Antibiotic susceptibilities of indicator bacteria Escherichia coli and Enterocococci spp. jotka on eristetty ankoista Morogoron kunnassa Tansaniassa
Menetelmät
Tutkimusalue ja ankkanäytteenotto
Tämä poikkileikkaustutkimus tehtiin Morogoron kunnassa marraskuun 2014 ja maaliskuun 2015 välisenä aikana, ja näytteitä otettiin 100:sta myskisorsasta (Carina moschata), jotka olivat peräisin 26:sta takapihan parvesta. Tutkimussorsat valittiin satunnaisesti kustakin parvesta, ja näytteitä otettiin 5-10 prosenttia parven koosta. Näytteeseen valittiin 86 naaras- ja 14 urosankkaa. Ennen näytteenottoa kerättiin perustiedot hoidosta, ruokinnasta, käytöstä ja käyttämättömien antibioottien hävittämisestä kyselylomakkeella (lisätiedosto 1). Valitut ankat pidätettiin käsin, ja steriili pumpulipuikko työnnettiin kloaakkiin ulostemateriaalin keräämistä varten. Näytteet säilytettiin kylmälaatikossa jääpakkauksen kanssa, ja ne kuljetettiin Sokoinen maatalousyliopiston laboratorioon analysoitavaksi. Yhdenmukaisuuden vuoksi kaksi tutkijaa, jotka laboratorioteknikot olivat kouluttaneet lintujen pyyhkäisynäytteenottoon, ottivat näytteet kaikista sadasta ankasta.
E. coli- ja enterokokki-suvun eristäminen ja tunnistaminen
Fekaalinäytteet levitettiin MacConkey-agarille (Oxoid, Basingstoke, Iso-Britannia, Yhdistynyt kuningaskunta), ja niitä inkuboitiin 24 tuntia aerobisissa olosuhteissa E. coli -bakteerin eristämiseksi. Epäillyt pesäkkeet tunnistettiin edelleen pesäkemorfologian, Gram-värjäyksen ja biokemiallisten testien perusteella. Enterokokkien (Enterococci spp.) eristämiseksi näytteet levitettiin Slanetz-Bartley-agarille (Oxoid, Basingstoke, Yhdistynyt kuningaskunta) ja niitä inkuboitiin 48 tuntia aerobisissa olosuhteissa, minkä jälkeen ne tunnistettiin pesäkkeiden morfologian ja biokemiallisten testien perusteella. Eristämisen ja tunnistamisen aikana E. coli ATCC25922 ja Enterococcus faecium ATCC 2912 otettiin mukaan kontrollikannoiksi.
Antibioottiherkkyys
Kaikki E. coli- ja enterokokki-isolaatit testattiin antibioottiherkkyyden suhteen levydiffuusiomenetelmällä, ja ne tulkittiin CLSI:n mukaisesti. Mikrobilääkeherkkyys testattiin eräille antibiooteille, joita käytetään yleisesti ihmislääkinnässä Tansaniassa. E. coli -bakteerille testattiin neljä antibioottia ilmoitetuilla pitoisuuksilla: ampisilliini 10 µg, kefotaksiimi 30 µg, trimetopriimi-sulfametoksiini 25 µg ja tetrasykliini 30 µg. Enterokokkeja testattiin ampisilliinilla 10 µg, erytromysiinillä 15 µg, rifampiinilla 5 µg, tetrasykliinillä 30 µg ja trimetopriimi-sulfametoksiinilla 25 µg. Kaikki antibioottikiekot olivat peräisin Oxoidilta, Basingstoke, Iso-Britannia.
Eettiset näkökohdat
Luvan tämän tutkimuksen suorittamiseen antoi Morogoron kunnan karjankasvatuspäällikkö (Morogoro Municipal Livestock Officer), ja eettisen hyväksynnän tutkimukselle antoivat Tansanian Sokoine-maatalousyliopiston (Sokoine University of Agriculture, Tansania) eettiset komiteat. Jokaiselta viljelijältä saatiin suullinen suostumus ennen näytteenottoa.
Tulokset
Sadasta viljellystä ulostenäytteestä 91 prosentissa oli E. coli -bakteeria, joista 64:ssä (70,3 %) todettiin resistenssiä eri testatuille antibiooteille (taulukko 1). E. colin osoittamat moninkertaiset antibioottiresistenssit olivat seuraavat: 28 (30,8 %) isolaattia neljälle antibiootille, 35 (38,5 %) kolmelle antibiootille, 13 (14,3 %) kahdelle antibiootille ja 11 (12,1 %) isolaattia yhdelle antibiootille. Enterokokkeja eristettiin kaikista näytteistä, ja 42 prosenttia niistä oli resistenttejä eri testatuille antibiooteille. Viisi prosenttia enterokokki-isolaateista oli resistenttejä kaikille antibiooteille, 13 prosenttia neljälle antibiootille, 21 prosenttia kolmelle antibiootille, 26 prosenttia kahdelle antibiootille ja 28 prosenttia yhdelle testatulle antibiootille. Taulukossa 2 on yhteenveto ankkojen hoitoa ja niiden mahdollista pääsyä antibioottijäämiin koskevista tuloksista. Haastatelluista 26 viljelijästä 92,3 prosenttia hoiti ankkoja laajamittaisesti, jolloin ne pääsivät kaatopaikoille. Eläinlääkkeiden antamisesta ankoille ei raportoitu, mutta vastaajat ilmoittivat hoitavansa muita eläimiä käyttämällä tetrasykliinejä/oksitetrasykliiniä.
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa havaittiin, että E. coli -bakteerin eristysprosentti oli 91, kun taas kaikissa ankoissa esiintyi enterokokkeja, ja isolaateissa todettiin runsaasti monien eri antibioottien aiheuttamaa resistenssiä. Tämä tutkimus valottaa, että Tansaniassa vapaana olevien sorsien indikaattoribakteereja voidaan käyttää antibioottiresistenssitutkimuksissa. Tämä viittaa siihen, että antibioottiresistenssiongelma on laajalle levinnyt myös sellaisista eläimistä peräisin olevissa bakteeri-isolaateissa, jotka eivät saa antibioottihoitoa. Tällä on vaikutusta kansanterveyteen, koska ankat etsivät rehua kotiseutualueiden ympäriltä ja erittävät ulostettaan kaikkialle, ja vastustuskykyiset bakteerit voivat päästä ravintoketjuun ja vaikuttaa ihmisiin tai vastustuskykyinen geeni voi siirtyä patogeenisiin bakteereihin.
Tässä tutkimuksessa eristettyjen E. coli -bakteerien arvioitu antibioottiresistenssin esiintyvyys on vertailukelpoinen Malesiassa raportoidun resistenssin kanssa. Nigeriassa on raportoitu alhaisesta 8,6 prosentin esiintyvyydestä, joka johtuu todennäköisesti erilaisten antibioottien, kuten ofloksasiinin, nalidiksiinihapon ja gentamysiinin käytöstä . Tässä tutkimuksessa havaittu antibioottiresistenssin korkea esiintyvyys on todennäköistä, että ankat altistuvat jatkuvasti eläinten ja ihmisten päästöistä peräisin oleville antibioottijäämille, koska niitä käytetään laajalti. Tutkimukset osoittavat, että elintarvike-eläimissä käytetyt antibiootit imeytyvät huonosti suolistoon ja perusyhdisteet erittyvät ulosteeseen. Tätä tukevat useat tutkimukset, joissa on raportoitu suuria määriä antibioottijäämiä jätevesissä ja eläinjätteissä . Näin ollen haaska-ankkojen normaalifloora altistuu jatkuvasti antibioottijäämille, mikä saa ne kehittämään resistenssiä, kuten tässä tutkimuksessa havaittiin.
E. coli -bakteerin resistenssi ampisilliinille oli korkein (81 %) verrattuna muihin tutkimuksessa käytettyihin antibiootteihin, mikä vastaa aiempaa slovakialaista raporttia, jossa resistenssi oli 87,8 % . Yleisesti ottaen tutkimukset osoittavat, että 60-70 prosenttia E. coli -isolaateista on kehittänyt resistenssin ampisilliinille. Tämä voi johtua ampisilliinin liiallisesta käytöstä ihmisillä, jolloin sen jäämät ovat mahdollisia ympäristön saastumisen lähteitä siellä, missä ankat etsivät rehua. Sulfametoksiinin osalta todettu resistenssi oli 76 prosenttia, kuten Van Tuat oli aiemmin todennut. Tetrasykliinin antibakteerinen resistenssi oli tässä tutkimuksessa 59 prosenttia, kun se Slovakiassa oli 37,5 prosenttia ja Nigeriassa 75 prosenttia. Mielenkiintoista on, että E. coli osoitti antibakteerista resistenssiä myös kefotaksiimille (63 %), joka on antibiootti, jota ei yleisesti käytetä eläinten hoidossa Tansaniassa. Ankat voivat saada kefotaksiimijäämiä kaatopaikoilta, joissa on ihmisten ulosteita ja hävitettyjä lääkejäämiä (taulukko 2). Eri terveydenhuoltolaitosten viemäreistä eristetyillä bakteereilla on kuitenkin havaittu suurta resistenssiä kefotaksiimille .
Tutkimuksessa havaittiin myös E. coli -bakteerien moninkertaista resistenssiä useammalle kuin yhdelle antibiootille. Löydökset olivat liian suuria verrattuna Vietnamissa tehtyyn tutkimukseen, jossa E. colin moninkertainen antibioottiresistenssi neljälle antibiootille oli 16,7 %, kolmelle antibiootille 20 % ja kahdelle antibiootille 23,3 % . Tämä moninkertaisen lääkeresistenssin esiintyminen viittasi siihen, että kotieläimet toimivat vastustuskykyisten bakteerien säiliöinä ympäristön saastumisessa . On havaittu, että antibiooteille altistuneiden eläinten suolistosta eristettyjen bakteeripopulaatioiden todettiin olevan viisi kertaa todennäköisemmin resistenttejä jollekin antibiootille. Ei-resistentit bakteerit saavat tavallisesti kromosomien ulkopuoliset antibioottiresistenssiplasmidit (R-plasmidit) resistenteiltä bakteereilta, kun ne ovat läheisessä kontaktissa . Havaittu resistenssi voi johtua antibioottien järjettömästä käytöstä, joka aiheuttaa huomattavan määrän jäämiä ympäristöön. Muita resistenssin kehittymistä aiheuttavia tekijöitä voivat olla laajakirjoisten antibioottien helppo saatavuus ja runsas käyttö infektioiden oletetussa hoidossa jopa terveydenhuoltolaitoksissa. Antibioottien käyttöä koskevien säännösten täytäntöönpanon puute osana infektioiden torjuntaohjelmia on saattanut vaikuttaa merkittävästi resistenssitulosten kehitykseen.
Enterokokit ovat ihmisen ja eläinten suoliston luonnollisia vierasesineitä. Kaikkien tutkittujen ankkojen suoliston sisällössä oli enterokokkeja, jotka osoittivat 42 prosentin resistenssiä eri testatuille antibiooteille. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat kuitenkin suurta resistenssiä rifampisiinille (62 %), ampisilliinille (62 %) ja tetrasykliinille (42 %). Moniresistenssiä havaittiin myös yli 65 prosentilla isolaateista. Kuten aiemmin todettiin, bakteerien havaittu resistenssi eri antibiooteille, joita testattiin, vaikka lääkkeitä ei ollut käytetty ankoilla, saattoi johtua siitä, että ympäristöön joutuneet jäämät, jossa ankat haaskaavat ravintoa, voivat helposti altistua antibiooteille ja muille resistenteille bakteereille. Kun vastustuskykyiset bakteerit ovat kosketuksissa vastustuskyvyttömien bakteerien kanssa, geneettisen materiaalin vaihto voi tapahtua ja vastustuskykyinen geeni voi siirtyä niihin. Toisaalla tutkimuksissa on raportoitu, että ankoista eristetyt enterokokit osoittivat resistenssiä makrolideja ja linosamidi-antibiootteja vastaan. Enterokokit ovat kuitenkin luonnostaan vastustuskykyisiä useille antibioottiryhmille, kuten kefalosporiineille ja aminoglykosideille. Lisäksi monissa kannoissa on tarttuvia geneettisiä elementtejä, jotka aiheuttavat hankittua resistenssiä eri antibiooteille, kuten tetrasykliinille . Muita antibioottiresistenssitutkimuksia ankoista eristetyillä enterokokkeilla on tehty vankomysiini-antibiootilla . Enterokokki spp:n herkkyystutkimuksia vankomysiinille ehdotetaan tehtäväksi tulevaisuudessa, koska antibiootti on nykyään yleinen lääke Tansaniassa ihmislääkinnässä.
Kyselylomaketutkimus tukee edelleen laboratoriossa tehtyjä havaintoja E. coli- ja Enterokokki spp:n korkeasta resistenssiasteesta. Havaittiin, että antibiootteja käytetään laajalti eläinten ja ihmisten hoidossa. Riippumatta siitä, että eläinlääkkeitä ei käytetä duskeissa, laajamittainen haaskanhoitojärjestelmä altistaa ne ympäristölle, jossa on antibioottijäämiä ja muita antibiootteja saaneista eläimistä ja ihmisistä peräisin olevia bakteereja. Tätä tukevat havainnot, joiden mukaan havaitut resistenssit kohdistuivat ihmisillä ja eläimillä yleisesti käytettyihin antibiootteihin (taulukko 2). Resistenttejä bakteereja on eristetty useista eri lähteistä, kuten jätevesipäästöistä ja ympäristöstä . Lääkejäämät ja -astiat hävitettiin sattumanvaraisesti kotitalouksien lähiympäristöön, mikä voi altistaa ankat antibiootille. Siksi ankkojen intensiivinen hoitojärjestelmä voi auttaa minimoimaan lintujen tarpeettoman altistumisen antibioottijäämille.
Johtopäätökset
Yleisesti ottaen E. coli- ja Enterococcus spp. osoittama antibioottiresistenssi oli tässä tutkimuksessa korkea. Tämä osoittaa, että jatkuvasti antibiootteja käyttävillä kotieläimillä ja kanoilla on suuri merkitys antibioottiresistenssigeenien mahdollisina ensisijaisina lähteinä ankoista eristetyille bakteereille. Monille antibiooteille vastustuskykyisten E. coli- ja Enterococcus spp. -bakteerien eristäminen ankoista toimii antibiooteille vastustuskykyisten kantojen mahdollisina kantajina ihmisiin ja aiheuttaa vakavan ongelman kansanterveydelle.
Limiitit
Tässä tutkimuksessa käytettiin vain 100:aa ankkanäytettä, jotka kerättiin Morogoron kunnasta, mikä rajoittaa tulosten yleistettävyyttä edustaviksi tuloksiksi Tansanian ankoilla esiintyvän antibioottiresistenssin tilasta E. coli- ja Enterococcus-suvun keskuudessa. Myös testattujen antibioottien määrä oli vähäinen. Bakteerien antibioottiherkkyyden testaaminen levydiffuusiotestimenetelmällä saattaa olla huonompi vaihtoehto kuin liemi-mikrolaimennusmenetelmät. Tutkimuksessa ei myöskään määritetty resistenssin genotyyppejä E. coli- ja Enterococcus spp:ssä, jotka olivat resistenttejä erityyppisille antibiooteille. Muiden eläinten läsnäolo paikan päällä, jossa sorsanäytteet otettiin, vaikuttaa kuitenkin sekoittavina tekijöinä ankoista eristetyissä bakteereissa havaittuihin resistenssimääriin.