Artarestiini-2:n kompleksirakenne G-proteiinikytkentäiseen reseptoriin sitoutuneena
Arr2-NTSR1-kompleksin funktionaalinen karakterisointi ja rakenteen määritys
Artarestiinien vuorovaikutus näkymättömien GPCR:ien kanssa on verrattain heikkoa ja erittäin dynaamista, mutta stabiilin kompleksin aikaansaaminen on olennainen vaihe rakennetutkimuksille. Siksi ennen rakennetutkimuksiamme luonnehdimme NTSR1:n vuorovaikutusta arretiinien kanssa käyttämällä kaupallista NanoBiT-järjestelmää, joka on tehokas menetelmä proteiini-proteiini-interaktioiden havaitsemiseen.17 NTSR1:n havaittiin olevan vuorovaikutuksessa sekä Arr2:n että Arr3:n kanssa, mikä voimistuu lisääntyneillä pitoisuuksilla peptidiagonistia, neurotensiiniä (NTS). Arrestiinimutantit, joiden kolme C-terminaalista hydrofobista jäännöstä on mutatoitu alaniiniksi (3 A-mutantit; I386A, V387A ja F388A Arr2:ssa ja I387A, V388A ja F389A Arr3:ssa),18,19 jotka tunnetaan esiaktivoituina arrestiinimuotoina, osoittivat lisääntynyttä sitoutumisaktiivisuutta NTSR1:n kanssa (kuva. 1b).
Testasimme lisäksi arrestiinin ja NTSR1:n vuorovaikutusta Tango-määrityksellä, joka on solupohjainen määritysmenetelmä, jolla määritetään kalvoproteiinien sitoutumisaktiivisuus liukoisiin sitoutumiskumppaneihin.7,20 Tango-määrityksemme osoittivat, että NTSR1:n sitoutumisaktiivisuus Arr2:een kasvoi vastaavasti noin kaksi- tai kolminkertaiseksi, kun siihen lisättiin peptidiagonisti NTS:ää tai pienimolekyylistä agonistia ML314, joka on tunnettu positiivisallosterinen modulaattori (PAM),21,22 . Arr2:n sitoutumisaktiivisuus NTSR1:een kasvoi noin nelinkertaiseksi, kun käytettiin sekä NTS:ää että ML314:ää. NTSR1:n sitoutuminen Arr2:een tehostui entisestään lisäämällä 3A-mutaatioita (kuva 1c).
Toteutimme edellä esitettyjen tulosten perusteella rakennetutkimuksia käyttämällä Arr2:n 3A-mutanttia kompleksissa NTSR1:n kanssa NTS:n ja ML314:n läsnä ollessa, mutta kompleksi dissosioitui kryo-EM-ristikoissa näytteen vitrifikaatioon liittyvien haittavaikutusten vuoksi. Tämän dissosiaatio-ongelman ratkaisemiseksi fuusioimme ihmisen villityyppisen NTSR1:n ihmisen 3A-mutantin Arr2:n kanssa sen C-terminaalissa kolmen aminohapon linkkerillä (GSA). Sytokromi b562 RIL-domeeni (BRIL) fuusioitiin myös reseptorin N-terminaaliin kompleksin ilmentymisen lisäämiseksi. Arr2 stabiloitiin edelleen fuusioimalla Fab30-kevytketju, joka on vasta-ainefragmentti, jota käytetään Arr2:n aktiivisen muodon23 stabiloimiseen sen C-terminaalissa 12 aminohapon linkkerillä (GSAGSAGSAGSA). Fuusiokompleksin konstruktiota ekspressoitiin yhdessä His8-merkityn Fab30-raskasketjun ja GPCR-kinaasin, GRK5:n, kanssa, joka fosforyloi reseptorin parempaa arrestiinin sitoutumista varten. Kompleksiproteiini puhdistettiin nikkeli-affiniteettikolonnilla 2 µM NTS:n ja 10 µM ML314:n läsnäollessa, minkä jälkeen se konsentroitiin ja puhdistettiin edelleen geelisuodatuskromatografialla rakennetutkimuksia varten (Kuva 1d, e, ks. tarkemmat tiedot kohdasta ”Materiaalit ja menetelmät”.
Puhdistetulla BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30-kompleksiproteiinilla havaittiin verrattain korkeaa sulamislämpötilaa (Tm), joka sijaitsi 58 °C:n lämpötilassa ja joka määritettiin thermostabiliteettisiirtymämäärityksessä24 (”thermostabilability shift assay24”) (Kuva 1f). Se jakautui tasaisesti, kun sitä tarkasteltiin negatiivisella EM-värjäyksellä (kuva 1g). Yksittäisten hiukkasten kryo-EM-tiedot kerättiin FEI Titan Krios -mikroskoopilla. Kaikkiaan tallennettiin 17 206 mikrokuvaa, ja yli 5 miljoonaa monimutkaista hiukkasta poimittiin ja lajiteltiin tietojen jatkokäsittelyä varten. 2D-luokittelussa tunnistettiin monimutkaisten hiukkasten useita konformaatioita. Intensiivisen 3D-luokittelun jälkeen 220 464 hiukkasta (~4,5 % kaikista alkuperäisistä hiukkasista) valittiin rakenteen rekonstruointia varten (täydentävät tiedot, kuva S1). Tiheyskartan keskimääräinen resoluutio oli 4,8 Å, joka määritettiin Fourier-kuoren korrelaatiokriteerin (FSC) 0,143 perusteella, ja Arr2:n ja Fab-muuttujan alueen (Fv) muodostaman ydinrakenteen resoluutioalue ulottui 4,5 Å:iin asti (kuva 2a ja lisätiedot, kuvat S1, S2). NTSR1:n ja Arr2:n välinen konformaatioheterogeenisuus on kuitenkin edelleen läsnä, kuten monirunkoanalyysi osoittaa (lisätiedot, kuva S3), vaikka lopullisessa rekonstruktiossa käytettiin hyvin pientä osaa koko aineistosta.
Arr2-NTSR1-kompleksin rakennemalli. a Elektronitiheyskartta NTSR1-Arr2-Fab30-kompleksin rakenteesta. Vaikka kohtuullinen ääriviivataso koko kompleksin rakenteelle on noin 0,016, tämän kartan ääriviivataso on asetettu 0,013:een, jotta koko mikkeli näkyisi. NTSR1 on merkitty ruskealla, Arr2 vihreällä, Fab30 harmaalla ja NTSR1:n transmembraanidomeenia ympäröivä mikkeli hopealla. b NTSR1-Arr2-Fab30-kompleksin kokonaisrakennemalli. Keskeiset rakenneosat on merkitty korostetuilla laatikoilla ytimen rajapinnan (mukaan lukien kaksi rajapintalaastaria) ja reseptorin ja Arr2:n välisen pyrstörajapinnan osalta. Kompleksin komponenteista käytetään samaa värikoodia kuin paneelissa (a). c NTSR1:n ja rodopsiinin päällekkäisyys johtaa Arr2:n ja visuaalisen arrestiinin erisuuntaisiin ydinrakenteisiin, jotka leikkaavat toisensa suorassa kulmassa. Neljä näkymää päällekkäisistä Arr2-NTSR1- ja visual arrestin-rhodopsiinikomplekseista, joissa Arr2 on väritetty vihreällä, NTSR1 ruskealla, visual arrestin magentalla ja rodopsiini violetilla. Rodopsiini-visuaalisen arrestiinikompleksin rakennemallin PDB-koodi on 5W0P.
Kohtalaisesta resoluutiosta huolimatta EM-kartta mahdollisti NTSR1:n, Arr2:n ja Fab30:n sijainnin ja orientaation selkeän määrittämisen kompleksin kokoonpanossa (kuva 2). Kompleksimalli rakennettiin telakoimalla NTSR1-NTS-kompleksin kiderakenne (PDB: 4GRV),14 ja fosforyloituun vasopressiinin C-terminaaliseen peptidiin (V2Rpp) ja Fab30:een (PDB: 4JQI)23 sitoutuneen Arr2:n rakenne (PDB: 4JQI)23 tiheyskarttaan, minkä jälkeen suoritettiin manuaalinen mallin säätö, reaalitilan tarkennus ja iteratiiviset Rosetta-jalostuksen ja mallin uudestaanrakentamisen syklit EM-kartan perusteella.25 Lopullinen kompleksimalli sisältää NTSR1:n jäännökset R49:stä T416:een, joista ICL3 (A270-P292) ja kierteestä 8 ja C-terminaalisesta hännästä (P384-S404) puuttuvat. Arr2:n malli sisältää jäännökset T6-M352, ja Fab30:n malli sisältää yhteensä 409 jäännöstä, jotka muodostavat sekä Fabin kevyen että raskaan ketjun. N-terminaalisesti fuusioitu BRIL ja pieni molekyyli ML314 eivät näy tiheyskartassa, joten ne eivät sisälly kompleksimalliin. Rakennemallin tilastot ja geometria on esitetty tiivistetysti lisätietojen taulukossa S1.
Ar2-NTSR1-kompleksin kokonaisrakenne
Ar2-NTSR1-kompleksi muodostuu kahden komponentin epäsymmetrisestä kokoonpanosta siten, että Arr2:n vaakasuora akseli leikkaa solukalvon sisäpinnan noin 20°:n kulmassa, mikä johtaa arrestiinin hydrofobisten C-reunan silmukoiden (L191 ja M192 sekä L334-L338) vuorovaikutukseen solukalvon kanssa (Kuva 2a, b). Tämä on johdonmukaista visuaalisen arrestiini-rodopsiinikompleksin kiderakenteen kanssa, jossa ensimmäistä kertaa näkyi epäsymmetrinen arrestiini-GPCR-kokoonpano ja vahvistettiin arrestiinin hydrofobisten C-reunan silmukoiden toiminta kalvoankkurina, joka vakauttaa arrestiinin sitoutumista kalvoon kiinnittyneeseen reseptoriin, mikä vahvistettiin myöhemmin kokeellisesti.7,26,27 Arr2:n hydrofobisten C-reunan silmukoiden vuorovaikutus solukalvokerroksen kanssa viittaa siihen, että lipidien sitomiskyky on yleinen ominaisuus arrestiiniperheen jäsenille.
Huolimatta Arr2-NTSR1-kompleksin epäsymmetrisen kokoonpanon samankaltaisuudesta Arr1-rodopsiinikompleksin kanssa, arrestiinin suhteellinen orientaatio reseptoriin nähden eroaa dramaattisesti näissä kahdessa arrestiini-reseptorikompleksissa. Näiden kahden kompleksin reseptorin TMD:n päällekkäisyys paljastaa, että Arr2:n orientaatio on kääntynyt 90° transmembraaniakselin ympäri verrattuna visuaalisen arrestiinin orientaatioon (kuva 2c). Tässä uudessa orientaatiossa ICL3:n ja sekä reseptorin TM5:n että TM6:n asennot osoittavat kohti Arr2:n N-terminaalista domeenia, jolloin ICL3:n on mahdollista muistuttaa C-terminaalista häntää vuorovaikutuksessa Arr2:n N-domeenin kanssa (kuva 2b).
Kompleksikokoonpanon konformaatiostabiilisuuden arvioimiseksi suoritimme kuusi toisistaan riippumatonta, kahden mikrosekunnin mittaista, kahden mikrosekunnin mittaista, koko atomin pituisia molekyylidynaamisia molekyylien dynaamisten simulaatioiden simulaatioiden kokonaisuutta, jotka koskivat Arr2-NTSR1kompleksia, jossa ei ollut mukana stabiloiva Fab30. Koko simuloinnin ajan C-reunan silmukka L334-L338 pysyi assosioituneena kalvolipidien kanssa ja NTSR1:n C-terminaalinen häntä pysyi vuorovaikutuksessa Arr2:n N-terminaalisen domeenin kanssa (lisätiedot, kuvat S4 ja S5). Arrestiinin ydinrakenne voi kuitenkin kiertyä rajoitetusti kryo-EM-rakenteen ympärillä, ja pidennetty sormisilmukka voi irrottautua NTSR1:n TMD-ytimestä (täydentävät tiedot, kuva S5). Nämä simulointitiedot viittaavat siihen, että sormisilmukka sekä Arr2:n ja reseptorin välinen ydinrajapinta ovat erittäin dynaamisia ja että kryo-EM-rakenteen vangitsema Arr2-NTSR1-kompleksin kokoonpano edustaa luultavasti yhtä monista konformaatiotiloista, mikä on sopusoinnussa sen tosiasian kanssa, että Arr2-NTSR1-kompleksin kokoonpanon konformaatioheterogeenisuus on edelleen olemassa lopullisessa kryo-EM-rekonstruktiossa käytetyissä kolmiulotteisen luokan hiukkasissa (lisätiedot, kuvio 3.5). S3).
Ar2-NTSR1:n ydinrajapinta
Ar2-NTSR1-kompleksi kootaan molekyylien välisillä vuorovaikutuksilla, jotka koostuvat kahdesta erillisestä päärajapinnasta: ydinrajapinnasta, joka koostuu kahdesta erillisestä laastarista arretiinin keskeisten harjusilmukoiden ja reseptorin TMD:n intrasellulaarisen puolen välissä, ja häntäjohdinrajapinnasta, joka muodostuu Arr2:n N-terminaalisen domeenin ja reseptorin C-terminaalisen hännän välisestä rajapinnasta (Kuva 2b). Arr2:n ja NTSR1:n välisen ydinrajapinnan yksi laikku on arrestiinin sormisilmukka (E66:sta L71:een), joka on asetettu reseptorin TMD:n solunsisäiseen onteloon ja jota ympäröivät reseptorin ICL1, ICL2, TM5 ja 6 (kuva 3a). Tässä konfiguraatiossa sormisilmukan yläpinta muodostaa suoran rajapinnan reseptorin TM7:n ja käärön 8 välisen käänteen kanssa (kuva 3a).
Kuva 3
Ydinrajapinnan läikkä arr2:n sormisilmukan ja reseptorin TMD:n välisen käännöksen kanssa a Arr2:n sormisilmukan ja reseptorin TMD:n solunsisäisen ontelon välissä. Tärkeimpien rajapintajäännösten sijainnit arrestiinin sormisilmukassa ja reseptorin TM7:n ja H8:n välisessä käänteessä on merkitty palloilla. NTSR1 on värjätty ruskealla ja Arr2 vihreällä. b Disulfidiristisilloitussignaalit arrestiinin sormisilmukan jäännösten D67 ja L68 sekä reseptorin jäännösten V367, S368, A369 ja N370 välillä TM7:n ja kierteiden 8 välisessä käänteessä olivat voimakkaita. Vertailun vuoksi Arr2:n jäännöksen L71 välillä, joka on sormisilmukan C-terminaalisessa päässä, ei havaittu ristisilloitussignaaleja tai ne olivat hyvin heikkoja. c Konservoituneet negatiivisesti varatut jäännökset Arr2:n ja Arr3:n sekä visuaalisten arrestiinien sormisilmukassa. d NTSR1:n ja rodopsiinin päällekkäin asettaminen johtaa eri tavoin suuntautuneisiin ytärakenteisiin (pois jätetty) mutta Arr2:n ja visuaalisen arrestiinin sormisilmukoiden hyvään suuntautumiseen. Rodopsiini on jätetty pois selkeyden vuoksi. Visuaalinen arrestiini on värjätty magentalla ja Arr2 vihreällä.
Kompleksirakenteen rajapinnan validoimiseksi teimme solupohjaisia disulfidien ristisilloituskokeita. Tässä koesarjassa Arr2:n ja NTSR1:n rajapintaan tuotiin paikkakohtaisia kysteiinijäämiä. Molempia proteiineja, joissa oli kysteiinimutaatioita, ekspressoitiin yhdessä soluissa erillisinä proteiineina. Ristisilloitustuotteet muodostuivat käsittelemällä soluja hapetusreagenssilla, ja niitä seurattiin SDS-PAGE:lla, jota seurasi western blotting Arr2:n C-terminaaliin fuusioidun Flag-tagin havaitsemiseksi. Samaa menetelmää on käytetty visuaalisen arrestiini-rodopsiinikompleksin rajapinnan validoimiseksi.7,9 Ristisilloitusreaktioita tehtiin yhteensä 177 jäännösparille, joista havaitsimme voimakkaita ristisilloitussignaaleja Arr2:n jäännösten D67 ja L68 välillä sormisilmukan keskialueella ja NTSR1:n jäännösten V367 – N370 välillä, jotka sijaitsevat TM7:n ja käärön 8 välisessä käännöksessä (kuva 3b, ja näiden rajapinnan jäännösten sijainnit on esitetty kuvassa 3a palloina). Vertailun vuoksi voidaan todeta, että sormisilmukan C-terminaalisessa päässä oleva jäännös L71 ei osoittanut lainkaan tai osoitti hyvin heikkoa ristisilloitussignaalia näiden NTSR1-jäännösten kanssa (kuvat 3a, b). Useiden sormisilmukan jäännösten havaittiin myös ristisilloittuvan ICL1:n (Q98) ja TM6:n (R294 ja A297) jäännösten kanssa, jotka ovat reseptorin TMD:n solunsisäisen ontelon osia (lisätiedot, kuva S6). Nämä ristisilloitustiedot validoivat Arr2-sormisilmukan ja reseptorin välisen rajapintalaastarin ja osoittivat, että arrestiinin sormisilmukka toimii tämän Arr2-GPCR-kompleksin ydinrajapinnan avainkomponenttina.
Arr2-sormisilmukan aminohapposekvenssit ovat rikastuneet happamilla jäännöksillä, jotka ovat samankaltaisia kuin visuaalisessa arrestiinissa (kuva 3c), jonka tiedetään sitoutuvan positiivisesti varautuneeseen TMD:n onteloon.7 Kun NTSR1 ja rodopsiini asetetaan päällekkäin, Arr2:n sormisilmukka vie saman tilan kuin visuaalisen arrestiinin vastaava alue, mutta se ei asetu yhtä syvälle TMD-onteloon kuin visuaalinen arrestiini (kuva 3d), mikä osoittaa, että Arr2:n sormisilmukan assosiaatio NTSR1:n TMD:n solunsisäisen ontelon kanssa voisi olla dynaamisempi kuin visuaalisen arrestiinin ja rodopsiinin välillä.
Ar2:n ja NTSR1:n välisen ydinrajapinnan toinen laastari on Arr2:n harja-alueiden vuorovaikutus reseptorin ICL1:n ja ICL2:n kanssa, mikä poikkeaa visuaalisen arrestiinin ja rodopsiinin kompleksin vuorovaikutuksesta. Toisin kuin molempien arretiinien sormisilmukoiden samankaltaiset orientaatiot, kahden reseptorin päällekkäisyys jätti arretiinien ydinrakenteet kahteen orientaatioon, jotka eroavat toisistaan noin 90°:n kulmassa, kuten kuvassa 2c on esitetty. Arr2:n ja visuaalisten arrestiinien ydinrakenteiden erilaiset orientaatiot niiden GPCR-komplekseissa johtavat siihen, että arrestiinien harja-alueet sitoutuvat eri tavoin reseptorien, erityisesti ICL1:n ja ICL2:n, solunsisäisiin silmukoihin näissä kahdessa arrestiini-GPCR-kompleksissa (kuvat. 2c ja 4.
Ar2:n ja NTSR1:n välinen ydinkohtainen rajapintaläikkä. a Arr2:n ja NTSR1:n välinen rajapintaläikkä, jossa Arr2:n ja NTSR1:n ICL1:n ICL1:n vuorovaikutus on yhteydessä sekä Arr2:n lariaattisilmukan että pohjasilmukan kanssa. Rajapintalaastarin jäännösten sijainnit on merkitty palloilla, ja ne on validoitu disulfidiristisilloituksella, joka on esitetty paneelissa b. b Disulfidiristisilloitus reseptorin alimman silmukan jäännöksen G286 ja reseptorin ICL1:n jäännösten L94, Q95 ja S96 välillä. c Reseptorin ICL3-jäämien ja Arr2:n N-domeenin yläpinnan jäämien välinen disulfidiristisidos. d Arr2:n N-domeenin jäämien P14 ja K160 disulfidiristisidos ICL3:n jäämien Q273, G274, Q275, C277, T278, V279 ja G280 kanssa. e Arr2:n ja NTSR1:n välinen ydinrajapinta, jossa on mahdollinen rajapinta NTSR1 ICL3:n (merkitty katkoviivalla) ja Arr2:n N-domeenin pinnan välinen rajapinta, johon viittaavat paneeleissa (c) ja (d) esitetyt disulfidien ristisilloitustiedot. Arr2:n N-domeenin mahdollisten rajapintajäännösten sijainnit on merkitty palloilla. Käytetään samaa värikoodia kuin paneelissa (a).
NTSR1:n ja rodopsiinin rakenteellinen vertailu paljastaa, että niillä on konservoitunut TMD-konformaatio, jossa niiden ICL1 omaksuu pidennetyn silmukan ja ICL2 muodostaa lyhyen spiraalin vastaavissa arrestiiniin sitoutuneissa komplekseissa. Rodopsiinin ICL2-kierre sijoittuu visuaalisen arrestiinin keskimmäisen silmukan, alimman silmukan ja lariat-silmukan muodostamaan rakoon (ns. MBL-rako).7 Arr2:ssa samaa MBL-rakoa käyttää kuitenkin NTSR1:n ICL1 (kuva 4a) arrestiinin erilaisen orientaation vuoksi. Vastaavasti NTSR1:n ICL2 kääntyy pois MBL-halkeamasta ja asettuu lariat-silmukan yläosaan (kuva 4a). Disulfidien ristisilloituskokeet osoittivat ristisilloitussignaaleja NTSR1:n ICL1:n reseptorijäämien L94-S96 ja Arr2:n alimman silmukan jäännöksen G286 välillä, mikä on johdonmukaista NTSR1:n ICL1:n rajapinnan ja Arr2:n tämän harjanteen alueen välillä (Kuva. 4b).
Reseptorin ICL3 muodostaa Arr2-NTSR1-kompleksin konformaation perusteella todennäköisesti rajapinnan β-arrestiinin N-domeenin kanssa, vaikka se ei näy tiheyskartassa (kuva 2b). Disulfidien ristisilloitustiedot osoittivat, että NTSR1:n ICL3:n jäännökset Q275, C277, T278 ja V279 ristisilloittuvat Arr2:n N-domeenin yläpinnan jäännösten T56, T58, V81 ja N83 kanssa (kuva 4c ja lisätiedot, kuva S6). Nämä ICL3:n jäännökset osoittivat myös voimakkaita ristisilloitussignaaleja Arr2:n jäännöksen K160 kanssa (kuva 4d). Muita disulfidien ristisilloitussignaaleja havaittiin useimpien NTSR1 ICL3:n jäännösten Q273-G280 ja Arr2:n jäännöksen P14 välillä (kuva 4d). Nämä ristisilloitustiedot osoittavat, että reseptorin ICL3 sijaitsee lähellä N-domeenia ja saattaa olla vuorovaikutuksessa Arr2:n N-domeenin pinnalla olevien jäännösten kanssa (kuva 4e).
Arr2-NTSR1:n häntäkohtainen rajapinta
Mikäli Arr2-NTSR1:n ydinkohtainen rajapinta on erittäin dynaaminen, NTSR1:n C-terminaalisen hännän ja Arr2:n N-domeenin välinen häntäkohtainen rajapinta näyttää samankaltaiselta kuin visuaalisessa arretiini-rhodopsiinikompleksissa9 (kuva 5). Havaitsimme elektronitiheyden ääriviivatasolla 0,016 (jolla kokonaiskompleksirakenteen tiheys voidaan esittää kunnolla) noin kymmenestä NTSR1:n C-terminaalisen hännän jäännöksestä, jotka sitoutuvat Arr2:n ensimmäiseen β-säikeeseen (kuva 5a). Yksityiskohtaisia tietoja tästä C-terminaalisen hännän alueesta, mukaan lukien sen erityiset jäännökset, on kuitenkin vaikea tunnistaa tiheyskartan rajallisen resoluution vuoksi. NTSR1-Arr2-Fab30-fuusioproteiinin analyysit massaspektrometrisesti (kuva 5b ja lisätiedot, kuva S7) paljastivat, että seitsemän seriini- tai treoniinijäämää S401:stä T416:een NTSR1:n C-terminaalisessa hännässä oli fosforyloitunut, mikä viittaa tämän alueen mahdolliseen osallisuuteen sitoutumisessa arretiinin N-domeenin positiivisesti varautuneeseen pintaan. Disulfidiristisilloituskokeet osoittivat, että Arr2:n jäännös P14 ensimmäisen β-juosteen C-terminaalisessa käänteessä ristisilloittui voimakkaasti reseptorin jäännösten H406-S410 kanssa (kuva 5d ja lisätiedot, kuva S6), mikä viittasi siihen, että reseptorin C-terminaaliset jäännökset H406:n kohdalla ovat todennäköisesti se alue, joka sitoutuu arrestiinin N- domeeniin (kuva. Tiheyskartta ääriviivatasolla 0,016 kattaa noin kymmenen reseptorin C-terminaalisen hännän jäännöstä. Reseptorin C-terminaalinen häntä on väritetty ruskealla, Arr2 vihreällä ja EM-kartta harmaalla. b NTSR1-Arr2-Fab30-fuusioproteiinin massaspektrometria-analyysi osoitti, että C-terminaaliset jäännökset S401, S403, S404, S409, S410, T413, T416 ja Y418 ovat fosforyloituneet proteiininäytteessä. c NTSR1:n C-terminaalisen hännän ja Arr2:n ensimmäisen β-juosteen välinen hännän rajapinta. Disulfidiristisilloitus (esitetty paneelissa d) viittaa siihen, että NTSR1:n C-terminaalisen hännän alue, joka sitoutuu Arr2:n N-domeeniin, on todennäköisesti jäämien H406 ja L417 välissä. Ristisilloitussignaaleja osoittavat jäännökset on merkitty paneelissa (d) olevien ristisilloitustietojen perusteella. d Disulfidiristisilloitustiedot P14:stä Arr2:n N-domeenin yläpinnalla reseptorin C-terminaalisten jäännösten H406-S410 kanssa; ja β-arrestiinin jäännös R103 ristisilloitettuna reseptorin C-hännän jäännöksen L417 kanssa.
Malli Arr3-GPCR-vuorovaikutukselle
Ihmisen genomissa on kaksi β-arrestiinin alatyyppiä: Arr2 ja Arr3, joilla on yli 53 prosentin sekvenssi-identiteetti, mutta joilla on sekä joitakin päällekkäisiä että joitakin toisistaan poikkeavia tehtäviä. Koska Arr3:lla oli samanlainen NTSR1:n sitoutumisaffiniteetti kuin Arr2:lla (kuva 1b), halusimme testata, onko Arr3:n sitoutumistapa NTSR1:ään konservoitunut Arr2:n kanssa. Disulfidiristisidontakokeemme osoittivat, että Arr3:n sormisilmukan jäännökset E67-L72 (vastaavat Arr2:n E66-L71:ää) ristisidottuivat vastaavien jäännösten (A369 ja N370) kanssa NTSR1:n TM7:n ja käärön 8 välisessä käänteessä (lisätiedot, kuva S8), mikä osoittaa, että sormisilmukan rajapinta reseptorin TM7:n ja H8:n kanssa on konservoitunut näiden kahden β-arrestiinin välillä.
Lisäksi disulfidiristisilloitustiedot osoittivat, että Arr3:n jäännös P15 (vastaa Arr2:n P14:ää) ristisilloittui reseptorin C-terminaalisen hännän jäännösten N405-T407 kanssa, mikä viittaa samankaltaiseen hännän rajapintaan Arr3:n ja NTSR1:n välillä (Täydentävät tiedot, kuva S8). NTSR1 ICL3:n jäännösten ja Arr3:n N-domeenin jäännösten välillä havaittiin myös samankaltainen ristisilloituskuvio, mukaan lukien P15 ensimmäisen β-säikeen C-terminaalissa ja K161 (vastaa Arr2:n K160:aa) ylimpien β-säikeiden välisessä silmukassa (lisätiedot, kuva S8). Yhdessä nämä ristisilloitustiedot viittaavat siihen, että Arr3:n ja NTSR1:n kokonaiskokoonpano on samanlainen kuin Arr2:n ja NTSR1:n kokoonpano tässä ydinkytkentäkonfiguraatiossa.
Malli 5-HTR1A:n ja 5-HTR1B:n β-arrestiinien rekrytoinnille
Monilla GPCR-reseptoreilla, kuten serotoniinireseptoreilla 5-HTR1A ja 5-HTR1B sekä useilla dopamiinireseptoreilla, joko puuttuu tai niissä on hyvin lyhyt C-terminaalinen häntä, ja niiden ehdotetaan käyttävän ICL3:a vaihtoehtoisina rajapintoina β-arrestiinien rekrytoimiseksi.28 5-HTR1A:lla ja 1B:llä on pitkät ICL3:t, joissa on useita fosforylaatiokohtia mahdollista vuorovaikutusta varten β-arrestiinien positiivisesti varautuneiden N-domeenien kanssa. Biokemialliset sitoutumismäärityksemme osoittivat, että molemmat reseptorit sitoutuivat Arr2:een ja 3:een samanlaisella aktiivisuudella kuin NTSR1 Arr2:n kanssa (lisätiedot, kuva S9). Kun malliesimerkkinä käytettiin visuaalista arrestiini-rodopsiinikompleksirakennetta, oli kuitenkin vaikea mallintaa 5-HTR1A:n tai 1B:n fosforyloituneen ICL3:n sitoutumistapaa β-arrestiinien N-domeenin positiivisesti varautuneeseen rakoon. Tämä johtuu siitä, että TM5 ja 6 sekä rodopsiinin ICL3 sijaitsevat visuaalisen arrestiini-rodopsiinikompleksin rakenteessa vastakkaisella paikalla kuin arrestiinin N-domeenin positiivisesti varautunut pinta.
Arr2-NTSR1-kompleksirakenteessa on kuitenkin nähtävissä erilainen kompleksikokoonpano, jossa Arr2:ta on käännetty 90° visuaalisen arrestiinin asemasta arrestiini-rodopsiinikompleksissa (kuva 2c). NTSR1:n TM5 ja TM6 ovat siis Arr2:n N-domeenin etupinnan yläpuolella, jolloin reseptorin ICL3 (ei näy rakenteessa) pääsee Arr2:n positiivisesti varautuneeseen N-domeeniin (kuva 4e). Disulfidiristisilloitustietomme osoittavat, että NTSR1 ICL3 voi olla vuorovaikutuksessa Arr2:n ja 3:n N-domeenin positiivisesti varautuneen raon kanssa (kuva 4c-e, lisätiedot, kuvat S6 ja S8). Siksi Arr2-NTSR1-kompleksin rakenne voi toimia sopivana mallina β-arrestiinien ja 5-HTR1A:n ja 5-HTR1B:n rajapinnan mallintamiseen.
Käyttäen Arr2-NTSR1-rakennetta mallina ja ergotamiiniin sitoutuneen 5-HTR1B:n kiderakennetta 5-HTR1B:n alustavana mallina (PDB: 4IAR),29 loimme Arr2-5-HTR1B-kompleksin homologisen mallin, jossa Arr2:n ja 5-HTR1B:n välinen ydinrajapinta on samanlainen kuin Arr2-NTSR1-kompleksissa (Kuva 6a, b). Tämän jälkeen teimme disulfidiristisilloituskokeita testataksemme homologiamallissa esitetyn Arr2-5-HTR1B:n kompleksikokoonpanon (kuva 6c ja lisätiedot, kuva S10).
Arr2:n sitoutumistapa 5-HTR1B:n kanssa. a Arr2-5-HTR1B-homologiamalli, joka perustuu Arr2-NTSR1-kompleksiin mallina. Laatikoilla korostetut Arr2:n ja 5-HTR1B:n väliset ydinrajapinta-alueet. b Arr2:n ja 5HTR1B:n väliset ydinrajapinta-alueet, joiden rajapintajäännökset (kuvattu palloina) on validoitu disulfidiristisilloituksella, joka on esitetty paneelissa (c). c Disulfidiristisilloitus jäännösparien välillä Arr3:n ja 5-HTR1B:n välisissä ydinrajapinta-alueissa. d Sarjakuvaesitys 5-HTR1B:n ICL3:sta, joka ulottuu TM5:stä ja TM6:sta, jossa fosforylaatiokoodin jäännökset on korostettu punaisella. e Disulfidiristisilloittuminen jäännösparien välillä Arr2:n N-domeenin ja 5-HTR1B:n ICL3:n välisellä rajapinnalla. f Sarjakuvamalli havainnollistamaan vuorovaikutusta 5-HTR1B:n ICL3:n vuorovaikutuksen Arr2:n positiivisesti varautuneen N- domaiinin kanssa. Malli osoittaa arrestiinin vuorovaikutuksen reseptorin TMD-ytimen ja ICL3:n kanssa sekä arrestiinin C-reunan silmukoiden lipidikiinnityksen (merkitty tähdellä). Kaksoisnuoli osoittaa arrestiinin konformaatiokehityksen reseptoriytimen ympärillä.
Havaitsimme ristiinkytkeytymissignaaleja Arr2:n sormisilmukan jäännösten D67 L68, V70 ja L71 sekä 5-HTR1B:n TM7:n ja käärön 8 välisessä käännöksessä sijaitsevien jäännösten N373, E374 ja D375 välillä (kuva 6c). Sormisilmukan jäännökset D67, L68, V70 ja L71 ristikytkeytyivät reseptorin jäännösten R308 ja K311 kanssa TM6:n sisäpinnalla (täydentävät tiedot, kuva S10). Nämä ristisilloitustiedot tukivat Arr2-sormisilmukan konservoitua sitoutumistapaa 5-HTR1B:n TM-domeenin solunsisäisen ontelon kanssa (Kuva 6a, b). Disulfidiristisilloitustiedot osoittivat myös ristisilloitussignaaleja Arr2:n jäännösten R285 ja G286 välillä arrestiinin pohjasilmukassa 5-HTR1B:n ICL1:n jäännöksen K79 kanssa (kuva 6c ja lisätiedot, kuva S10). Tämä spesifinen ristisilloittuminen on johdonmukainen vain Arr2-NTSR1-mallissa esiintyvän arrestiinin orientaation kanssa, mutta se ei ole yhteensopiva visuaalisen arrestiini-rodopsiinikompleksin kanssa. Yhdessä nämä ristisilloitustiedot tukivat Arr2-harjun alueen ja 5-HTR1B:n TM-domeenin solunsisäisen puolen välistä ydinrajapintaa, joka on konservoitunut Arr2-NTSR1-kompleksin rajapinnan kanssa (Kuva 6a-c).
5-HTR1B:ssä on useita seriini- ja treoniinijäännöksiä sen pitkän ICL3:n keskeisellä alueella, jotka voidaan fosforyloida, jotta ne voivat kiinnittyä positiivisesti varautuneen arrestiinin N- domeenin pintaan (Kuva 6d). Suunnittelimme kysteiiniparimutaatioita reseptorin ICL3:n ja Arr2:n N-domeenin väliseen mahdolliseen rajapintaan ja havaitsimme, että ICL3:n jäännökset T268, S295, L298 ja E300 olivat ristisilloittuneet ylimmän β-arkkitehtuurilevyn pinnalla oleviin jäännöksiin, mukaan luettuina Arr2:n T56, V81, N83, K147 ja K157 (kuva 6e ja lisätiedot, kuva S10). ICL3:n jäännökset S260 ja T268 osoittivat ristikytkentäsignaaleja Arr2:n ensimmäisen β-säikeen jäännösten K11 ja Arr2:n ensimmäisen β-säikeen jälkeisen käänteen N15 kanssa (kuva 6e ja lisätiedot, kuva S10). Jäännös S260 on lähellä TM5:n C-terminaalista päätä, ja sen ristikytkeytyminen K11:n kanssa Arr2:n N-domeenin positiivisesti varautuneella puolella on mahdollista vain Arr2-NTSR1-suuntautuneisuudessa, mutta ei visuaalisen arretiini-Rodopsin-suuntautuneisuudessa, koska visuaalisen arretiini-Rodopsin-kompleksirakenteessa sekä reseptorin TM5 että TM5 ja 6 sijaitsevat arretiinin N-domeenin positiivisesti varautuneen pinnan takapuolella.
Havaitsimme myös lähes identtisen Arr2-ristikytkentämallin 5HTR1A:n ja 5-HTR1B:n välillä. Ristisilloitussignaaleja havaittiin Arr2:n sormisilmukan jäännösten D67, L68, V70 ja L71 sekä 5-HTR1A:n TM7:n ja käärön 8 välisessä käänteessä olevien jäännösten N404, K405 ja D406 (vastaa 5-HTR1B:n N373:a, E374:ää ja D375:tä) välillä (lisätiedot, kuva S11). Sormisilmukan jäännökset D67 ja L68 olivat myös ristisidoksissa reseptorin jäännösten R339 ja K342 (vastaavat 5-HTR1B:n R308 ja K311) kanssa TM6:n sisäpinnalla (lisätiedot, kuva S11). Lisäksi havaitsimme disulfidiristisidoksia Arr2:n alimman silmukan jäännösten R285 ja G286 ja 5-HTR1A:n ICL1:n jäännöksen L67 välillä (vastaa 5-HTR1B:n K79:ää) (täydentävät tiedot, kuva S11). Nämä ristisilloitustiedot tukevat samanlaista Arr2:n ja 5-HTR1A:n ja 5-HTR1B:n välistä ydinrajapintaa, joka on konservoitunut Arr2-NTSR1-kompleksin kanssa (Kuva 6a, c).
5-HTR1A:n ICL3 sisältää yli 100 aminohappojäännöstä (233-336), joissa on 12 seriini- tai treoniinijäämää, jotka muodostavat kuusi osittaista fosforylaatiokoodia yhdessä glutamiinihappo- tai asparagiinihappo jäännöksen kanssa (Täydentävät lisäykset, Kuva S12). Suunnittelimme kysteiiniparimutaatioita kartoittaaksemme tämän reseptorin ICL3:n ja Arr2:n N-domeenin välisen mahdollisen rajapinnan. Ristisilloitustiedot osoittivat, että ICL3:n jäännökset V230, T240, P250, R261, K270 ja D285 ristisilloittuvat Arr2:n N-domeenin V81:n ja K160:n kanssa (lisätiedot, kuva S11). Arr2:n ensimmäisen β-säikeen jäännös P14 ristisidoutui voimakkaasti 5-HTR1A:n ICL3:n jäännösten N300, P308, P315, P318, P321 ja R323 kanssa (täydentävät tiedot, kuva S11).Nämä ristisilloitustiedot yhdessä Arr2-5-HTR1B-kompleksin homologiamallin kanssa ovat antaneet kokonaiskuvan siitä, miten 5-HTR1A ja 5-HTR1B rekrytoivat Arr2:n.
Tässä artikkelissa raportoimme Arr2:n rakenteen kompleksissa NTSR1:n, A-luokan GPCR:n, kanssa kryo-EM-yksittäishiukkasanalyysillä. Vaikka reseptorin C-terminaalisen hännän ja positiivisesti varautuneen arrestiinin N-domeenin välisen hännän rajapinnan sitoutumistapa on konservoitunut visuaalisen arrestiini-rodopsiinikompleksin kanssa, tässä rakenteessa näkyy Arr2:n erilainen orientaatio kuin visuaalisessa arrestiini-rodopsiinikompleksissa. Homologinen mallintaminen ja disulfidiristisidosten rajapintakartoitus osoittavat, että tämä ydinrajapinta on konservoitunut Arr2-komplekseissa 5-HTR1A- ja 1B-alaperheen kanssa. Näissä kompleksimalleissa Arr2:n orientaatio mahdollistaa sen, että reseptorin ICL3 pääsee Arr2:n N-domeenin pinnalle, mikä antaa GPCR:lle, jolla ei ole C-terminaalista häntää, mahdollisuuden käyttää ICL3:a vuorovaikutuksessa arretiinin N-domeenin kanssa. Koska Arr2 ja Arr3 ovat ubikvitaarisesti ilmentyviä proteiinikumppaneita monien ei-näkyvien GPCR:ien signaalinsiirrossa, rakenteelliset ja biokemialliset tutkimuksemme Arr2:n vuorovaikutuksesta NTSR1- ja 5-HTR1-alatyypin jäsenten kanssa ovat tarjonneet vaihtoehtoisen mallin Arr2:n ja Arr3:n vuorovaikutuksen ymmärtämiseksi ei-näkyvien GPCR:ien kanssa.