Aporfiinialkaloidit Ocotea macrophyllasta (Lauraceae)

ARTIGO

Aporfiinialkaloidit Ocotea macrophyllasta (Lauraceae)

Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Kolumbia. AA 14490

ABSTRACT

Neljä aporfiinialkaloidia Ocotea macrophylla (Lauraceae) -kasvin puusta eristettiin ja karakterisoitiin (S)-3-metoksi-nordomestisiiniksi (1), (S)-N-etoksikarbonyyli-3-metoksi-nordomestisiini (2), (S)-N-formyyli-3-metoksi-nordomestisiini (3) ja (S)-N-metoksikarbonyyli-3-metoksi-nordomestisiini (4); alkaloidit 2-4 ilmoitetaan nyt ensimmäistä kertaa. Eristettyjen yhdisteiden rakenne määritettiin niiden spektritietojen perusteella ja vertaamalla niiden spektritietoja kirjallisuudessa kuvattuihin arvoihin. Alkaloidifraktio ja yhdiste 1 osoittivat antifungaalista aktiivisuutta Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici -kasvintuhoojaa vastaan, ja yhdiste 1 osoitti myös antimikrobista aktiivisuutta Staphylococcus aureusta ja Enterococcus faecalis -bakteeria kohtaan.

Avainsanat: Ocotea macrophylla; aporfiinialkaloidit; Lauraceae.

ESITTELY

Ocotea-sukuun (Lauraceae) kuuluu yli 350 lajia, joita tavataan Amerikan mantereella ja eteläisessä Afrikassa.1,2 Kolumbiassa on 35 Ocotea-lajia, jotka ovat levinneet eri puolille maata pääasiassa Andien metsissä.3 Perinteisen lääketieteen piirissä joillakin Ocotea-lajeilla on ollut erilaisia sovelluksia. O. quixos -lajia käytetään desinfiointiaineena, paikallispuudutteena ja ripulilääkkeenä.4 O. lancifolia -lajia käytetään loislääkkeenä, ja O. caparrapi -lajia käytetään hyönteisten ja käärmeiden puremien, keuhkoputkentulehduksen ja syöpäkasvainten hoitoon.5,6,6

Kemiallisesti Ocotea-suku tunnetaan lähinnä furofuraanin7 ja tetrahydrofuraanin tyyppisten lignaanien8 , bisyklooktaanin9 ja bentsofuraanin neolignaanien10 sekä bentsyyliisokinoliinin11 ja aporfiinialkaloidien lähteenä.5 Aiemmissa tutkimuksissa Ocotea macrophyllan puusta eristettiin ja tunnistettiin neljä aporfiinialkaloidia, jotka olivat nanteniini, glausiini, isokorydiini ja dehydronanteniini12,13 . Tässä artikkelissa kuvaamme kolmen uuden aporfiinialkaloidin 2-4 eristämistä ja rakenteellista määrittämistä (S)- 3-metoksi-nordomestisiini 1:n lisäksi ja raportoimme yhdisteiden antibakteeriset ja sienilääkkeelliset vaikutukset.

TULOKSET JA KESKUSTELU

Tulokset ja keskustelut

O. macrophyllan varresta tehtiin happo-emäsuutto, jolla saatiin alkaloidifraktio, joka edelleen fraktioitiin ja puhdistettiin kromatografisin menetelmin, jolloin eristettiin neljä alkaloidia: (S)-3-metoksi-nordomestisiini (1), (S)-N-etoksikarbonyyli-3-metoksi-nordomestisiini (2), (S)-N-formyyli-3-metoksi-nordomestisiini (3) ja (S)-N-metoksikarbonyyli-3-metoksi-nordomestisiini (4). Alkaloidien 1-4 rakenteet on esitetty kuvassa 1 ja spektroskooppiset tiedot taulukossa 1.

Signaalissa δH 6,30 (1H, s) ei havaittu HMQC-kokeessa mitään yhteenkytkeytymistä, mikä viittaa fenolisen OH-ryhmän läsnäoloon, mitä tukee IR-kuvaus. HMBC-spektrin analyysi mahdollisti substituenttien paikantamisen niiden korrelaatioiden perusteella, joita havaittiin signaalien δH 5,94 ja 5,95 (metyleenidioxyryhmälle) ja signaalien δC 145,9 (C-9) ja 146 välillä.2 (C-10) ja näiden kahden viimeksi mainitun signaalin ja protonien δH 6,70 (H-8) ja 7,90 (H-11) välillä, mikä viittaa siihen, että asemissa 9 ja 10 on metyleenidioxyryhmä ja aromaattisella renkaalla on kaksi para-suuntaista vetyä. Asemassa 1 olevan hydroksyyliryhmän läsnäolo määritettiin käyttämällä C-11b:lle osoitettujen δH 6,30:n ja δC 116,5:n signaalien välistä korrelaatiota. Metoksyyliryhmien sijainti asemissa C-2 ja C-3 määritettiin δH 3,96:n ja 3,86:n hydrogeenien ja δC 138,4:n (C-2) ja δC 147,8:n (C-3) hiilien välisen korrelaation perusteella.

C-6a:n absoluuttinen konfiguraatio määritettiin S:ksi, koska sillä on negatiivinen puuvillavaikutus 280 nm:n kohdalla ja positiivinen puuvillavaikutus 240 nm:n kohdalla CD-käyrässä.17 Lisäksi tämän vahvisti optisen rotaation positiivinen arvo 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Näin ollen alkaloidi 1 määritettiin (S)-3-metoksinordomestisiiniksi, joka on aporfiinialkaloidi, joka on raportoitu aiemmin Nectandra sinuatasta19 , joka myös kuuluu Lauraceae-heimoon. Tässä raportissa korjataan ja täydennetään tämän yhdisteen spektroskooppisia tietoja.

Alkaloidi 2 saatiin keltaisena öljynä, joka reagoi positiivisesti Dragendorffin reagenssiin, ja sen optinen kiertoarvo oli 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). 2:n UV- ja IR-spektri oli samanlainen kuin 1:n, paitsi että molemmissa spektreissä näkyi karbamaattiryhmän aiheuttama absorptio 282 nm:ssä ja 1688 cm-1:ssä.20 1H- ja 13C-NMR-spektrit osoittivat samanlaista profiilia kuin 1:ssä. 1H-NMR:ssä näkyi kaksi uutta signaalia δH:ssa 4,29 (2H, m) ja 1,29:ssä 1,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 1,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 2,29:ssä 3H:ssa 3H:ssa 1:n NMR-testissä. COSY-kokeessa havaittiin signaalien δH 4,29 ja 1,29 korrelaatio, mikä osoittaa etyyliryhmän läsnäolon, joka sen siirtymisen vuoksi viittaa heteroatomiin kiinnittyneeseen etyyliryhmään. 13C NMR- ja DEPT-spektrit osoittivat kolme uutta signaalia δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) ja 14,8 (CH3), jotka ovat tyypillisiä typpiatomiin kiinnittyneen etoksikarbonyyliryhmän signaaleja. C-6a:n absoluuttinen konfiguraatio määritettiin S:ksi, koska se osoitti samoja puuvillavaikutuksia kuin 1. Näin ollen alkaloidiyhdiste 2 tunnistettiin (S)-N-etoksikarbonyyli-3-metoksi-nordomestisiiniksi. Sen ESIMS-spektri antoi pseudomolekyyli-ionipiikin m/z 414 +:ssa, joka vastaa molekyylikaavaa C22H22NO7, ja fragmentaatiot johtuivat CH3OH:n ja CH3CH2OH:n häviämisestä m/z 382 +:ssa ja m/z 368 +:ssa. Negatiivisen ionimoodin ESI-spektrissä näkyi piikkejä m/z 412 – ja m/z 383 ., joista jälkimmäinen oli etyyliryhmän menetys. Tämäntyyppisiä alkaloideja, joiden substituentti on N-etoksikarbonyyli, on eristetty Lindera angustifoliasta (Lauraceae).21

Alkaloidi 3, saatiin keltaisena öljynä, jonka optinen kiertoarvo oli 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). IR-spektri oli samanlainen kuin alkaloidien 1 ja 2. Lisäksi havaittiin formyyliryhmälle ominaista absorptiota 2830, 2700 ja 1739 cm-1:ssä. HRESIMS:n negatiivisessa moodissa havaittiin pseudomolekyyli-ioni – m/z 369.1133, joka vastaa molekyylikaavaa C20H20NO6. ESI-MS-spektrien negatiivisessa ionimoodissa näkyi formyyliryhmän häviäminen m/z 339 .. NMR-profiili oli samanlainen kuin alkaloideilla 1 ja 2. 1H NMR:ssä esiintyi erilaisia signaaleja, jotka kuuluivat kahden isomeerin seokseen suhteessa 3:1. Pääisomeerin vertailu alkaloidin 1 NMR:ssä alkaloidiin 1 osoitti samaa aromaattisen renkaan substituution mallia sen lisäksi, että 1H:ssa esiintyi kaksi uutta signaalia δH:ssa 8,25 (1H, s) ja 13C:ssa δC:ssa 161,9 formyyliryhmästä ryhmään 3. Tämä typen funktionaalisuus johti rotaatioisomeerien muodostumiseen, joka on kuvattu aiemmin alkaloideille, joissa on N-formyyli- ja N-asetyyliryhmä.22 Absoluuttinen konfiguraatio määritettiin S:ksi samaan tapaan kuin 1:llä ja 2:lla. Näin ollen tämä alkaloidi 3 tunnistettiin (S)-N-formyyli-3-metoksi-nordomestisiiniksi.

Alkaloidi 4 saatiin valkoisena kiinteänä aineena, jonka sulamispiste oli 222-223 ºC (MeOH) ja optinen kierto 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). NMR-analyysi osoitti, että 4:llä on sama perusrunko kuin 2:lla, mutta siinä on metyyliesteri, mikä käy ilmi 4:n signaaleista δH 3,76 (3H, s) ja δC 52,6, jotka korvasivat 2:n etyyliryhmän signaalit. HRESIMS-analyysi osoitti pseudomolekyyli-ionin – m/z 398,1233, joka vastaa molekyylikaavaa C22H22NO7. Näin ollen alkaloidi 4 tunnistettiin (S)-N-metoksikarbonyyli-3-metoksi-nordomestisiiniksi.

Sienilääkkeellinen aktiivisuus arvioitiin levydiffuusiomenetelmällä Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 fytopatogeenistä sientä vastaan, joka vaikuttaa tomaattisatoihin aiheuttaen valtavia tappioita viljelijöille. Alkaloidifraktio oli aktiivinen F. oxysporumia vastaan 250 μg/μL:ssa. Sienten kasvua estävä aktiivisuus oli kohtalainen 5 μg/μL (S)-3-metoksinordomestisiini 1:n osalta, kun taas muut alkaloidit olivat tehottomia, mikä viittaa siihen, että typpiatomin elektronia vetävien substituenttien läsnäolo vähentää sienilääkkeiden aktiivisuutta.

Vaikka aporfiinien sienilääkkeellisestä aktiivisuudesta on tehty vain vähän arviointiraportteja, on todettu, että ne ovat aktiivisia sellaisia lajeja vastaan kuin Candida albicans,24,25 mutta inaktiivisia sienipatogeeneja kuten Cladosporium herbariumia vastaan.26 Nämä tulokset ovat uusi arviointiraportti näiden alkaloidien sienilääkkeellisestä aktiivisuudesta, jossa korostetaan, että aporfiinien typen substituenttien tyyppi vaikuttaa niiden sienilääkkeelliseen aktiivisuuteen.

Bakteerilääkkeiden antibakteerinen aktiivisuus arvioitiin radiaalisella diffuusiomenetelmällä, jonka Lerhrer27 on raportoinut kahta Gram (+) -standardikantaa vastaan: Staphylococcus aureus 6538 ja Enterococcus faecalis 29212 sekä kolme Gram (-): Escherichia coli 25922 ja Salmonella tiphymurium, kannat MS7953 ja 14028s. Alkaloidi 1 (2,5 μg) osoitti antimikrobista aktiivisuutta molempia arvioituja grampositiivisia bakteereja vastaan 30 AU:n arvoilla, kuten taulukossa 2 on esitetty.

Yhdisteen 3-metoksinordomestisiinin raseemiselle seokselle on raportoitu sen aktiivisuutta E. colia (MIC= 256 μg/mL) ja S. aureusta (MIC= 512 μg/mL) vastaan,28 tässä tapauksessa yhdisteen 1 aktiivisuus ei kuitenkaan ole aktiivinen E. coliin.

Kuten myös antifungaalisessa aktiivisuudessa, tulokset osoittavat, että typen substituentin luonne vaikuttaa antibakteeriseen aktiivisuuteen (taulukko 2).

KOKEELLISET MENETELMÄT

Yleiset menetelmät

Sulamispiste määritettiin käyttämällä Mel-temp Fisher Johns, laboratoriolaite. UV-spektrit tallennettiin Perkin Elmer Lambda 2S -laitteella ja CD-spektrit JASCO J-720 -spektrometrillä. IR-spektrit saatiin Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 -laitteella ohuena kalvona. Optiset kierrokset kirjattiin Schmidt-Haensch-polarimetrillä. 1H- (400 MHz) ja 13C- (100 MHz) NMR-spektrit sekä 2D-spektrit (COSY, HMQC ja HMBC) tehtiin Bruker Avance 400 MHz -spektrometrillä käyttäen CDCl3:a sisäisenä referenssinä. HRMS määritettiin Shimadzun LCMS-IT-TOF-massaspektrometrijärjestelmässä ESI:llä positiivisessa ionimoodissa ja negatiivisessa ionimoodissa. Pylväskromatografia (CC) tehtiin silikageelillä (70-230 ja 230-400 mesh, Merck) ja analyyttinen kromatografia tehtiin silikageeli 60 PF254:llä (0,25 mm).

Kasvimateriaali

O. macrophyllan varret kerättiin heinäkuussa 2006 Nocaimasta, Kolumbiasta, W. Delgado. A. Jara tunnisti kasvitieteellisen näytteen ja tositteen (COL-517191), ja se talletettiin Kolumbian kansallisen yliopiston Kolumbian kansalliseen herbaariin, Bogotá, Kolumbia.

Extraktio ja eristäminen

Kuivattuja ja viritettyjä Ocotea macrophylla -kasvin varsia (2,0 kg) uutettiin EtOH:lla maseroimalla huoneenlämpötilassa, ja ne väkevöitiin alipaineistettuun vakuumiin, jotta saatiin uutetta (102,6 g). Näyte (48,9 g) tästä uutteesta liuotettiin veteen ultraäänellä ja happamoitettiin 5-prosenttisella HCl:llä pH-arvoon 2,0. Tämän jälkeen hapan suspensio suodatettiin ja emäksitettiin 20-prosenttisella NaOH:lla pH-arvoon 8,0, minkä jälkeen se uutettiin peräkkäin kloroformilla. Kloroformifraktio (3,01 g) tehtiin pylväskromatografiaan silikageelillä ja eluoitiin petrolieetteri:AcOiPr (4:6-0:10) ja AcOiPr:MeOH (10:0-0:10) -gradientilla, jolloin saatiin neljä fraktiota (I-IV). Fraktio I (347 mg) kromatografoitiin toistuvasti kolonnilla (CC) silikageelillä ja eluoitiin n-heksaani:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 ja Tol:AcOiPr 7:3. Näin saatiin alkaloidit 1 (7 mg) ja 2 (4 mg). Jakeelle II (250 mg) tehtiin pylväskromatografia silikageelillä ja eluoitiin CHCl3:AcOEt:llä (85:15), minkä jälkeen se tehtiin CC Sephadex LH-20:lla (CH3OH), jolloin saatiin alkaloidi 3 (8 mg). Fraktio IV (1433 mg) puhdistettiin toistuvalla pylväskromatografialla silikageelillä käyttäen eluutiojärjestelminä CH2Cl2:MeOH 97:3 ja CH2Cl2. Lopulta peräkkäisillä pesuilla MeOH:lla saatiin alkaloidi 4 (98 mg).

Sienilääketutkimus

F. oxysporum saatiin Cundinamarcan yliopiston viljelmäkokoelmasta (maataloustieteen laitos, kasvipatologian laboratorio). PDA:ta käytettiin väliaineena sienilääkkeiden aktiivisuusmäärityksissä. Viljelyalustaan inokuloitiin 100 μl liuosta, jossa oli 105 itiötä. Näytteet valmistettiin eri pitoisuuksina, jotka vastasivat 50, 25 ja 10 μg/μL alkaloidifraktiota ja 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 ja 0,1 μg/μL puhtaita alkaloideja. Kymmenen mikrolitraa näytteitä levitettiin suodatinpaperikiekkoihin ja asetettiin inokuloidulle väliaineelle. Levyt suljettiin ja jätettiin inkubaattoriin 3 päiväksi 25 °C:ssa. Selkeät vyöhykkeet, jotka ilmestyivät kasvavaa sientä vasten, osoittivat vähimmäismäärän fraktiota tai alkaloidia, joka tarvittiin sienen kasvun estämiseksi. Kullekin käsittelylle tehtiin kolme toistoa. Benomyyliä (bentsimidatsoli – 5 μg) käytettiin positiivisena kontrollina ja asetonia negatiivisena kontrollina.23

Antibakteeriset määritykset

Antibakteerinen aktiivisuus arvioitiin radiaalisella diffuusiomenetelmällä, joka oli mukautettu Lehrer’in aiemmin julkaisemasta metodologiasta.27 Yhdisteitä arvioitiin kahta Gram (+) -kantaa vastaan: Staphylococcus aureus ATCC 6538 ja Streptococcus fecalis ATCC 29212 sekä kolmea Gram (-) kantaa: Escherichia coli ATCC 25922 ja Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s ja Salmonella tiphymurium MS7953. Kustakin kannasta eristetty pesäke sijoitettiin 3 ml:aan soijakryptaasia (TSB) Gram (+) -kantojen osalta ja Luria-lientä (LB) Gram (-) -kantojen osalta, ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa sekoittaen, kunnes mikro-organismit olivat logaritmisessa vaiheessa. Supernatantti poistettiin ja saatu sedimentti suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuriin (PBS), minkä jälkeen se pestiin PBS:llä ja sentrifugoitiin. Lopuksi sedimentti suspendoitiin uudelleen PBS:ään ja optinen tiheys määritettiin 620 nm:ssä, jotta voitiin laskea CFU:iden (pesäkkeitä muodostavien yksiköiden) määrä millilitrassa. Se hajottaa tietyn tilavuuden, joka sisältää 4 x 107 CFU:ta kussakin lautasessa. Mitattu tilavuus sekoitettiin ja homogenisoitiin 15 ml:ssa agaroosia, joka sulatettiin noin 45 °C:een. Tämä bakteerisuspensio tarjoiltiin petrimaljoihin ja jätettiin jähmettymään huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen tehtiin halkaisijaltaan 2 mm:n reikiä steriilillä rei’illä.

Testinäytteet valmistettiin liuottamalla 1 mg puhdasta yhdistettä 500 μl:aan DMSO:ta, johon laitettiin 8 μl näytettä kahtena kappaleena ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 min. Tämän jälkeen lisättiin ravintoalusta, joka sisältää sulatettua agar-agaria ja TSB:tä, inkuboitiin 18 tuntia 37 ºC:ssa ja sen jälkeen mitattiin inhibitiovyöhykkeiden halkaisija yhdisteen aktiivisuuden perusteella. Positiivisina kontrolleina käytettiin eri antibiootteja, ampisilliiniä (50 mg/ml), kanamysiiniä (10 mg/ml) ja tetrasykliiniä (4,12 mg/ml) laimennoksessa 1:100 PBS:ssä, ja negatiivisina kontrolleina käytettiin DMSO:ta ja PBS:ää, jokaista kontrollia annosteltiin 8 μl kutakin kuoppaa kohti. Estovyöhykkeiden halkaisijat mitattiin millimetreinä, ja tulokset ilmoitettiin toimintayksikköinä suhdeluvun mukaisesti, jonka mukaan 1 toimintayksikkö (UA) vastaa 0,1 mm:n estovyöhykettä.

LISÄAINEISTO

LÄHTEET

TAUSTAA KIITOKSET

Tekijät kiittävät Kolumbian kansallispiirin kansallista yliopistoa taloudellisesta tuesta tälle hankkeelle. Lisäksi kiitämme ydinmagneettiresonanssilaboratoriota ja massaspektrometrialaboratoriota niiden tuesta NMR-spektrien ja HR-ESI-MS:n tallentamisessa. Lisäksi kirjoittajat haluaisivat kiittää Javerianan yliopistoa optisista rotaatioista, FIDIC:iä (Kolumbian inmunologian säätiöinstituutti) CD-spektrien tallentamisesta ja erityisesti professori J. M. Lozanoa antibakteerisen aktiivisuuden määrityksistä.

1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.

2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.

4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.

5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.

6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.

7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.

8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.

9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.

10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.

11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.

12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.

13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.

14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.

15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.

16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.

17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.

18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.

19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.

20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.

21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.

22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.

23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.

24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.

25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.

26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.

27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Menetelmät. 1991, 137, 167.

28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bull. 2009, 57,

Vastaanotettu 26/6/09; hyväksytty 6/11/09; julkaistu verkossa 10/3/10

* email: [email protected]

TÄYDENTÄVÄ MATERIAALI