vaikutuksia. Lopuksi 6 muuta hiirtä (3 anakinraa saanutta ja 3 suolaliuosta saanutta) lopetettiin 7 päivää sepelvaltimon ligaation jälkeen matriksin metalloproteinaasi-9 (MMP-9) -ekspression arvioimiseksi. Tässä tutkimuksessa käytettiin yhteensä 78 hiirtä ja 20 rottaa.

Infarktin koon arviointi

Kahdeksankymmentäneljä tuntia infarktiprotokollan päättymisen jälkeen sydän poistettiin nopeasti ja kiinnitettiin Langendorff-laitteeseen. Sepelvaltimot perfusoitiin 0,9-prosenttisella NaCl:lla, joka sisälsi 2,5 mmol/l CaCl2:ta. Kun veri oli pesty pois, ≈2 ml 10 % Evansin sinistä väriainetta ruiskutettiin boluksena aorttaan, kunnes suurin osa sydämestä muuttui siniseksi. Sydän perfusoitiin suolaliuoksella ylimääräisen Evansin sinisen huuhtelemiseksi pois. Lopuksi sydän poistettiin, pakastettiin ja leikattiin 8-10 yhtä paksuun (≈ 1 mm) poikittaiseen viipaleeseen kärkipisteestä tyvelle. Viipaleita inkuboitiin sitten 10-prosenttisessa trifenyylitetratsoliumkloridiliuoksessa isotonisessa fosfaattipuskurissa (pH 7,4) huoneenlämmössä 30 minuutin ajan. Infarktin saaneen kudoksen, riskivyöhykkeen ja koko vasemman kammion pinta-alat määritettiin tietokonemorfometrialla BIOQUANT-kuvantamisohjelmalla (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Infarktin koko ilmaistiin prosentteina iskeemisen riskialueen pinta-alasta, joka määritettiin prosentteina vasemman kammion pinta-alasta.

Ekokardiografia

Transthorakaalinen kaikukardiografia kevyessä anestesiassa (pentobarbitaali 30-50 mg/kg) suoritettiin juuri ennen leikkausta ja 7 vuorokautta leikkauksen jälkeen juuri ennen kuolemaa. Doppler-kaikukardiografia suoritettiin hiirellä Vevo770-kuvantamisjärjestelmällä (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) ja 30 MHz:n anturilla; rotalla käytettiin 15 MHz:n vaiheistettuun muuntajaan (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif) varustettua kaikukardiografiajärjestelmää. Anturi sijoitettiin rintakehän vasemmalle etupuolelle. Sydän kuvattiin ensin 2-ulotteisessa tilassa vasemman kammion lyhytakselisessa näkymässä. M-moodin kursori asetettiin kohtisuoraan etu- ja takaseinään nähden vasemman kammion (LV) loppudiastolisen ja loppusystolisen läpimitan (LVEDD ja LVESD) mittaamiseksi. American Society of Echocardiography -järjestön suositusten11 mukaisesti M-moodikuvat otettiin papillaarilihasten tasolta mitraaliläpän kärjen alapuolelta. Hiirestä otettiin myös apikaaliset 4- ja 5-kammionäkymät transmissiovirtauksen, vasemman kammion ulosvirtauksen ja transaortan virtausnopeuksien mittaamiseksi. LV:n fraktionaalinen lyheneminen (FS) laskettiin seuraavasti: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Ejektiofraktio laskettiin Teichholzin kaavalla. Transmitraalinen ja vasemman kammion ulosvirtauskanavan pulssidoppler-virtausspektri saatiin apikaalisesta näkymästä. Ulosvirtauskanavan virtaus mitattiin. Mitattiin isovolumetriset supistumis- (ICT) ja relaksaatioajat (IRT) sekä ejektioaika (ET). Myös LV:n ulosvirtauskanavan (LVOT) virtausnopeus-aikaintegraali (AoVTI) mitattiin. Näitä tietoja käytettiin Tei-indeksin (Tei-indeksi=ICT+ IRT/ET)12 ja sydämen minuuttitilavuuden (CO=AoVTI×π×(LVOT:n halkaisija/2)2×syketaajuus, jossa LVOT mitattiin poikkipinta-alana parasternaalisessa pitkittäisnäkymässä) laskemiseen. Ihmisillä korkeampi Tei-indeksi on yhteydessä sekä systoliseen että diastoliseen toimintahäiriöön ja huonompaan hoitotulokseen.12 Jaottelu eri hoitomuotoihin oli satunnaista, ja kaikukuvauksen tehnyt ja lukenut tutkija oli sokea hoidolle.

Patologia

Seitsemäntenä päivänä kaikukardiografian jälkeen ja nukutuksessa vatsa-aortta kanyloitiin polyeteenikatetrilla, rintakehä avattiin, aortta täytettiin fosfaattipuskurilla (0,2 mol/l, pH 7,4) ja hepariinilla (100 IU) ja oikea eteinen leikattiin tyhjennystä varten. Sydän pysäytettiin nopeasti peräkkäin diastoleen ja aloitettiin perfuusio fosfaattipuskuroidulla formaliinilla. Vain rotilla sydämestä otettiin 1-2 ml kokoverta sytokiiniplasman määritystä varten. Vasemman kammion kammio täytettiin fiksatiivilla 10 minuutin fiksointia varten. Toimenpiteen päätteeksi vasemman kammion keskikolmanneksesta otettiin poikkileikkaukset, jotka säilytettiin formaliinissa vähintään 48 tuntia. Apoptoosi määritettiin värjäämällä terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasivälitteinen dUTP-nick-end labeling (TUNEL; DNA:n pirstoutuminen, Oncor, Gaithersburg, Md). Yksityiskohtainen protokolla on julkaistu muualla.13 Peri-infarktialue määriteltiin infarktia reunustavaksi vyöhykkeeksi, jossa oli elinkelpoista sydänlihasta.13 Apoptoosin määrä ilmaistiin apoptoottisten kardiomyosyyttien lukumääränä kaikista kardiomyosyyteistä kenttää kohti. Solutyypin dokumentoimiseksi tehtiin TUNEL- ja lihasaktiinivärjäys (esilaimennettu anti-hiiren α-sarkomeerinen aktiini -vasta-aine, Invitrogen, San Francisco, Calif). Otimme huomioon ensisijaisesti apoptoosin kardiomyosyyteissä, mutta mittasimme apoptoosin myös granulaatiokudoksessa (aktiininegatiiviset mononukleaariset solut) infarktialueilla.

Leukosyyttien määrä sydänlihaksessa mitattiin CD45+-solujen lukumääränä 1 mm2 :ä kohti (käyttäen anti-hiiren CD45-vasta-ainetta, laimennos 1:100, Southern Biotech, Birmingham, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts, Massachusetts). Apoptoosin määrä peri-infarktialueilla laskettiin 10 satunnaisessa kentässä, jotka kattavat lähes koko peri-infarktialueen. Solulaskennan suorittaneet tutkijat eivät olleet tietoisia hoidon allokaatiosta.

Määritimme hiirillä sydänlihaksen fibroosia 7 päivän kuluttua AMI:stä selvittääksemme, liittyikö anakinran välitön käyttö infarktin heikentyneeseen paranemiseen. Sydänleikkeet värjättiin Massonin trikromivärjäyksellä (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo). Leikkeet peitettiin Bouinin liuoksessa yön yli ja pestiin juoksevalla vesijohtovedellä keltaisen värin poistamiseksi. Leikkeet värjättiin Mayerin hematoksyliinillä, Biebrichin skarlettihappofuchsiinilla, toimivalla fosfotungstiini-/fosfomolybdeenihappoliuoksella ja aniliininsinisellä kukin 5 minuutiksi, minkä jälkeen ne laitettiin 1-prosenttiseen etikkahappoon 2 minuutiksi. Leikkeet huuhdeltiin, dehydratoitiin alkoholilla, puhdistettiin ksyleenissä ja kiinnitettiin. Sytoplasma ja lihassyyt näkyvät punaisina, kollageeni ja tumat sinisinä. Fibroosin ja koko vasemman kammion pinta-alat määritettiin tietokonemorfometrialla BIOQUANT-kuvantamisohjelmalla, ja suhdelukua käytettiin arpialueen laskemiseen prosentteina vasemmasta kammiosta. Fibroosin ja elinkelpoisen sydänlihaksen suhde peri-infarktialueella (interstitiaalinen fibroosi) määritettiin tietokonemorfometrialla käyttäen ×20 suurennosta ja ilmaistiin prosentteina pinta-alasta. Von Kossa -värjäystä (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Calif) käytettiin (pre)nekroottisten sydänlihaksen kalsiumkerrostumien havaitsemiseksi.

Sytokiinitasot

Kokonaisveri otettiin natriumsitraattiputkiin yhdeksältä rotalta (4:ltä anakinraa ja 5:ltä normaalia keittosuolaliuosta saaneelta rotalta) kuolinhetkellä, ja se sentrifugoitiin välittömästi 1 000 grammaa 4 °C:n asteen lämpötilassa 10 minuuttia. Supernatantti kerättiin ja suodatettiin 0,22-μm:n suodattimen läpi. Tämän jälkeen näytteet säilytettiin -20 °C:ssa ja analysoitiin myöhemmin. Verenkierrossa olevien IL-1β:n, tuumorinekroositekijä-α:n, IL-6:n ja interferoni-γ:n pitoisuuksien määrittämiseen käytettiin valmistajan ohjeiden mukaista multiplex-sytokiinihelmisarjajärjestelmää (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, Calif). Reaktioseos luettiin Bio-Plex protein array -lukulaitteella, ja tiedot analysoitiin Bio-Plex Manager -ohjelmalla.

MMP-synteesi

MMP-9 eli gelatinaasi B valittiin prototyyppiseksi metalloproteinaasiksi, jota säännellään ylöspäin AMI:n jälkeen ja joka liittyy haitalliseen remodelingiin.14,15 Kokonaisliukoinen proteiini uutettiin infarktista ja peri-infarktin sydänlihaksesta 7 päivää sepelvaltimoiden ligaation jälkeen 6 hiirellä (3:lle annettiin anakinraa ja 3:lle suolaliuosta) puskurissa, jossa oli 20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA ja 1 mmol/l EGTA. Homogenaatti sentrifugoitiin 14 000 g:n nopeudella 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, ja supernatantti otettiin talteen. Tämän jälkeen 50 μg proteiinia kustakin näytteestä erotettiin 7,5-prosenttisella akryyliamidigeelillä, siirrettiin nitroselluloosamembraanille ja estettiin sitten 5-prosenttisella rasvattomalla kuivamaidolla Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa Tween-20 (10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/l NaCl ja 0,1 % Tween 20) 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen kalvoa inkuboitiin vuohen polyklonaalisella primaarivasta-aineella laimennoksella 1:1000 MMP-9:lle (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) 16 tunnin ajan 4 °C:ssa, ennen kuin se pestiin ja inkuboitiin anti-kaniini piparjuuriperoksidaasilla konjugoidulla sekundaarivasta-aineella (1:2000; Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) 1 tunnin ajan. Blotit kehitettiin kemiluminesenssijärjestelmällä. Näkyvissä oli kaksi kaistaa, jotka vastasivat pro-MMP-9:ää ja aktiivista MMP-9:ää. Vain MMP-9:n aktiivinen kaista (105 kDa) valittiin mitattavaksi. Kunkin kaistan optinen tiheys skannattiin ja kvantifioitiin densitometrialla ja ilmaistiin aktiivisen MMP-9:n ja β-aktiinin suhteena.

Anakinran antiapoptoottiset vaikutukset in vitro

Kammioperäiset kardiomyosyytit eristettiin rotasta entsymaattisella tekniikalla, joka oli muunnettu aiemmin kuvatulla tavalla.16 Lyhyesti sanottuna rotta anestesoitiin pentobarbitaalinatriumilla (100 mg / kg IP) ja sydän poistettiin nopeasti rintakehästä. Kolmen minuutin kuluessa aortan aukko kanyloitiin Langendorffin perfuusiojärjestelmään, ja sydän perfusoitiin retrogradisesti. Entsymaattinen pilkkominen aloitettiin lisäämällä perfuusiopuskuriin kollagenaasi tyyppi II (0,5 mg/ml kumpikin; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) ja proteaasi tyyppi XIV (0,02 mg/ml), ja sitä jatkettiin ≈15 minuuttia. Sen jälkeen entsyymiliuokseen lisättiin 50 μmol/L Ca2+:a sydämen perfusoimiseksi vielä 10-15 minuutin ajan. Digestoitu kammiokudos leikattiin paloiksi ja imettiin varovasti siirtopipetillä solujen dissosioitumisen helpottamiseksi. Solupelletti resuspendoitiin kolmivaiheista Ca2+ -palautusmenettelyä varten (eli 125, 250 ja 500 μmol/L Ca2+). Tuoreet eristetyt kardiomyosyytit suspendoitiin sitten minimaaliseen välttämättömään väliaineeseen (luettelonumero M1018, pH 7,35-7,45, Sigma). Solut istutettiin sitten 35 mm:n soluviljelymaljoille, jotka oli esipinnoitettu 20 μg/ml hiiren laminiinilla fosfaattipuskuroidussa keittosuolaliuoksessa, jossa oli 1 % penisilliini-streptomysiiniä 1 tunnin ajan. Kardiomyosyyttejä kasvatettiin 5 % CO2:n läsnäollessa 1 tunnin ajan kostutetussa inkubaattorissa 37 °C:ssa, jolloin kardiomyosyytit saattoivat kiinnittyä lautasen pintaan ennen kokeellista protokollaa. Tämän jälkeen kardiomyosyytit altistettiin simuloidulle iskemialle 40 minuutin ajan korvaamalla soluväliaine ”iskemiapuskurilla”, joka sisälsi 118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3, 1,0 mmol/L NaH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L natriumlaktaatti, 16 mmol/L KCl ja 10 mmol/L 2-Deoksiglukoosia (pH:n ollessa säädetty tasolle 6,2). Lisäksi soluja inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa 37 °C:ssa koko simuloidun iskemiajakson ajan säätämällä tri-kaasu-inkubaattorissa 1-2 % O2 ja 5 % CO2. 40 minuutin kuluttua reperfuusiota simuloitiin korvaamalla iskeeminen puskuri normaalilla väliaineella normoksisissa olosuhteissa. Samanaikaisesti anakinraa lisättiin levylle kasvavina (×100) pitoisuuksina alkaen pitoisuudesta 25×10-16g/ml aina pitoisuuteen 25×10-6g/ml asti (n=3 per ryhmä). Vastaava määrä normaalia elatusainetta lisättiin kolmeen levyyn, jotka toimivat kontrolleina. Levyjä inkuboitiin 18 tuntia. Kardiomyosyyttien apoptoosi analysoitiin TUNEL-värjäyksellä BD Biosciencesilta (San Jose, Calif) ostetulla kitillä, joka havaitsee ydin-DNA:n pirstoutumisen fluoresenssimäärityksellä. Lyhyesti sanottuna 40 minuutin simuloidun iskemian ja 18 tunnin reperfuusion jälkeen solut kiinnitettiin 2-kammiolevyissä 4-prosenttisella formaldehydillä/fosfaattipuskuroidulla keittosuolaliuoksella 4 °C:ssa 25 minuutin ajan ja niille tehtiin TUNEL-määritys valmistajan protokollan mukaisesti. Tämän jälkeen objektilasit vastavärjättiin Vectashield-kiinnitysalustalla, jossa oli 4,6-diamidino-2-fenylindolia (DNA:ta interkaloiva väriaine, jolla voidaan visualisoida tumat kiinnitetyissä soluissa; luettelonumero H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, Calif). Värjättyjä soluja tutkittiin Olympus IX70 -fluoresenssimikroskoopilla (Olympus Inc, Center Valley, Pa).

Anakinra Uptake In Vitro

HL-1-solut, hiiren sydänlihassolulinja, joka säilyttää aikuisten kardiomyosyyttien fenotyyppiset piirteet, kasvatettiin konfluenssiin Claycomb-väliaineessa (Sigma Chemical Co), jota täydennettiin 10 %:lla FCS:llä (JHR Bioscience, Ltd., Andover, Hampshire, Iso-Britannia) ja noradrenaliini 0.1 mmol/l (Sigma Chemical Co) gelatiini-/fibronektiinipäällysteisillä 22 mm:n lasikansilevyillä, jotka asetettiin 35 mm:n Petri-maljojen pohjalle.17 Tämän jälkeen soluihin lisättiin FITC-konjugoitua anakinraa (10 μg/ml), ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa joko normoksisissa tai hypoksisissa (2 % happea) olosuhteissa Micro galaxy, RS Biotech -inkubaattorissa 5 tunnin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti Hanksin suolaliuoksella, joka sisälsi 10 % FCS:ää. Ytimet vastavärjättiin Hoechstillä, ja havainnot tehtiin Leica DM 2000 -fluoresenssimikroskoopilla (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex).

Kaspaasi-1- ja -9-aktiivisuusmääritykset

Anakinran aiheuttama kaspaasi-1- ja -9-aktiivisuuden esto määritettiin kaupallisilla määrityssarjoilla (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) käyttäen rekombinantti ihmisen kaspaasi-1:tä ja YVAD-AMC:tä, joka on muunnelma pro-Il-1β:n pilkkoutumiskohdasta löytyvästä YVHD-sekvenssistä, fluorogeenisena substraattina kaspaasi-1:lle ja Ac-LEHD-AMC:tä kaspaasi-9:lle. Koe suoritettiin 22 °C:ssa fluorometrisellä levylukijalla (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) kineettisessä moodissa heräte- ja emissioaallonpituuksilla 390 ja 460 nm. Substraattina käytettiin lähtökonsentraatiota 11,5 μmol/l (joka vastaa kaspaasi-1:n Km:ää), jota nostettiin sitten 37,5 μmol/l:iin kilpailullisen ja ei-kilpailullisen eston testaamiseksi.18 Anakinralle valittiin aloitusannokseksi 100 nmol/L 10 μg/mL polyklonaalisen anti-IL-1Ra:n estävän vasta-aineen (R&D Systems, Minneapolis, Minn) läsnäollessa tai poissaollessa, ja sen jälkeen annos-vastekäyrän arvioimiseksi annos nostettiin 300 ja 900 nmol/L:ään. Korjaukset tyhjästä suoritetaan, ja käyrät sovitetaan 0,0 leikkauspisteeseen, koska aktiivisuuden oletetaan olevan 0 ajankohtana 0. Regressiokaltevuudet (r>0,95) saadaan jokaisesta kokeesta kullakin annoksella, ja kertoimia verrataan kolmen ryhmän välillä (anakinra, kontrolli, anakinra ja estävä vasta-aine). Kokeet tehtiin kolminkertaisina jokaiselle ryhmälle, ja käyrät ajettiin vähintään 5 kertaa jokaiselle näytteelle. Todennäköisyysarvo kuvastaa ryhmien välistä 1-suuntaista ANOVA-analyysiä, jossa on 2-puoleinen post-hoc Dunnettin testi, jossa verrataan kutakin ryhmää anakinraan.

Anakinran ja kaspaasi-1:n ja -9:n välinen fysikaalinen vuorovaikutus ja sitoutuminen testattiin koimmunoprecipitaation avulla. Anakinraa (1 μg) inkuboitiin kaupallisesti saatavilla olevien ihmisen rekombinantti-kaspaasi-1:n ja -9:n (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) kanssa 1 tunnin ajan 4 °C:ssa. Tämän jälkeen seos saostettiin lisäämällä se kahteen eri sarjaan Sepharose-helmiä, jotka oli yhdistetty anti-IL-1Ra- (Santa Cruz) tai anti-kaspaasi-1-vasta-aineella (Santa Cruz). Sepharoosiin sitoutuneet fraktiot keitettiin SDS-puskurissa ja erotettiin SDS-PAGE:lla. Kussakin asetelmassa koprezipitoituneet proteiinit immunoblotattiin ja analysoitiin Western blotilla. Anti-IL-1Ra- ja anti-kaspaasi-1- tai -9-vasta-aineita käytettiin vastaavasti anakinran ja kaspaasi-1:n immunoreaktiivisuuden havaitsemiseksi koprezipitaatissa. Jos koprezipitaattia ei ollut syntynyt, Western blotissa odotettiin yhtä ainoaa kaistaa, joka vastasi samantyyppistä liukoista vasta-ainetta kuin sefaroosihelmiin sitoutunut vasta-aine (ts. IL-1Ra-immunovärjäytyminen IL-1Ra:lle IL-1Ra:han sidotun sefaroosihelmien saostusmäärityksessä). Jos koprecipitaatiota olisi tapahtunut, olisimme odottaneet molempien liukoisten vasta-aineiden kaksoiskaistan esiintymistä molemmissa saostusmäärityksissä (yhteensä 4 kaistaa). Anakinra ja kaspaasi-1 tai -9 ajettiin Western blotissa ylimääräisissä linjoissa ja niitä käytettiin positiivisina kontrolleina.

Statistinen analyysi

Statistinen analyysi suoritettiin SPSS 11.0 -paketin avulla Windowsille (SPSS Inc, Chicago, Ill). Jatkuvat muuttujat ilmaistaan keskiarvona ja SE:nä. Yksisuuntaista ANOVA:ta käytettiin useiden (>2) ryhmien välisten keskiarvojen vertailuun, ja post hoc – 2-sivuinen Dunnettin testi käytettiin erityisesti koehenkilöiden välisten vaikutusten vertailemiseksi kontrollien kanssa kussakin ryhmässä. Parittomien tietojen t-testiä käytettiin vain kahden ryhmän välisten keskiarvojen vertailuun. Toistettujen mittausten satunnaisvaikutusten ANOVA-analyysia käytettiin vertaamaan ennen toimenpidettä ja toimenpiteen jälkeen saatuja kaikukardiografisia parametreja neljän eri ryhmän välillä, ja sen jälkeen käytettiin 2-sivuista Dunnettin testiä vertaamaan erityisesti koehenkilöiden välisiä vaikutuksia (anakinra- ja keittosuolaliuosta sisältävät AMI-ryhmät). Kahden jatkuvan muuttujan väliset korrelaatiot arvioitiin Pearsonin testillä. Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrät muodostettiin, ja log-rank-testiä käytettiin ryhmien välisten merkittävien erojen arviointiin. Eloonjäämismääriä verrattiin myös Fisherin tarkalla testillä. Mukauttamattomat 2-tailed-todennäköisyysarvot ilmoitetaan kauttaaltaan, ja tilastollinen merkitsevyys on asetettu 0,05-tasolle.

Tekijöillä oli täysi pääsy tietoihin, ja he ottavat täyden vastuun tietojen eheydestä. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen sellaisena kuin se on kirjoitettu ja hyväksyvät sen.

Tulokset

Tutkimuksessa arvioitiin anakinran vaikutuksia in vivo (hiiren ja rotan sepelvaltimon ligaatiomallissa) ja in vitro (rotan primaarisessa kardiomyosyyttiviljelyssä, HL-1-kardiomyosyyttiviljelyssä ja eristetyssä kaspaasi-1:ssä).

In vivo Anakinran anto

Survival

Kahdeksankymmentäkahdeksan hiirtä lopetettiin 24 tunnin kuluttua infarktin koon arvioimiseksi. Kuusi hiirtä lopetettiin 7 päivän kuluttua MMP-9:n ilmentymisen analysointia varten; näitä hiiriä ei otettu mukaan eloonjäämisanalyysiin. Seitsemän päivää sepelvaltimon ligaation jälkeen 15 anakinraa saaneista 16 hiirestä (94 %) oli elossa, kun taas suolaliuosta saaneista 20 hiirestä 11 (55 %) oli elossa (P=0,013, Kaplan-Meierin log-rank-testi; P=0,021, Fisherin tarkka testi). Vastaavasti anakinraa saaneista neljästä rotasta neljä (100 %) oli elossa, kun taas suolaliuosta saaneista kahdeksasta rotasta vain viisi (62 %) oli elossa. Kaikki näennäishoidetut hiiret (n=8) ja rotat (n=8) olivat elossa 7 päivän kuluttua.

Infarktin koko

Riskipinta-alassa ja infarktipinta-alassa (ilmaistuna infarktipinta-alana riskipinta-alaa kohti) ei havaittu merkittäviä eroja suolaliuosta saaneiden hiirten ja anakinra-annoksilla 1 ja 10 mg/kg hoidettujen hiirten välillä; anakinra 100 mg/kg:n annokseen liittyi kuitenkin infarktin koon vaatimaton, mutta kuitenkin merkitsevä (13 %) pieneneminen (P=0,015 suolaliuoksella verrattuna suolaliuokseen; kuva 1).

Apoptoosi

Anakinran käyttöön liittyi kardiomyosyyttien apoptoosin merkitsevä väheneminen peri-infarktin sydänlihaksen alueella sekä välittömässä että viivästyneessä hoitoryhmässä (3,1±0,2 % verrattuna 0,5±0,3 %:iin, P<0,001; ja 4,2±0,4 % verrattuna 1,1±0,2 %:iin, P<0,001, vastaavasti; kuva 2). Apoptoosin määrä peri-infarktin sydänlihaksessa korreloi suoraan epäsuotuisan remodelingin merkkien kanssa, kuten LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), etuseinän diastolinen paksuus (r=-0,50, P=0,012) ja etuseinän systolinen paksuus (r=-0,50, P=0,012). Etäisen sydänlihaksen apoptoosiprosentti oli joko havaitsematon tai hyvin alhainen, eikä siinä ollut merkittäviä eroja AMI:tä sairastavien eläinten (0,03±0,03 %) ja näennäisleikattujen eläinten (0,01±0,01 %) välillä eikä anakinraa saaneiden (0,02±0,02 %) ja suolaliuosta saaneiden (0,03±0,03 %) eläinten välillä (P>0,05 kaikissa analyyseissä).

Myokardiaalinen fibroosi ja kalsiumkerrostumat

Sydänlihaksen fibroosissa (arpimuodostus, ilmaistuna prosentteina vasemman kammion pinta-alasta) ei havaittu eroja anakinra- ja suolaliuoksella käsiteltyjen hiirten välillä (31±2 % vs. 33±2 %; P=0,81; Kuva 1). Interstitiaalinen fibroosi peri-infarktialueella oli minimaalista sham-operaatiohiirissä (<0,1 %), mutta sitä esiintyi enemmän anakinra- ja suolaliuoksella käsitellyissä hiirissä ilman merkittäviä eroja ryhmien välillä (13±2 % vs. 15±3 %; P=0,58; kuva 1). Löysimme minimaalisen määrän sydänlihaksen kalsiumkerrostumia von Kossa -värjäyksellä 1 viikko AMI:n jälkeen (<0,1 %) ilman eroja anakinra- ja suolaliuoksella käsiteltyjen hiirten välillä.

LV:n uudelleenmuodostus ja toiminta

Preinterventiota edeltävät LVEDD- ja LVESD-arvot olivat samankaltaisia kaikissa hiiri- ja rottien ryhmissä. Merkittäviä lisäyksiä LVEDD:ssä ja LVESD:ssä ja vähennyksiä etuseinän diastolisessa paksuudessa, etuseinän systolisessa paksuudessa ja FS:ssä suolaliuoksella käsitellyissä hiirissä (verrattuna lähtötilanteeseen ja sham ) havaittiin päivänä 7 (kuva 3). Suolaliuoksella käsiteltyihin hiiriin verrattuna anakinra-käsitellyillä AMI-hiirillä LVEDD:n ja LVESD:n lisäykset ja FS:n lasku olivat huomattavasti pienempiä päivänä 7 verrattuna lähtötilanteeseen. Myös etuseinän systolisen paksuuden lasku oli yleensä pienempi anakinra-käsitellyillä hiirillä (verrattuna suolaliuoksella käsiteltyihin eläimiin), mikä osoittaa suojaavan vaikutuksen peri-infarktin alueella, kun taas takaseinän diastolisen paksuuden (0,96±0,08 vs. 0,78±0,11; P=0,86) ja takaseinän systolisen paksuuden (1,32±0,08 vs. 1,14±0,12; P=0,44) osalta emme havainneet merkittäviä eroja. Anakinra-käsitellyillä hiirillä oli myös lyhyempi isovolumetrinen supistumisaika (6±4 vs. 16±5 ms; P=0,022) ja isovolumetrinen relaksaatioaika (12±5 vs. 29±8 ms; P=0,042) ja näin ollen pienempi Tei-indeksi (joka kuvastaa sydänlihaksen suorituskykyä) (0,28±0,03 vs. 0,66±0,07; P=0,044; Kuva 3). FS/Tei-indeksi, joka korreloi vielä tarkemmin dP/dt:n invasiivisten mittausten kanssa,19 oli myös merkittävästi korkeampi anakinra-käsitellyillä (0,74±0,06 verrattuna suolaliuoksella käsiteltyihin 0,17±0,02; P=0,008) AMI-hiirillä. Suolaliuoksella ja anakinralla käsiteltyjen sham-operaatiohiirien välillä ei havaittu eroja (kuva 3).

Rotta-mallissa havaittiin samankaltainen vaikutus LVEDD:hen ja LVESD:hen (kuva 4). LVEDD:n ja LVESD:n keskimääräinen prosentuaalinen kasvu oli merkittävästi suurempi hiirillä kuin rotilla riippumatta hoitohaarasta (P<0,001). LVEDD- ja LVESD-muutosten absoluuttinen vähennys anakinralla oli merkittävästi suurempi hiirillä kuin rotilla (P<0,001); LVEDD- ja LVESD-muutosten prosentuaaliset vähennykset olivat kuitenkin samankaltaisia hiirillä (56±6 % ja 53±5 %) ja rotilla (68±7 % ja 47±4 %; P=0,66 ja P=0,32), mikä osoitti, että välittömällä ja viivästetyllä annostelulla oli samanlaiset vaikutukset.

Leukosyyttien infiltraatio

Leukosyyttien määrässä 1 mm2 sydänlihaksen sydänlihaksen 1 mm2:ä kohti infarktialueella ei havaittu eroja anakinralla ja suolaliuoksella käsitellyillä AMI-eläimillä (kuva 4). Apoptoosin määrä granulaatiokudoksessa 1 viikko AMI:n jälkeen oli samanlainen anakinra- ja suolaliuosta saaneilla hiirillä (kuva 4). Leukosyyttejä ei ollut käytännössä lainkaan etäällä sijaitsevilla sydänlihaksen alueilla eikä näennäisleikatuissa eläimissä.

Sytokiinitasot

IL-1β:n, IL-6:n, tuumorinekroositekijä-α:n ja interferoni-γ:n plasmapitoisuuksissa ei havaittu merkitseviä eroja (kuva 4).

MMP-aktiivisuus

Aktiivista MMP-9:ää ei ollut käytännössä havaittavissa näennäisleikatuissa eläimissä, kun taas AMI:n saaneissa hiirissä sitä havaittiin johdonmukaisesti 7 päivää leikkauksen jälkeen. Aktiivisen MMP-9:n pitoisuuksissa ei havaittu eroa suolaliuoksella ja anakinralla käsiteltyjen AMI-hiirten välillä (kuva 4).

Anakinran in vitro anto

Apoptoosi

Kardiomyosyyttien inkubaatio anakinralla (2.5×10-12 g/ml) ”simuloidun reperfuusion” aikaan (40 minuutin ”simuloidun iskemian” jälkeen) liittyi merkittävään 36 %:n apoptoosin vähenemiseen (11,2 ± 0,5 % vs. 17,5 ± 0,1 % kontrollissa). Anakinran pitoisuuksien kasvattaminen (×100) 25×10-6 g/ml:iin asti ei vähentänyt apoptoosia lisää, kun taas alle 25×10-12 g/ml:n pitoisuuksilla ei ollut vaikutusta apoptoosiin (kuva 5).

Anakinran lisääntynyt solujen otto hypoksian aikana

Normoksiaan verrattuna anakinran otto hypoksian aikana lisääntyi merkitsevästi, ja se näkyi ≈95 %:ssa soluista hypoksian aikana (verrattuna 35 %:iin normoksian aikana; P=0,048; kuva 6).

Kaspaasi-1- ja -9-aktiivisuuden esto

In vitro anakinra (100-900 nmol/l) esti kaspaasi-1- ja -9-aktiivisuutta merkitsevästi ≈50 %:lla (P<0,001 kaikkien pitoisuusarvojen osalta kontrolliin nähden) ilman eroja eri pitoisuuksien välillä. Anakinra käyttäytyi kilpailevan ja ei-kilpailevan entsyymi-inhibiittorin sekoituksena kaspaasi-1:n (Ki, 0,201 μmol/l; Kic, 0,239 μmol/l; Kuc, 0,231 μmol/l) ja kaspaasi-9:n (Ki, 0,31 μmol/l; Kic, 0,34 μmol/l; ja Kuc, 0,28 μmol/l) osalta. IL-1Ra:ta estävien vasta-aineiden lisääminen kumosi anakinran aiheuttaman kaspaasi-1:n ja -9:n eston (kuva 7). Koprezipitaatiomääritys vahvisti anakinran ja kaspaasi-1:n ja -9:n välisen fyysisen vuorovaikutuksen ja sitoutumisen (kuva 7).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitetaan ensimmäistä kertaa, että ihmisen eksogeeninen rekombinantti IL-1Ra anakinra, jota annetaan ensimmäisten 24 tunnin kuluessa AMI:stä, parantaa merkittävästi sydämen remodelingia vähentämällä kardiomyosyyttien apoptoosia kahdessa erilaisessa eläinmallissa, joissa on ollut pysyvän infarktin aiheuttama valtimotiehyen tukkeutuminen, ja että anakinralla on suora antiapoptoottinen vaikutus kardiomyosyytteihin in vitro.

IL-1Ra:n biologia

IL-1Ra:ta pidetään akuutin faasin reaktanttina.3,4,4 Tällä hetkellä endogeenisen IL-1Ra:n rooli tulehduksessa on epäselvä. IL-1Ra sitoutuu IL-1-reseptoriin ja on siten IL-1:n aktiivisuuden kilpaileva estäjä, joka mahdollisesti käyttäytyy tulehdusta ehkäisevänä aineena.3 Koska IL-1 kuitenkin sitoutuu reseptoriinsa suuremmalla affiniteetilla ja reseptoreita on ylimäärin (varareseptorivaikutus), endogeenisen agonistin rooli näyttäisi olevan rajallinen.3 IL-1Ra:n geeni on biologiassa hyvin säilynyt, eikä lajinsisäisiä eroja ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa testasimme kahta yleisintä jyrsijälajia ja raportoimme samankaltaisia vaikutuksia.

IL-1Ra AMI:ssä

IL-1Ra-pitoisuudet kohoavat merkittävästi sydänlihaksen iskemia-reperfuusion jälkeen.7 Sen pitoisuudet kohoavat varhaisessa vaiheessa potilailla, joilla on ST-segmentin kohoamista aiheuttava AMI,5 ja mitä suurempi on riskissä olevan sydänlihaksen pinta-ala, sitä voimakkaampi on IL-1Ra-pitoisuuksien nousu.6 Lisäksi havainnointitutkimuksissa korkeammat IL-1Ra-pitoisuudet akuuttia sepelvaltimotautioireyhtymää sairastavilla potilailla liittyivät epäsuotuisaan lopputulokseen.20,21 Epäselväksi jäi, oliko IL-1Ra vaurion merkkipaalu, yritys suojata sydäntä tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen avulla vai vaurion välittäjä. IL-1Ra:n yliekspressio rotan globaalin iskemia-reperfuusiomallissa osoitti ensimmäistä kertaa IL-1Ra:n kardioprotektiivisen vaikutuksen, jonka seurauksena kardiomyosyyttien apoptoosi väheni noin 50 prosentilla8 .

Exogeeninen IL-1Ra

Rekombinantti ihmisen IL-1Ra (anakinra) on kaupallisesti saatavilla (Amgenin valmistama), elintarvike- ja lääkevirasto on hyväksynyt sen, ja sitä käytetään suurella määrällä potilaita nivelreuman hoitoon.22-24 IL-1:n rooli nivelreuman patogeneesissä on keskeinen. Anakinran systeemisen annostelun on osoitettu olevan turvallista ja tehokasta nivelreumapotilailla, mikä johtaa taudin aktiivisuuden muuttumiseen. Anakinraa koskeva kliininen tutkimus akuuttia sepelvaltimotautioireyhtymää sairastavilla potilailla on meneillään, mutta tuloksia ei ole vielä saatavilla.25 Äskettäin julkaistussa vaiheen II tutkimuksessa 17 iskeemistä aivohalvausta sairastavaa potilasta hoidettiin anakinralla, joka annettiin 100 mg:n bolusannoksena, jota seurasi 72 tunnin infuusio; muut 17 potilasta saivat vastaavaa lumelääkettä.26 Anakinralla ei havaittu olevan lääkkeisiin liittyviä haittoja, ja toissijaisessa analyysissä havaittiin, että siihen liittyi useampi potilas, jolla oli aivohalvaukseen liittyvä invaliditeetti oli minimaalinen tai se oli olematon. Kokeellisissa aivohalvausmalleissa eläimillä anakinraan liittyi apoptoosin väheneminen, tulehduksen väheneminen ja käyttäytymistulosten paraneminen.27,28

Vaikutusmekanismi

Tarkka mekanismi, jolla anakinra saa aikaan suotuisat vaikutuksensa, ei ole täysin selvä. Hyväksytty näkemys on, että suurina annoksina annettu anakinra kilpailee IL-1:n kanssa ja vähentää IL-1:n aktiivisuutta. Anakinra sitoutuu tyypin I IL-1-reseptoriin, mutta estää solunsisäisen signaalin siirtymisen estämällä IL-1-reseptorin ja IL-1:n apuproteiinin välisen vuorovaikutuksen. IL-1Ra:n on osoitettu vähentävän IL-1-riippuvaista prostaglandiini-E2:n eritystä, joka voi olla suoraan vastuussa solutoksisuudesta ja apoptoosista.3,29 Epäselväksi on jäänyt, vaikuttaako anakinra pääasiassa tulehdussoluista peräisin olevaan IL-1:een vai paikallisesti parakriinisesti tai autokriinisesti vapautuvaan IL-1:een ja vaikuttaako se suoraan soluun IL-1-reseptoriin kohdistuvasta vuorovaikutuksestaan riippumatta. IL-1Ra:n solunsisäinen vaikutus on riippumaton IL-1:n solunsisäisestä signalointireitistä,30 ja IL-1Ra:n aktiivinen transmembraanikuljetus P2X7-purinergisen kanavareseptorin kautta on kuvattu.31 In vitro havaitut vaikutukset, joissa viljellään vain kardiomyosyyttejä, viittaavat siihen, että anakinran vaikutukset sydänlihakseen ovat ainakin osittain riippumattomia tulehduksellisen infiltraatin esiintymisestä. Näin ollen emme havainneet anakinran vaikutuksia verenkierron sytokiinitasoihin, sydänlihaksen leukosyytti-infiltraattiin tai MMP-9-aktiivisuuteen tässä kokeellisessa mallissa. IL-1Ra:n antiapoptoottisia vaikutuksia on jo raportoitu neuroneissa ja epiteelisoluissa.32,33 Nämä vaikutukset ovat ilmeisiä in vivo ja in vitro, mikä viittaa IL-1Ra:n parakriiniseen tai autokriiniseen vaikutukseen.32,33 Tässä raportoimme anakinran soluihin imeytymisestä iskemian aikana, anakinran ja kaspaasi-1:n ja -9:n välisestä sitoutumisesta sekä kaspaasi-1:n ja -9:n aktiivisuuden huomattavasta estämisestä anakinralla. In vitro saadut tiedot, vaikka ne ovatkin vain hypoteeseja in vivo -tapahtumista mallien luontaisten rajoitusten vuoksi, viittaavat siihen, että hypoksian aiheuttaman apoptoosin kynnysarvo nousee anakinran vaikutuksesta.

Osoitamme, että anakinran varhainen (välitön) tai viivästynyt (24 tuntia myöhemmin) anto vähentää apoptoosia ja ehkäisee sydämen laajentumista AMI:n jälkeen. Annoksella, jonka osoitettiin estävän apoptoosia ja ehkäisevän dilataatiota (1 mg/kg), anakinra ei vaikuttanut infarktin kokoon, kun se annettiin varhain, ja samanlaisia hyötyjä uudelleenmuodostukseen nähtiin anakinrasta, joka annettiin 24 tuntia AMI:n jälkeen, mikä vastaa infarktin säästämisestä riippumatonta vaikutusta sydämen uudelleenmuodostukseen. IL-1Ra:n suotuisat vaikutukset eläinperäisissä aivohalvausmalleissa ovat myös ainakin osittain ajasta riippumattomia.34 Kuten aivohalvauskirjallisuudessa on jo todettu, infarktia säästävä vaikutus havaittiin kuitenkin 100-kertaisella suuremmalla anakinra-annoksella. Sitä, johtaisiko infarktin koon pieni mutta merkittävä pieneneminen suuremmilla annoksilla kliinisesti merkitykselliseen hyötyyn sydämen vajaatoiminnan tai eloonjäämisen kannalta, ei tiedetä, ja se vaatii lisätutkimuksia.

IL-1Ra-hoidon optimaalista kestoa AMI:n jälkeen ei tunneta. Mallissa, jossa verisuonten seinämän vastetta vammalle selvitettiin, 28 päivän ajan annetulla IL-1Ra-valmisteella oli suurempi vaikutus kuin 14 päivän ajan annetulla IL-1Ra-valmisteella.35 Huomionarvoista on, että rebound-vaikutuksia ei havaittu IL-1Ra-hoidon lopettamisen jälkeen.35

Kaspaasien rooli iskemiassa ja sydämen vajaatoiminnassa

Kaspaasit ovat proteaaseja, jotka osallistuvat apoptoottiseen ja tulehduskaskadiin.36-40 Kaspaasi-3 on keskeinen välittäjä apoptoottisessa kaskadissa, joka johtaa DNA:n fragmentoitumisesta ja sytoskeletin rakenneproteiinien pilkkomisesta vastaavien sekundaaristen efektoreiden aktivoitumiseen. Kaspaasi-1:tä, joka tunnetaan myös interleukiini-1:tä konvertoivana entsyyminä, pidetään proinflammatorisena kaspaasina, koska se muun muassa muuntaa pro-IL-1β:n IL-1β:ksi. Kaspaasi-1 on kuitenkin myös yksi niistä entsyymeistä, jotka pilkkovat pro-kaspaasi-3:a, mikä johtaa sen aktivoitumiseen.36-40 Kaspaasi-3 aktivoituu yleensä muiden kaspaasien, kuten kaspaasi-9:n, jolla on keskeinen rooli mitokondriaalisessa reitissä, kaspaasi-8:n, joka osallistuu lähinnä reseptorivälitteiseen apoptoosiin, ja kaspaasi-1:n pilkkomisesta. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että kaspaasi-1:n aktiivisuuden estäminen liittyy vähentyneeseen apoptoosiin ja suotuisampaan uudelleenmuodostukseen AMI:n jälkeen IL-1:n pitoisuuksista riippumatta.38,39 Koska IL-1 on kaspaasi-1:n substraatti, testasimme, voisiko IL-1Ra vaikuttaa suotuisasti suoraan solunsisäisesti estämällä kaspaasi-1:tä.40 Näin ollen kuvaamme ensimmäistä kertaa, että anakinra sitoutuu kaspaasi-1:een in vitro ja estää sen aktiivisuutta merkittävästi. Anakinran suorittama kaspaasi-1:n suora inhibitio saattaa ainakin osittain olla vastuussa sen tulehdusta ehkäisevistä ja antiapoptoottisista vaikutuksista. Anakinralla voi kuitenkin olla antiapoptoottisia vaikutuksia, jotka johtuvat epäsuorasta vaikutuksesta kaspaasi-1:n aktiivisuuteen estämällä kaspaasi-1:n translokaatiota ytimeen ja estämällä siten apoptoosia41 tai estämällä kaspaasi-9:n toimintaa. Kaspaasi-9 on keskeinen mitokondriaalisen reitin välittäjä, joka johtaa apoptoosin aktivoitumiseen hypoksian/iskeemian aikana.37 On vielä selvitettävä, onko kaspaasi-1:n vai -9:n estämisellä suurempi merkitys anakinrasta havaittuun hyötyyn. Tässä tutkimuksessa testatulla annoksella anakinralla oli todennäköisesti samankaltaisia estäviä vaikutuksia molempiin kaspaaseihin, ja eri kaspaasien välisestä ristikkäisvaikutuksesta apoptoosikaskadissa on raportoitu36.-41

Anakinran farmakokinetiikka ja annos-vaikutus-vaste

25 terveellä vapaaehtoisella tehdyssä vaiheen I tutkimuksessa 25:llä terveellä vapaaehtoisella tehdyssä tutkimuksessa anakinran kerta-annos samanlaisella annoksella kuin tässä tutkimuksessa käytetty annos (1 mg/kg) laskimonsisäisesti annettuna johti plasman pitoisuuksiin, jotka olivat 3,1 μg/ml, ja puoliintumisaikaan, jonka kesto oli 2,64 tuntia.42 In vivo emme havainneet merkittäviä vaikutuksia infarktin kokoon, kun käytimme anakinraa enintään 10 kertaa suositeltua annosta suuremmalla annoksella, mutta havaitsimme infarktin koon pienen mutta merkittävän pienenemisen, kun käytimme 100 kertaa suurempaa annosta. On epävarmaa, johtaako tämä infarktia säästävä vaikutus, joka liittyy näin suureen annokseen, suotuisaan pitkäaikaistulokseen, ja se edellyttää lisätutkimuksia. In vivo pitoisuuteen, joka oli >106 pienempi kuin ihmisillä havaittu plasman huipputaso, liittyi merkittävä apoptoosin väheneminen. Pienemmät annokset eivät olleet tehokkaita, kun taas suuremmilla annoksilla ei ollut lisävaikutuksia. Nämä tiedot ovat sopusoinnussa anakinran kliinisen profiilin kanssa, jossa käytetään yleensä 1 mg/kg:n standardiannosta ja suurempiin annoksiin liittyy enemmän paikallisia haittavaikutuksia ilman merkittävää kliinistä lisähyötyä.22-24 Tuoreessa tutkimuksessa43 anakinraa annosteltiin 100 mg:n annoksella (vastaa karkeasti 1 mg/kg) haiman β-solujen apoptoosin estämiseksi, ja sen osoitettiin olevan hyvin siedetty ja liittyvän indekseihin, jotka osoittivat β-solujen paremman toiminnan lumelääkkeeseen verrattuna ilman, että se vaikutti insuliiniherkkyyteen.

Ischemia, apoptoosi ja sydämen vajaatoiminta AMI:n jälkeen

Havainto apoptoosin ja remodelingin välisestä yhteydestä tukee käsitystä apoptoosista keskeisenä sydämen remodelingin välittäjänä infarktin koosta riippumatta.1,37,44 Se, että sen vaikutuksissa apoptoosiin tai remodelingiin ei ollut eroja välittömän ja viivästetyn hoitostrategian välillä ja että 1 mg/kg:n annoksella ei ollut vaikutuksia infarktin kokoon, viittaa siihen, että anakinra vaikuttaa erityisesti subakuuttiin infarktin jälkeiseen remodelingiin, jossa apoptoosilla tiedetään olevan merkittävä rooli,1,36,43 vaikuttamatta infarktin paranemiseen, matriksin hajoamiseen ja fibroosiin tai edistämättä seinämän repeämistä.

Johtopäätökset

Anakinran antaminen 24 tunnin kuluessa AMI:stä parantaa infarktin jälkeistä remodelingia estäen samalla apoptoosia. Huolimatta tämän tutkimuksen rajoituksista (kuten suhteellisen pieni otoskoko, joka rajoittui miesten sukupuoleen, kiinnostavien tulosten määrittäminen yhdellä kertaa ja kaikukardiografian käyttö, joka on edelleen suboptimaalinen ja operaattorista riippuvainen menetelmä LV:n remodelingin ja toiminnan arvioimiseksi), havainnot 24 tunnin kuluessa AMI:stä annettavan eksogeenisen IL-1Ra:n (anakinra) suotuisasta vaikutuksesta voivat avata uuden terapeuttisen ikkunan iskeemisen vamman ja remodelingin hoitoon iskeemisen sydämen vajaatoiminnan ennaltaehkäisyä ja hoitoa varten.

Footnotes

.