Ap-3-adapterikompleksi välittää hiivan ja nisäkkäiden PQ-silmukkaperheeseen kuuluvien…Perheeseen kuuluvien perusaminohappojen kuljettajien siirtymistä vacuolaariselle/lysosomaaliselle membraanille

Ypq1-proteiini voi päästä vacuolaariselle membraanille ALP:n tai endosomaalisen reitin kautta

Olen hiljattain raportoinut, että Ypq1-GFP-fuusioproteiini lokalisoituu vacuolaariselle membraanille6, pyrimme selvittämään, mitä kulkureittiä pitkin Ypq1 pääsee tähän lokeroon. Tyhjiökalvon proteiinit voivat päästä tyhjiöön kahta eri reittiä: ALP- (alkalinen fosfataasi) ja CPY-reittiä (karboksypeptidaasi Y), joista jälkimmäisessä proteiinit kulkevat endosomien kautta (kuva 2A). Testataksemme, kulkeeko Ypq1 CPY-reittiä, tutkimme sen solunsisäistä jakautumista pep12Δ-mutantissa, josta puuttuu t-SNARE, joka osallistuu vesikkelin fuusioon myöhäisen endosomin kanssa13. Tässä mutantissa Ypq1-GFP löytyi yksinomaan vakuolaarikalvolta (kuva 2B). Mutantissa vps27Δ, josta puuttuu endosomaalisen ESCRT-0-kompleksin komponentti, endosomien kautta kulkevat kalvoproteiinit pinoutuvat tyypillisesti selvästi näkyviin luokan E lokeroihin, jotka vastaavat epänormaalisti laajentuneita endosomeja, mutta Ypq1-GFP-proteiini kohdistui tässä mutantissa normaalisti vacuolaarikalvoon (tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että Ypq1 ei tarvitse toimivaa CPY-reittiä päästäkseen tyhjiöön. Tämän jälkeen testasimme, pääseekö Ypq1 vacuolaariseen kalvoon ALP-reitin kautta. On hyvin dokumentoitu, että tämä reitti edellyttää AP-3-adapterikompleksia, jonka oletetaan toimivan trans-Golgissa lajittelemassa lastiproteiineja vesikkeleihin, jotka sitten sulautuvat endosomeihin. Tämä kompleksi on heterotetrameeri, joka koostuu kahdesta suuresta alayksiköstä (β3a ja δ), keskikokoisesta alayksiköstä (μ3a) ja pienestä alayksiköstä (σ3), ja jos jokin näistä alayksiköistä puuttuu, AP-3-kompleksi on puutteellinen14. Siksi eristimme kaksi AP-3-puutteellista kantaa, apm3Δ (josta puuttuu alayksikkö μ3a) ja apl5Δ (josta puuttuu alayksikkö δ). Näissä mutanteissa Ypq1-GFP:tä löytyi vakuolaarikalvolta sekä pienistä pistemäisistä rakenteista, jotka leimattiin helposti FM4-64:llä ja joita ei havaittu villityypin soluissa (kuva 2B). Amp3Δ- ja apl5Δ-mutanttisoluissa, jotka ilmentävät myös toimivaa Sec7-mCherryä Golgin merkitsemiseksi, suuri prosenttiosuus näistä pistemäisistä rakenteista oli koristeltu Sec7-mCherryllä (Kuva 2C) (sublokalisaatiokuvioiden kvantitatiivinen määritys, ks. täydentävä kuva S1 verkossa). Nämä tulokset osoittavat, että kun ALP-reitti on puutteellinen, Ypq1:llä on taipumus kerääntyä Golgiin, kun taas merkittävä osa proteiinista pääsee vacuolaariseen kalvoon toisen reitin kautta. Testataksemme, onko jälkimmäinen CPY-reitti, määritimme Ypq1-GFP:n sijainnin apm3Δ pep12Δ- ja apl5Δ pep12Δ-kaksoismutanteissa (kuva 2B). Mielenkiintoista oli, että Ypq1-GFP:n kulkeutuminen vakuoliin oli suurelta osin heikentynyt näissä kannoissa, ja proteiini löytyi enimmäkseen hajallaan sytosolissa sekä Sec7-mCherryllä leimatuissa pistemäisissä rakenteissa (Kuva 2B,C) (sublokalisaatiokuvioiden kvantitatiivinen määritys, ks. verkossa oleva Täydentävä kuva S1). Näiden kaksoismutanttien vakuolit voitiin leimata normaalisti FM4-64:llä. Nämä tulokset osoittavat, että Ypq1 voi lajittua vakuolakalvolle sekä ALP- että CPY-reittien kautta. Villiintyneissä soluissa se käyttää pääasiassa ALP-reittiä, mutta kun tämä reitti on puutteellinen, proteiini viipyy pidempään Golgissa, mutta pääsee silti tehokkaasti vacuolakalvolle CPY-reitin kautta. Kun sekä ALP- että CPY-reitit ovat puutteellisia, pieni osa Ypq1-GFP:stä on havaittavissa tyhjiökalvolla, mikä viittaa siihen, että proteiini voi käyttää vielä toista reittiä, mutta sellaista, joka on paljon tehottomampi kohdentamaan Ypq1:n asianmukaisesti tyhjiöön.

Hapan dileusiinimotiivi edistää Ypq1:n lajittumista ALP-reitille

AP-3-riippuvainen transmembraaniproteiinien lajittuminen tapahtuu usein tyrosiinipohjaisten (YXXØ) tai dileusiinipohjaisten (XXXL) signaalien välityksellä (jossa Ø on tilaa vievä hydrofobinen jäännös ja X mikä tahansa aminohappo)15. Ypq1 sisältää EQQPLL-sekvenssin toisessa suuressa silmukassaan sytosoliin päin. Tämän motiivin dileusiinia edeltää proliini, mikä on havaittu useissa ALP-reittiä käyttävissä rahdissa16. Ypq1:n dileusiinista dialaniiniksi vaihtuneen mutantin (Ypq1LL>AA) havaittiin suuntautuvan vakuolaarikalvolle, mutta myös koristavan pistemäisiä rakenteita (kuva 3A). Tämä fenotyyppi muistuttaa sitä fenotyyppiä, joka havaittiin villityyppiselle Ypq1:lle AP-3-puutteellisissa soluissa, mikä viittaa siihen, että Ypq1LL>AA pääsee tyhjiöön vaihtoehtoisen CPY-reitin kautta. Tätä näkemystä tukee se, että pep12Δ-mutantissa tuotettu Ypq1LL>AA ei kohdistunut vakuoliin, vaan se missortoitui sytosolisiksi pistemäisiksi rakenteiksi, kuten Ypq1:lle havaittiin apm3Δ pep12Δ- ja apl5Δ pep12Δ-mutanteissa (kuva 3A). Nämä tulokset osoittavat, että Ypq1:n hapanta dileusiinimotiivia tarvitaan sen AP-3-riippuvaiseen lajittumiseen tyhjiöön, mutta ei sen Pep12-riippuvaiseen siirtymiseen tyhjiöön. Nämä johtopäätökset ovat yhdenmukaisia S. Emrin ja työtovereiden tämän käsikirjoituksen valmistelun aikana julkaiseman tuoreen tutkimuksen17 tulosten kanssa. Seuraavaksi tutkimme tarkemmin, miten Ypq1LL>AA-variantti kulkeutuu vakuoliin. Harkitsimme ensin mahdollisuutta, että koska tämä mutanttiproteiini ei pysty käyttämään ALP-reittiä, se saattaisi ensin missortoitua plasmakalvoon ennen nopeaa endosytoosia ja sen jälkeistä Pep12-riippuvaista kulkeutumista vakuolakalvoon. Havaintomme eivät tukeneet tätä mallia: Ypq1LL>AA ei kerääntynyt solun pinnalle endosytoosissa viallisessa end3Δ-mutaatiossa, mikä viittaa siihen, että se pääsee tyhjiöön CPY-reitin kautta (kuva 3B). Tämän jälkeen oletimme, että Ypq1LL>AA:n kulkeutuminen vakuoliin saattaisi edellyttää sen lajittelua Golgista endosomeihin vaihtoehtoisten adaptoreiden, kuten AP-1-kompleksin tai monomeeristen GGA-proteiinien, ansiosta. Ekspressoimme Ypq1LL>AA-mutanttiproteiinia gga1Δ gga2Δ-soluissa, joista puuttuvat redundantit Gga1- ja Gga2-adapterit, ja amp1Δ-, amp2Δ- ja apl4Δ-soluissa, joista puuttuu AP-1-kompleksin alayksiköitä. Jokaisessa näistä mutanteista proteiinin havaittiin edelleen pääsevän tyhjiöön (kuva 3B). Nämä havainnot viittaavat joko siihen, että nämä adaptorit toimivat redundantisti edistääkseen Ypq1LL>AA:n lajittumista tyhjiöön CPY-reitin kautta, tai siihen, että muut adaptorit ovat mukana.

Ypq2 ja Ypq3 kulkeutuvat myös tyhjiöön ALP-reitin kautta, mutta kokevat erilaisen kohtalon, kun ALP-reitti ei toimi

Ypq2- ja Ypq3-proteiinit, jotka ovat sekvenssiltään hyvin samankaltaisia Ypq1:n kanssa, lokalisoituvat niin ikään tyhjiökalvoon6 , ja kummassakin niistä on myös happoisa dileukiini sytosolisten silmukoiden toisessa silmukassa. Kuvan 4A tulokset osoittavat, että Ypq2 kulkeutuu normaalisti vakuoliin pep12Δ-mutantissa. Tämä osoittautui todeksi myös apm3Δ- ja apl5Δ-mutaatioissa, jotka ovat viallisia ALP-reitillä, joissa sen havaittiin lisäksi koristavan pistemäisiä rakenteita, mikä on fenotyyppi, jota ei havaittu villityypin soluissa. Suuri osa näistä pistemäisistä rakenteista oli myös leimattu Sec7-mCherryllä (kuva 4B), mikä osoittaa, että Ypq2:lla on Ypq1:n tavoin taipumus kertyä Golgiin, kun ALP-reitti on puutteellinen. Sekä apm3Δ pep12Δ- että apl5Δ pep12Δ-kaksoismutanteissa Ypq2 lokalisoitui suurelta osin väärin pieniin pistemäisiin sytosolirakenteisiin, joista monet oli koristeltu Sec7-mCherryllä, vaikka osa proteiinista näytti kulkeutuvan kunnolla vakuoliin (Kuva 4A,B) (sublokalisaatiokuvioiden kvantitatiivinen analyysi on verkossa olevassa täydentävässä kuvassa S2). Nämä tulokset osoittavat, että Ypq2 käyttäytyy Ypq1:n tavoin siten, että se käyttää ensisijaisesti ALP-reittiä päästäkseen tyhjiöön. Ne osoittavat myös, että kun tämä reitti on viallinen, Ypq2 viipyy pidempään Golgissa, mutta voi silti päästä vacuolaariseen kalvoon pääasiassa CPY-reitin kautta.

Koska YPQ3-GFP-geenin ilmentäminen YPQ3:n luonnollisen promoottorin ohjaamana tuotti hädin tuskin havaittavan määrän Ypq3-GFP:tä, ekspressoimme fuusiogeenin galaktoosi-indusoituvan promoottorin ohjaamana. Ypq3-GFP:n ylituotannosta johtuvan virheellisen lokalisoitumisen riskin vähentämiseksi soluja kasvatettiin ensin raffinoosilla, sitten lisättiin galaktoosia kolmeksi tunniksi ja lopuksi annettiin glukoosia kahdeksi tunniksi YPQ3-GFP-geenin transkription tukahduttamiseksi. Tämän ohimenevästi indusoituneen Ypq3-GFP:n, joka kertyi soluun tasolle, joka oli lähellä Ypq1-GFP:n endogeenista tasoa (ks. lisäyskuva S3 verkossa), havaittiin lokalisoituvan vakuolaarikalvolle (kuva 5A), mikä vastaa aiempia tuloksia6. Tämä vacuolaarinen lokalisaatio havaittiin myös pep12Δ-mutantissa. Apm3Δ- ja apl5Δ-mutanteissa Ypq3 kuitenkin missortoitui pääasiassa vakuolin luumeniin. Tämä missortoituminen oli riippuvainen Pep12:sta, sillä Ypq3 ei kohdentunut tyhjiöön apm3Δ pep12Δ- ja apl5Δ pep12Δ-kaksoismutanteissa (Kuva 5A) (sublokalisaatiokuvioiden kvantifiointi, ks. täydentävä kuva S4 verkossa). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Ypq3 käyttää Ypq1:n ja Ypq2:n tavoin pääasiassa ALP-reittiä päästäkseen vakuolaarikalvolle. Kun AP-3-kompleksin komponentit puuttuvat, Ypq3 ohjataan Pep12-riippuvaisella tavalla endosomeihin, joissa se lajittuu multivesicular body -reitille (MVB), jolloin se päätyy vacuolaariseen luumeniin. Tätä tulkintaa arvioitiin edelleen eristämällä Ypq3LL>AA-mutantti, jonka ei pitäisi olla AP-3-adapterikompleksin tunnistama. Villityypin soluissa Ypq3LL>AA-variantti oli selvästi missortoitunut vacuolaariseen luumeniin, mutta pep12Δ-mutantissa se ohjautui pieniin sytosolisiin pistemäisiin rakenteisiin (Kuva 5B).

Harkitsimme, että Ypq3:n erilainen käyttäytyminen verrattuna Ypq1:een ja Ypq2:een AP-3-puutteellisissa kannoissa saattoi johtua siitä, että Ypq3-GFP syntetisoitiin soluissa, jotka kasvoivat galaktoosin läsnä ollessa, tai siitä, että YPQ3-GFP-geenin transkriptio indusoitiin vahvan GAL-promoottorin avulla. Tämä vaikuttaa kuitenkin epätodennäköiseltä, koska Ypq1-GFP- ja Ypq2-GFP-proteiinit, jotka indusoitiin ohimenevästi villityyppi- ja mutanttikannoissa käyttäen samaa GAL-promoottoria, paikallistuivat soluihin samoin kuin silloin, kun ne ilmentyivät omien geeniensä promoottoreiden alaisuudessa (ks. täydentävä kuva S5 verkossa). Lisäksi, vaikka fluoresoiva signaali oli hädin tuskin havaittavissa, saimme todisteita siitä, että luonnollisen YPQ3-geenin promoottorin avulla ilmentynyt Ypq3-GFP leimasi vakuolien kalvot villityypin kannassa, mutta ei apl5Δ-mutaatiossa, mikä fenotyyppi erosi selvästi Ypq1-GFP:llä ja Ypq2-GFP:llä saaduista tuloksista. Tässä mutantissa Ypq3-GFP esiintyi pistemäisissä rakenteissa, jotka todennäköisesti vastasivat Golgia, eikä sen missortoituminen vacuolarin luumeniin ollut selvästi näkyvissä, todennäköisesti siksi, että fluoresenssi oli liian heikkoa (ks. täydentävä kuva S6 verkossa).

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että kuten edellä on osoitettu Ypq1:n osalta, Ypq2- ja Ypq3-proteiinit käyttävät pääasiassa ALP-reittiä päästäkseen vakuolakalvolle, ja ne poikkeavat endosomeihin, kun tämä reitti on viallinen. Vaikka endosomien kautta kulkevat Ypq1 ja Ypq2 saavuttavat kuitenkin tehokkaasti vacuolaarikalvon, Ypq3 on alttiimpi lajittumaan MVB-reitille, mikä johtaa sen kohdentumiseen vacuolaarilumeniin.

Hiivassa tuotettu PQLC2 käyttää ALP-reittiä ja sen dileusiinimotiivia saavuttaakseen vacuolaarisen kalvon

Edellisessä tutkimuksessa rotan PQLC2:n havaittiin lokalisoituvan HeLa-soluissa lysosomeihin, mutta sen PQLC2LL>AA-mutantilla, jossa C-terminaalinen dileusiini on korvattu dialaniinilla, havaittiin hajanaisempi jakauma solun läpi, ja se oli osittain ohi plasmamembraanissa6. Lisäksi hiivassa tuotetun PQLC2:n havaittiin lokalisoituvan vakuolakalvolle, jossa se on toiminnallinen, sillä sen havaittiin täydentävän ypq2Δ-mutantin kasvufenotyyppiä6. Kuvassa 6A esitetyt tulokset osoittavat, että PQLC2 kohdistui asianmukaisesti hiivan vakuoliin pep12Δ-mutantissa, mutta poikkesi vakuolaariseen luumeniin apm3Δ- ja apl5Δ-mutanteissa. Tämä kohdentuminen vakuolilumeniin oli heikentynyt apm3Δ pep12Δ- ja apl5Δ pep12Δ-kaksoismutanteissa, joissa PQLC2:n havaittiin jakautuvan diffuusisti sytosoliin (sublokalisaatiokuvioiden kvantitatiivinen määritys, ks. täydentävä kuva S7 verkossa). Ekspressoimme villityyppisissä ja mutanttihiivakannoissa myös PQLC2LL>AA-mutanttia. Villihiivassa PQLC2LL>AA:n havaittiin lokalisoituvan vakuolaarilumeniin, mutta pep12Δ-mutantissa sen havaittiin jakautuvan koko sytosoliin (Kuva 6B). Lastien lajittuminen multivesicular body -reitille on tyypillisesti heikentynyt vps27Δ-mutantissa, josta puuttuu ESCRT-0-kompleksin keskeinen komponentti18. Vps27Δ-mutantissa PQLC2LL>AA pinoutui suureen perivakuolaariseen lokeroon: luokan E lokeroon, joka on tyypillisesti havaittu tässä mutanttiluokassa (kuva 6B). Nämä tulokset osoittavat, että hiivassa tuotettu PQLC2 käyttäytyy kuten endogeeninen Ypq3: se lajittuu tyhjiöön ALP-reitin kautta tavalla, joka on riippuvainen sen dileusiinimotiivin asianmukaisesta tunnistamisesta AP-3-adapterikompleksin toimesta. Kun tämä tunnistaminen on heikentynyt, koska dileusiinimotiivi on mutatoitunut tai AP-3-kompleksin komponentti puuttuu, PQLC2 poikkeaa endosomeihin, joissa se lajittuu tehokkaasti MVB-reitille ja päätyy lopulta vacuolaariseen luumeniin.