Apc:hen liittyvät suoliston neoplasian mallit: lyhyt katsaus patologeille

Kolorektaalikarsinooma on yleinen syöpäkuolleisuuden syy länsimaissa. Monissa patologian vastaanotoilla seulontakoloskopioiden yhteydessä poistetut paksusuolen adenoomat muodostavat suuren osan päivittäisestä työmäärästä, ja näin ollen ihmisen paksusuolen karsinooman ja adenoomien, sen esiasteiden, morfologia on tuttu kirurgisille patologeille. Akateemisissa keskuksissa kirurgisia patologeja saatetaan pyytää tulkitsemaan hiirimäisiä kasvainmalleja tutkijoille, ja perustietämys ihmisen suoliston kasvainten ja hiirimallien morfologian yhtäläisyyksistä ja eroista on tarpeen tarkkaa tulkintaa varten.

Tuumorigeneesin geneettisesti muunnetut hiirimallit ovat hyödyllisiä arvioitaessa, voivatko tietyt mutaatiot johtaa kasvaimen syntyyn, kemotoksisten tautien ehkäisymenetelmien tutkimuksissa ja muutettujen geenituotteiden toiminnallisuuden selvittämisessä, vaikkakin niitä on joskus kritisoitu siitä syystä, että ne ovat epätäydellisiä ihmissairauksien jäljitelmiä. Vaikka tieteellisessä kirjallisuudessa on kuvattu monia geneettisesti muunnettuja hiirimalleja suoliston kasvaimista, ne voidaan jakaa karkeasti viiteen ryhmään: Apc:hen liittyvät mallit, joissa on muutoksia Wnt-signaloinnissa, epäsuhteen korjauksen puutosmallit, karsinogeenilla käsitellyt mallit, mallit, joissa on muutoksia transformoivassa kasvutekijässä β, ja koliittiin liittyvä kasvain, joka syntyy immuunipuutosmalleissa, kuten IL10-/-hiirissä. Tässä katsauksessa keskitytään yhden ensimmäisen suoliston neoplasian GEM-mallin, ApcMin+/- -hiiren ja siihen liittyvien mallien patologiaan, ja tarkoituksena on kuvata suolistovaurioiden morfologisia piirteitä ja verrata niitä ihmisen paksusuolen adenoomiin ja karsinoomiin.

Yksi yleisimmin käytetyistä malleista, joilla ihmisen suoliston neoplasiaa voidaan tutkia, on ApcMin+/- -malli, joka kehitettiin William Doven laboratoriossa vuonna 1990 (Moser ym., 1990). ApcMin+/- -hiirellä, ensimmäisellä suoliston neoplasian sukusolujen mutaatiomallilla, on autosomaalinen dominoiva toimintakyvyn menetys mutaatio Apc:n koodonissa 850, joka on syntynyt altistumalla erittäin voimakkaalle mutageenille, N-etyyli-N-nitrosourealle (ENU). Sittemmin on luotu useita muita malleja, joissa on Apc-mutaatio, joista monissa on typistäviä mutaatioita (taulukko 1).

Nämä Apc:hen liittyvät mallit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska yleisin kolorektaalisen karsinooman ajurimutaatio ihmisillä on mutaatio kasvainsuppressorigeeni APC:ssä, joka johtaa APC:n inaktivoitumiseen ja Wnt-signalointireitin aktivoitumiseen, jolloin β-kateniini stabiloituu ja siirtyy tumaan. Ihmisen APC-geeni koodaa 213 kilodaltonin proteiinia, joka osallistuu solujen adheesioon ja liikkuvuuteen, solusyklin säätelyyn, apoptoosiin ja signaalinsiirtoon (Boman & Fields, 2013), ja sen itulinjan mutaatio johtaa familiaaliseen adenomatoosipolyposis koliin (FAP). Tälle syöpäalttiusoireyhtymälle on ominaista satojen paksusuolen adenoomien kehittyminen, jotka johtavat adenokarsinoomaan nuorella iällä. Useimmat FAP:tä aiheuttavat mutaatiot sijaitsevat geenin 5′-puoliskolla ja johtavat typistettyihin polypeptideihin.

Apc:hen liittyvien eläinmallien genetiikka

Monissa Apc:hen liittyvissä hiirimalleissa on muunnettu Apc:n sukusolmumutaatioita, jotka johtavat typistetyn Apc-proteiinin ilmentymiseen.Useimmissa näissä hiirimalleissa elinkelpoisia ovat vain heterotsygoottiset hiirimallit, koska homotsygoottius on alkiolähestymiskykyinen. Kasvukontrollin menetys Apc:n jäljellä olevan villityyppisen kopion hävitessä johtaa useisiin suoliston adenoomiin. Apc-mutaation spesifinen sijainti vaikuttaa hiirten polyyppien monimuotoisuuteen, sijaintiin ja pitkäikäisyyteen (McCart ym., 2008). Esimerkiksi Apc1638N/+ -hiirellä polyyppitaakka on vähäisempi ja elinikä pidempi kuin ApcMin/+ -hiirellä (Smits ym., Apc1322T-hiiressä mutanttiproteiini säilyttää yhden 20 aminohappoa sisältävän β-kateniiniin sitoutuvan/degradoituvan toiston (ApcMin/+-hiiressä ei ole yhtään); näiden hiirten adenoomat ovat havaittavissa aikaisemmin, niillä on vaikeampi dysplasia ja ne ovat suurempia (Pollard ym., 2009) verrattuna ApcMin/+-hiiriin. Apc:n toimintakadon ajoituksella voi myös olla merkitystä; esimerkiksi vaiheittainen Apc:n menetys Apc(Min/CKO)- tai Apc(1638N/CKO)-menetelmällä johtaa karkeasti näkyvään neoplasiaan suolistossa, kun taas samanaikainen menetys johtaa salattuun klonaaliseen laajenemiseen kryptojen pilkkoutumisen kautta ilman morfologista transformaatiota (Fischer ym., 2012). Koko Apc-geenin poistaminen ApcΔel-15-hiirellä johtaa Apc-trunkiointiin verrattuna nopeampaan kasvainten kehittymiseen, jolloin eloonjääminen on heikentynyt, polypoosi on vaikeampaa ja paksusuolen kasvainten eteneminen on edennyt pidemmälle kuin ApcMin/+-hiirillä (Cheung ym., ),

Geneettisesti muunnettuja rotan malleja, joissa on Apc-mutaatio, on myös saatavilla, ja ne ovat houkuttelevia mallien pitkäikäisyyden ja suhteellisen helpon paksusuolen tähystyksen suorittamisen vuoksi, mikä mahdollistaa pitkittäiskokeet (taulukko 2). Yleisimpiä ovat Kyoto Apc Delta (KAD) -rotta ja Pirc-rotta. KAD-rotta on johdettu ENU-mutageneesin avulla, ja sillä on nonsense-mutaatio Apc:n eksonin 15 koodonissa 2523, jolloin proteiini on typistetty. Nämä rotat ovat elinkelpoisia homotsygoottisessa tilassa, eivätkä ne kehitä spontaanisti suolistokasvaimia. Hoito atsoksimetaanilla ja dekstraanisulfaattinatriumilla (AOM/DSS) on välttämätöntä suoliston kasvainten synnyttämiseksi. Pirc-rotilla, joka on myös tuotettu ENU:n aiheuttaman mutageenin avulla, on Apc-mutaatio nukleotidin 3409 kohdalla, mikä tuottaa typistetyn proteiinin. Tämä mutaatio on homotsygoottina embyronisesti tappava. Mutaatiolla on 100-prosenttinen penetraatio, ja kaikille rotille kehittyy paksusuolen polyypit 4 kuukauden iässä.

On kehitetty geneettisesti muunnettu sikamalli, jossa on APC 1311 -mutaatio, joka on ortologinen ihmisen APC 1309:lle. Näille eläimille kehittyy poikkeavia kryptofokuksia, yksittäisiä kryptoadenoomia ja moninkertaisia paksusuolen adenoomia, jotka muistuttavat ihmisen FAP:tä. Suuremmissa adenoomissa esiintyy etenemistä korkea-asteisen dysplasian muodossa. Tyypillistä on pinnan osallistuminen, joka muistuttaa ihmisen adenoomia (Flisikowska ym., 2012).

Syöpäfenotyyppien muokkaajat

Kantaerojen on jo pitkään tunnustettu vaikuttavan merkittävästi kasvainrasitukseen ApcMin+/- -mallissa, jota yleensä ylläpidetään C57Bl/6J-taustalla. B6 Min/+ -hiirten risteyttäminen AKR:n ja muiden sisäsiitoskantojen kanssa johti keskimääräisen kasvainmäärän vähenemiseen F1-hiirissä (Shoemaker ym., 1997). Takaisinristeytyskokeet ja muut geneettiset analyysit modifioivien lokusten kartoittamiseksi ovat tuottaneet useita Modifier of Min (Mom) -ehdokasgeenejä (McCart ym., 2008). Lisäksi hiiripesäkkeen ruokavaliolla ja suolistomikrobiomilla on merkittäviä vaikutuksia polyyppien lisääntymiseen, etenemiseen ja kokoon. Esimerkiksi runsasrasvaisen ja vähäkuituisen länsimaisen ruokavalion on osoitettu lisäävän polyyppien lukumäärää ja kasvaimen etenemistä ApcΔ716/+-hiirillä (Hioki ym., 1997).

Patologia

ApcMin+/- ja sukulaismalleissa esiintyvien suolistovaurioiden morfologia on samankaltainen eri malleissa, vaikka alkamisikä, dysplasian aste ja jakautuminen ruoansulatuskanavassa vaihtelee (taulukko 1). Varhaisimmat tunnistettavat vauriot koostuvat yhdestä suurentuneesta kryptasta tai pienestä kryptojen ryppäästä, jota reunustavat täpötäydet solut, joissa on suurentunut tuman ja sytoplasman suhde ja ydinkerroksen hyperkromaasia (kuva 1). Nämä varhaiset leesiot ovat matala-asteisia dysplastisia leesioita, jotka muistuttavat FAP:tä sairastavilla potilailla esiintyviä pieniä tubulaarisia paksusuolen adenoomia. Ohutsuolessa pieni invaginaatio kehittyy lamina propriaan proliferatiivisella vyöhykkeellä kryptan ja villuksen yhtymäkohdassa (kuva 2). Adenomatoottiset solut työntyvät lamina propriaan ja ylös villukseen muodostaen normaalin pintalimakalvon alle kaksinkertaisen adenomatoottisen epiteelin kerroksen (kuva 3). Paksusuolessa varhaiset adenoomat tunkeutuvat lamina propriaan kryptien väliin, vaikka myös yksittäisiä krypta-adenoomia voidaan havaita (Oshima ym., 1997). Beetakateniinin immunohistokemiaa voidaan käyttää apuna varhaisten adenoomien tunnistamisessa, sillä jopa yksittäisten kryptojen adenoomissa ApcMin+/- -malleissa ja niihin liittyvissä malleissa on havaittavissa ydinperäisen beetakateniinin kasautumista (kuva. 4).

Adenoomien kasvaessa ne muodostavat monisärmäisiä, jalustaisia tai joskus kupinmuotoisia leesioita, joissa on painunut keskusta (kuva. 5a ja b). Monissa malleissa adenoomat eivät etene matala-asteista dysplasiaa pidemmälle. Kuitenkin pidempään eläneissä malleissa, joissa on vähemmän kasvaimia, joillekin kehittyy korkea-asteista dysplasiaa, jolle on ominaista raitainen arkkitehtuuri, jossa kaikki solut eivät ole kosketuksissa tyvikalvoon (kuva 6). Lukuisat mitoottiset kuviot ja apoptoottiset kappaleet ovat yleisiä adenoomissa kaikissa kehitysvaiheissa.

ApcMin+/- -hiiressä ja sukulaismalleissa syntyvät suoliston kasvaimet sisältävät useita eri solutyyppejä, mutta koostuvat ensisijaisesti absorptorisesta solutyypistä ja pikarisoluista (taulukko 3). ApcMin+/- -malleissa ja sukulaismalleissa ohutsuolessa syntyvät adenoomat sisältävät Panethin soluja, jotka ovat helposti tunnistettavissa hematoksyliini- ja eosiinivärjäyksellä (kuva 7) ja korostuvat lysotsyymin immunohistokemian avulla. Niiden on osoitettu muodostavan 10 prosenttia tai vähemmän soluista ohutsuolen adenoomissa (Moser ym., 1992). Hiiren paksusuolessa ei ole Panethin soluja, mutta näiden mallien paksusuolen adenoomista on löydetty lysotsyymiä ilmentäviä soluja, joilta puuttuu PAS-positiivisuus, mikä viittaa Panethin solujen kaltaiseen erilaistumiseen myös paksusuolen leesioissa (Moser ym., 1992; Husoy ym., 2006). Neuroendokriiniset solut muodostavat pienen osan ApcMin+/–tyypin adenoomien soluista, mutta kyseinen solutyyppi kuvastaa niitä neuroendokriinisia soluja, joita esiintyy normaalissa suolen limakalvossa adenooman kohdalla (Moser ym., 1992). Esimerkiksi serotoniinia ilmentävät solut ovat hiiren suoliston yleisimpiä neuroendokriinisiä soluja, ja niitä esiintyy kaikkialla; tällaisia soluja on jopa 5 % ApcMin+/- adenooman soluista ohutsuolen ja paksusuolen vaurioissa (Moser ym., 1992). PYY-positiivisia soluja sen sijaan löytyy vain distaalisesta paksusuolesta peräisin olevista adenoomista, mikä kuvastaa näiden solujen normaalia jakautumista. Neuroendokriiniset solut ovat hajallaan hajallaan adenoomissa, eivätkä ne muodosta pieniä klustereita kuten lysotsyymipositiiviset solut (Moser ym, 1992).

Dysplasia hiirimallien suoliston adenoomissa olisi luokiteltava käyttäen samaa terminologiaa (matala-asteinen dysplasia, korkea-asteinen dysplasia, intramukosaalinen karsinooma) ja kriteerejä kuin ihmisen kolorektaalisten adenoomien kohdalla (Washington ym., 2013). Useimmissa ApcMin+/- -hiiren ja sukulaismallien adenoomissa on matala-asteista dysplasiaa, mutta monet niistä suurenevat hiiren ikääntyessä, ja muutamat etenevät adenooma-karsinooma-sekvenssissä. Invasiivinen karsinooma on harvinainen, sillä useimmat hiiret kuolevat anemiaan tai suolentuppeumaan ennen etenemistä. Kuitenkin muutamissa pidempään eläneissä malleissa, joissa on vähemmän adenoomia, kehittyy submucosaan invasiivinen adenokarsinooma (Colnot ym., 2004; Fodde ym., 1994; Robanus-Maandag ym., 2010). Metastaasiaa ei esiinny ApcMin+/- -hiirissä, ja se on erittäin harvinaista sukulaismalleissa (Fodde ym., 1994).

Kirurgisten patologien, joita pyydetään analysoimaan suolenäytteitä, tulisi olla tietoisia eräästä sudenkuopasta, joka liittyy kasvaimen invasiivisuuden arviointiin hiirimalleissa. Koska hiiren suolen kerrokset ovat ohuita ja herkkiä, hyvänlaatuisen epiteelin tyrähtäminen submucosaan on yleistä (Boivin ym., 2003), erityisesti peräsuolen prolapsiin ja tulehdustiloihin liittyen (kuva 8a ja b). Samanlaista adenomatoottisen limakalvon siirtymistä (pseudoinvaasiota) esiintyy ihmisillä pedunkulaarisissa kolorektaaliadenoomissa ja colitis cystica profundassa. Tiedemiehistä ja patologeista koostuva paneeli laati Jackson Laboratoriesissa vuonna 2000 järjestetyssä Mouse Models of Intestinal Neoplasia Workshop -seminaarissa konsensusohjeet tyrän ja invasiivisen adenokarsinooman erottamiseksi toisistaan (Boivin ym., 2003), ja niistä on yhteenveto taulukossa 4. Taulukossa 4 esitetään yhteenveto. Invasiivista karsinoomaa ei välttämättä voida diagnosoida varmuudella, varsinkaan tulehduksellisissa malleissa tai prolapsialueilla, ja invaasion yksiselitteiseen määrittämiseen saattaa olla tarpeen arvioida vanhempia hiiriä, joilla on paremmin kehittyneitä leesioita.

Invaasiolle lamina propriaan on ominaista kulmikkaiden kryptaprofiilien kehittyminen, joissa on yksittäisiä infiltroivia soluja, ja siihen voi liittyä stroomamuutoksia, kuten desmoplasiaa ja lisääntynyttä tulehdussolutiheyttä (kuva. 9a ja b).