Analyyttinen herkkyys, toiminnallinen herkkyys

Minkä tahansa analyysimenetelmän perusominaisuuksia on pienin pitoisuus, joka voidaan mitata luotettavasti. Useita termejä ja käsitteitä on käytetty kuvaamaan pienintä pitoisuutta, jonka immunomääritys voi ilmoittaa, ja tämä termien moninaisuus voi olla aidosti hämmentävää. Seuraavassa käsitellään joitakin näistä termeistä ja sitä, miten ne liittyvät peruskysymykseen vastaamiseen: Mikä on pienin pitoisuus, jonka voin ilmoittaa tällä määrityksellä?
Analyyttinen herkkyys
Analyyttisen herkkyyden virallinen määritelmä on ”pienin pitoisuus, joka voidaan erottaa taustahälystä”. Tätä pitoisuutta kutsutaan asianmukaisesti määrityksen havaitsemisrajaksi, mutta tavallisimmin siihen viitataan herkkyytenä. Tyypillisesti tämä arvo määritetään analysoimalla toistoja näytteestä, jossa ei tiedetä olevan analyyttiä. Sitten näiden toistojen mitattuja lukumääriä (CPS) käytetään keskiarvon ja keskihajonnan (SD) laskemiseen. Analyyttinen herkkyys määritetään pitoisuutena, joka vastaa nollanäytteestä saatujen lukumäärien keskiarvoa lisättynä 2 SD:llä immunometrisissä määrityksissä ja keskiarvolla vähennettynä 2 SD:llä kilpailukykyisissä määrityksissä. Tämä on julkaistu IMMULITE®- ja IMMULITE® 2000-pakkausselosteiden kohdassa ”Analyyttinen herkkyys”.
Todellisessa maailmassa analyyttisellä herkkyydellä on rajallinen käytännön arvo. Todellinen rajoitus on se, että missä tahansa määrityksessä epätarkkuus kasvaa hyvin nopeasti konsentraation pienentyessä. Tämä ilmiö on helposti havaittavissa, kun tarkastellaan määrityksen tarkkuusprofiilia, joka on graafinen esitys siitä, miten määrityksen epätarkkuus muuttuu mitatun pitoisuuden myötä. (Katso esimerkkejä kuvista 1 ja 2.)

Kuva 1. Edustava DPC-tarkkuusprofiili.

Kuva 2. Edustava DPC-tarkkuusprofiili. Huomaa, että ”kolmannen sukupolven” TSH-määrityksiltä edellytetään määritelmän mukaan toiminnallista herkkyyttä alueella 0,01-0,02 µIU/ml.1,2
Ei ainoastaan analyyttisellä herkkyydellä, vaan jopa huomattavasti sitä suuremmilla pitoisuuksilla epätarkkuus voi olla niin suurta, että tulokset eivät toistu riittävän hyvin, jotta niistä olisi todellista kliinistä hyötyä. Näin ollen analyyttinen herkkyys ei yleensä edusta pienintä mitattavissa olevaa pitoisuutta, joka on kliinisesti käyttökelpoinen.
Tämä analyyttisen herkkyyden rajoitus on aina ollut olemassa RIA:n ja IMMULITE:n osalta, ja se koskee kaikkien valmistajien kaikkia menetelmiä. Koska potilasnäytteitä ei tyypillisesti ajeta toistoina, toistettavuuden puute ei välttämättä ole helposti havaittavissa rutiinitesteissä. Tulosten laatuun ja käyttökelpoisuuteen se kuitenkin vaikuttaa. Tämän vuoksi IMMULITE- ja IMMULITE 2000 -ohjelmistojen raportointialueen alaraja asetetaan usein pitoisuuteen, joka ylittää analyyttisen herkkyyden. DPC asettaa jokaisen määrityksen raportointirajat sellaisiksi, että ne ovat kattavan arvioinnin mukaan määrityksen tehokkaan ja luotettavan suorituskyvyn vaihteluväli suhteessa sen aiottuun kliiniseen käyttöön.
Analyyttisen herkkyyden rajoitukset kliinisesti tehokkaan määrityksen suorituskyvyn alarajan kuvaamisessa johtivat toisen käsitteen kehittämiseen.
Funktionaalinen herkkyys
Runsas vuosikymmen sitten reagoidakseen analyyttisen herkkyyden rajalliseen käyttökelpoisuuteen määrityksen suorituskyvyn mittarina ryhmä TSH-määrityksiä arvioivia tutkijoita kehitti käsitteen, jota he kutsuivat funktionaaliseksi herkkyydeksi.1 He määrittelivät sen ”alimmaksi pitoisuudeksi, jolla määritys voi antaa kliinisesti hyödyllisiä tuloksia”. Kliinisesti hyödyllisiksi tuloksiksi TSH:n osalta katsottiin hyvä tarkkuus, jonka päivittäinen vaihteluväli on enintään 20 %. Vaikka tämä CV-rajan valinta oli jossain määrin mielivaltainen, tutkijat katsoivat, että TSH:n osalta 20 %:n CV oli suurin epätarkkuus, joka voitiin sietää kliinisissä tarkoituksissa.1
Koska CV on keskihajonta ilmaistuna prosentteina keskiarvosta, 20 %:n CV tarkoittaa, että SD olisi 20 % keskiarvosta. Esimerkiksi näytteessä, jonka TSH-pitoisuus on 0,1 µIU/ml, vaihteluväli, joka kattaa 95 % toistetun analyysin odotetuista tuloksista, olisi ± 40 % (± 2 SD) eli 0,06 µIU/ml – 0,14 µIU/ml.
Vaikka alun perin kehitettiinkin vain TSH-määrityksiä varten, funktionaalisen herkkyyden käsitettä ja 20 prosentin vaihteluväliä kliinisen käyttökelpoisuuden rajana on sovellettu laajalti muihin immunomäärityksiin. Käsite on saavuttanut hyväksynnän, koska se antaa laboratoriolle objektiivisen ja kliinisesti merkityksellisen osoituksen määrityksen käytännön alarajasta.
Uutta määritystä kehitettäessä DPC käyttää periaatteessa samaa lähestymistapaa ja arvioi sekä tarkkuutta että oikeellisuutta määrittääkseen pitoisuudet, joilla kliinisen käyttökelpoisuuden rajat todennäköisesti saavutetaan. Ohjelmiston raportointialue perustuu tähän arviointiin. Etenkin kilpailevissa määrityksissä analyyttisen herkkyyden ja alemman raportointirajan välillä on yleensä merkittävä ero. IMMULITE- ja IMMULITE 2000 -ohjelmistoissa määritetty raportointialue edustaa DPC:n suositusta CLIA:n 88* ”raportoitavaksi alueeksi”, joka on pitoisuusalue, jolla määrityksen suorituskyky dokumentoidaan päteväksi.
Määrityksen suorituskyvyn todentaminen
Tällä hetkellä Yhdysvalloissa automaattisia immunomääritysjärjestelmiä käyttävien laboratorioiden ainoa herkkyyteen liittyvä suorituskykyominaisuus, joka CLIA’88:n mukaan laboratorion on todennettava, on raportoitavan alueen alaraja. Jotkin laboratoriot voivat myös halutessaan arvioida uuden määrityksen toiminnallisen herkkyyden, ja historiallisesti jotkut laboratoriot ovat halunneet todentaa analyyttisen herkkyyden. Kukin näistä arvioinneista on erilainen koe, jolla on erilaiset protokollat ja vaatimukset. Ensimmäiseksi on siis päätettävä, mitä halutaan todentaa, ja sen jälkeen on käytettävä asianmukaista protokollaa ja arvioitava tiedot sen mukaisesti.
Jos laboratorio päättää arvioida analyyttisen herkkyyden, tavoitteena on yleensä todentaa pakkausselosteessa kyseiselle suorituskykymittarille annettu arvo. On olennaista, että analyyttiseen herkkyystutkimukseen käytettävä näyte on todellinen nollapitoisuusnäyte, jossa on asianmukainen näytematriisi. Minkä tahansa muunlainen näyte voi vääristää tuloksia. Tavalliseen protokollaan kuuluu 20 nollanäytteen toistomäärän määritys, minkä jälkeen lasketaan CPS:n keskiarvo ja SD. Analyyttinen herkkyys arvioidaan pitoisuutena, joka on yhtä suuri kuin nollanäytteen keskiarvo plus 2 SD, kun kyseessä ovat immunometriset (”sandwich”) määritykset, kuten TSH, tai miinus 2 SD, kun kyseessä ovat kilpailevat määritykset, kuten T4. Tekniset palvelut voivat auttaa tämän pitoisuuden laskemisessa. Tällä menetelmällä saadaan alustava arvio, joka on yleensä riittävä vertailua varten pakkausselosteessa mainittuun analyyttiseen herkkyyteen. Vankan ja tarkan arvion saamiseksi tarvitaan kuitenkin useita kokeita, jotka kattavat useita pakkauseriä.
Toiminnallista herkkyyttä arvioitaessa tavoitteena on määrittää alin pitoisuus, joka vastaa laboratorion määrittelemää tavoitetta päivittäiselle (tutkimusten väliselle) epätarkkuudelle, joka edustaa tietyn määrityksen kliinisen käyttökelpoisuuden rajaa. Tavallisesti tavoitteena on käytetty 20 prosentin CV:tä, joka perustuu käsitteen alkuperäiseen soveltamiseen TSH:hon. Tämä CV ei kuitenkaan välttämättä ole aina sopivin raja. Joissakin määrityksissä yli 20 %:n CV voi olla yhdenmukainen kliinisesti luotettavien ja informatiivisten tulosten kanssa, kun taas toisissa määrityksissä alle 20 %:n CV voi olla kliinisen käyttökelpoisuuden raja. Suorituskykytavoite on asetettava kullekin määritykselle sen aiotun kliinisen käyttötarkoituksen perusteella.
Kun on määritetty kliinisesti käyttökelpoista toistettavuuden rajaa edustava päivittäinen CV, seuraava vaihe on arvioida pitoisuus, jolla CV saattaa saavuttaa tämän rajan. Aikaisempien tutkimusten, pakkausselosteen tietojen ja määrityksen tarkkuusprofiilista tehtyjen arvioiden perusteella tekniset palvelut voivat yleensä auttaa määrittämään ”tavoitealueen” pitoisuuksille, jotka rajaavat ennalta määritetyn CV:n rajan.
Todennäköisesti tämä tutkimus olisi suoritettava käyttämällä useita laimentamattomia potilasnäytteitä tai potilasnäytteiden yhdistelmiä, joiden pitoisuudet kattavat tavoitealueen. Näitä näytteitä voi kuitenkin olla vaikea saada. Kohtuullisia vaihtoehtoja ovat potilasnäytteet, jotka on laimennettu tavoitealueen ylittäviin pitoisuuksiin, tai vertailumateriaalit, jotka ovat tällä alueella tai lähellä sitä. Jos mitä tahansa näytetyyppiä on tarpeen laimentaa tutkimusta varten, käytettävä laimennusaine on ratkaisevan tärkeä. Rutiininomaiset näytelaimennusaineet on tarkoitettu vain hyvin suurikokoisten näytteiden laimentamiseen; joissakin määrityksissä niiden näennäinen pitoisuus voi olla mitattavissa, vaikkakin hyvin alhainen. Näiden laimennusaineiden käyttö voi vääristää tutkimustuloksia.
Näytteet olisi analysoitava toistuvasti useiden eri ajojen aikana, mieluiten päivien tai viikkojen aikana, päivittäisen tarkkuuden arvioimiseksi. (Yksittäinen 20 replikaatin ajo ei anna pätevää arviota funktionaalisesta herkkyydestä). Kun tiedot on kerätty, lasketaan CV kullekin testatulle näytteelle. Toiminnallinen herkkyys on pitoisuus, jossa CV saavuttaa ennalta määritellyn rajan. Tämä pitoisuus voidaan arvioida tutkimustuloksista interpoloimalla, jos se ei satu osumaan johonkin testatuista pitoisuuksista.
Raportoitavan alueen alarajan tarkistaminen on yksi osa koko raportoitavan alueen tarkistamista. Tämä tehdään tavallisesti tekemällä uusinta-analyysi kolmesta viiteen näytettä, joiden tunnetut pitoisuudet kattavat raportoitavan alueen. Nämä näytteet voidaan saada käyttämällä yhtä näytettä, jonka pitoisuus on lähellä vaihteluvälin ylärajaa ja joka sitten laimennetaan niin, että saadaan koko raportoitavan vaihteluvälin kattavia lisänäytteitä. Saadut tulokset arvioidaan sekä toistettavuuden että odotettujen arvojen palautumisen osalta sen määrittämiseksi, että määrityksen suorituskyky vastaa kliinisen käyttökelpoisuuden tarpeita koko raportoitavalla alueella.
Johtopäätös
Miksi sitten ohjelmiston raportointialueen alaraja on 1,0 µg/dl (13 nmol/l), kun pakkausselosteessa sanotaan, että herkkyys on 0,3 µg/dl (3,9 nmol/l)? Tässä esimerkissä määritys on kilpailullinen määritys, ja määrityksen epätarkkuus ylittää kliinisesti käyttökelpoiset rajat pitoisuudella, joka ylittää selvästi analyyttisen herkkyyden.
Jos epätarkkuus on niin suuri, että ei voida varmuudella sanoa, että esimerkiksi 0,4 µg/dl:n (5 nmol/l) ja 0,7 µg/dl:n (9 nmol/l) tulokset ovat itse asiassa erilaisia, eikö olisi parempi ilmoittaa molempien tuloksien olevan ”
Viime kädessä määrityksen havaitsemisraja (analyyttinen herkkyys) ei yleensä ole määrityksen havaitsemisraja, vaan pikemminkin tulosten toistettavuus, joka määrittää kliinisesti luotettavan määrityssuorituskyvyn alemman alarajan tavanomaisessa käytännössä.

1. Spencer CA. Kilpirauhasen profilointi 1990-luvulla: vapaan T4:n arvio vai herkkä TSH-mittaus. J Clin Immunoassay 1989; 12:82-9.
2. Spencer CA, et al. Interlaboratory/intermethod differences in functional sensitivity of immunometric assays of thyrotropin (TSH) and impact on reliability of measurement of subnormal concentrations of TSH. Clin Chem 1995;41:367-74. Uusintapainos (luettelonumero ZD060) saatavana DPC:ltä pyynnöstä.
*CLIA’88: Yhdysvaltain laki kliinisten laboratorioiden parantamisesta.