[Antigeenin talteenotto: sen merkitys ja haitat immunohistokemiassa]

Yksi immunohistokemian suurimmista ongelmista on ollut se, miten säilyttää sekä hyvä morfologia että antigeenien immunoreaktiivisuus kudosleikkeissä. Erilaisia tekniikoita antigeenien immunoreaktiivisuuden palauttamiseksi (unmasking) rutiininomaisten kudospreparaattien, kuten fiksaation, dehydraation ja upottamisen, jälkeen on kehitetty, ja ne ovat nyt tulossa käyttöön immunovärjäyksissä paitsi sytohistologisissa tutkimuksissa myös patokliinisissä diagnooseissa. Tässä raportissa tarkasteltiin ensin sekä fiksaation että antigeenin talteenoton mekanismeja ja merkitystä proteiinien inaktivoinnin näkökulmasta. Toiseksi tarkasteltiin eräitä käytännön ongelmia ja huomautuksia kahdesta suosituimmasta maskeeraustekniikasta, entsyymidigestiosta ja lämpöindusoidusta epitoopin talteenotosta (heat-induced epitope retrieval, HIER), jotta tekniikoita voitaisiin mukauttaa täsmällisesti immunohistokemiassa. Tärkein fiksaation aiheuttama artefakti on kudosantigeenien peittyminen, joka johtuu proteiinien aminohappojäämien ristisilloittumisesta. On tärkeää valita kullekin antigeenille sopiva kiinnitysolosuhde ottaen huomioon sen biokemiallinen luonne ja kiinnityksen kestävyys. (taulukko 2), ja pitämään kiinnitysolosuhteet mahdollisimman vähäisinä, jotta antigeenin immunoreaktiivisuus voidaan saada helposti esiin erilaisilla maskeerauksen poistotekniikoilla (taulukko 3, kuva 1). Antigeenin talteenotto sinänsä on prosessi, joka aiheuttaa proteiinien denaturoitumista kudoksissa, aivan kuten monet muutkin proteiinien inaktivointiprosessit (taulukko 1). Entsyymimädätys voi syövyttää antigeenin ympärillä olevat proteiinien peittävät osat, jolloin sen epitooppi paljastuu. Vaikka entsyymien pilkkominen on suhteellisen yksinkertaista ja sen käsittelyolosuhteita on helppo kontrolloida, tulokset eivät välttämättä ole dramaattisia ja johdonmukaisia entsyymityypeistä tai -eristä riippuen. Näin ollen on löydettävä oma digestio-ohjeensa parhaan värjäystuloksen saavuttamiseksi kullekin antigeenille (esim. taulukko 4). Esimerkiksi pepsiinidigestiolla saatiin parhaat tulokset bromodesoksiuridiinin (BrdU) ja proliferoivan solun ydinantigeenin (PCNA) immunovärjäyksessä, kun taas muilla entsyymeillä oli vain vähän vaikutusta (taulukko 5). Kuumentaminen voi myös pilkkoa polypeptidirunkoa ja häiritä fiksoinnissa syntyneitä ristisidoksia. Kuumentamisen vaikutus antigeenin talteenottoon on lämpötilariippuvainen ja näyttää olevan verrannollinen lämpötilan ja ajan tuloon. PCNA:n immunovärjäyksessä paraformaldehydillä fiksoiduissa parafiiniin kiinnitetyissä leikkeissä tarvittiin kuumentamista 90 C:ssa vähintään 3 minuutin ajan, mutta kuumentamisolosuhteiden tiukentuessa myös epäspesifiset taustavärjäytymät lisääntyivät (taulukko 6), mikä on yksi vakavimmista ongelmista antigeenin talteenotossa (kuvat 2a, c). Yksi mahdollinen vaihtoehto tällaisten ei-toivottujen tulosten välttämiseksi on epäoptimaalisen kuumennuksen (80 C:ssa 10-15 minuutin ajan) ja pepsiinin sulatuksen yhdistelmä (kuva 2b, d). Tärkeä teoreettinen näkökohta näin dramaattista denaturointimenetelmää käytettäessä on se, voidaanko peitetyt antigeeniepitopit paljastaa riittävästi ilman, että aiemmin luotetuilla vasta-aineilla saadaan vääriä positiivisia (tai vääriä negatiivisia) tuloksia. Näyttää siltä, että jokainen antigeeni vaatii ”räätälöidyn” kudosvalmisteen, jotta sen antigeenisyys ja tarkka lokalisointi säilyisivät optimaalisesti. Immunologian, molekyylibiologian, genetiikan tai embryologian kehityksen myötä moninkertaisen immunovärjäyksen tarve yhdessä muiden tekniikoiden, kuten in situ -hybridisaation, kanssa lisääntynee, jotta voidaan analysoida eri molekyylien välisiä spatiaalisia ja toiminnallisia suhteita in situ. Antigeenin talteenotosta tulisi tällöin tehokas strategia.