Auxotrofia
GenetiikkaEdit
In genetics, kannan sanotaan olevan auxotrofinen, jos siinä on mutaatio, joka tekee siitä kyvyttömän syntetisoimaan välttämätöntä yhdistettä. Esimerkiksi hiivamutantti, jonka urasiilisynteesireitin geeni on inaktivoitunut, on urasiilia auxotrofinen (esim. jos hiivan Orotidiini 5′-fosfaattidekarboksylaasigeeni on inaktivoitunut, tuloksena oleva kanta on urasiilia auxotrofinen). Tällainen kanta ei pysty syntetisoimaan urasiilia, ja se pystyy kasvamaan vain, jos urasiilia voidaan ottaa ympäristöstä. Tämä on vastakohta urasiiliprototrofiselle tai tässä tapauksessa villityyppiselle kannalle, joka voi edelleen kasvaa ilman urasiilia. Auxotrofisia geneettisiä merkkiaineita käytetään usein molekyyligenetiikassa; niitä käytettiin tunnetusti Beadlen ja Tatumin Nobel-palkitussa työssä, joka koski yhden geenin ja yhden entsyymin hypoteesia ja jossa geenimutaatiot yhdistettiin proteiinimutaatioihin. Tämä mahdollistaa sitten biosynteettisten tai biokemiallisten polkujen kartoituksen, jonka avulla voidaan määrittää, mikä entsyymi tai mitkä entsyymit ovat mutaatioita ja toimintahäiriöitä tutkituissa auxotrofisissa bakteerikannoissa.
Tutkijat ovat käyttäneet tiettyjen aminohappojen suhteen auxotrofisia E. coli -kantoja muiden kuin luonnollisten aminohappoanalogien lisäämiseksi proteiineihin. Esimerkiksi fenyylialaniinille auxotrofisia soluja voidaan kasvattaa väliaineessa, jota on täydennetty analogilla, kuten para-atsidofenyylialaniinilla.
Monet elävät olennot, mukaan lukien ihminen, ovat auxotrofisia suurten luokkien kasvuun tarvittavien yhdisteiden suhteen, ja niiden on saatava nämä yhdisteet ravinnosta (ks. vitamiinit, välttämättömät ravintoaineet, välttämättömät aminohapot, välttämättömät rasvahapot).
Vitamiinien auxotrofian monimutkainen evoluutiomalli eukaryoottisessa elämänpuussa liittyy läheisesti eliöiden keskinäiseen riippuvuuteen.
Mutageenisuuskoe (tai Amesin testi)Edit
Salmonellan mutageenitesti (Amesin testi) käyttää useita histidiinille auxotrofisia Salmonella typhimurium -kantoja testatakseen, voiko tietty kemikaali aiheuttaa mutaatioita, havainnoimalla sen auxotrofista ominaisuutta vasteena lisättyyn kemialliseen yhdisteeseen. Kemiallisen aineen tai yhdisteen aiheuttama mutaatio mitataan soveltamalla sitä histidiiniä sisältävällä levyllä oleviin bakteereihin ja siirtämällä bakteerit sitten uudelle levylle, jossa ei ole riittävästi histidiiniä jatkuvaan kasvuun. Jos aine ei mutatoi bakteerien genomia auxotrofisesta histidiiniin takaisin prototrofiseen histidiiniin, bakteerit eivät näytä kasvavan uudella levyllä. Vertaamalla uudella levyllä olevien bakteerien suhdetta vanhan levyn bakteereihin ja samaa suhdetta kontrolliryhmän bakteereihin voidaan siis määrittää, kuinka mutageeninen aine on, tai pikemminkin, kuinka todennäköisesti se aiheuttaa mutaatioita DNA:ssa. Kemikaalia pidetään Amesin testissä positiivisena, jos se aiheuttaa mutaatioita, jotka lisäävät havaittua palautumisnopeutta, ja negatiivisena, jos se on samanlainen kuin kontrolliryhmässä. Odotettavissa on normaali, mutta pieni määrä revertanttipesäkkeitä, kun auxotrofinen bakteeri istutetaan väliaineeseen, jossa ei ole sen tarvitsemaa metaboliittia, koska se voi muuntua takaisin prototrofiseksi. Tämän mahdollisuus on vähäinen, minkä vuoksi muodostuu hyvin pieniä pesäkkeitä. Jos kuitenkin lisätään mutageenista ainetta, revertanttien määrä olisi selvästi suurempi kuin ilman mutageenista ainetta. Amesin testiä pidetään periaatteessa positiivisena, jos aine lisää mutaation mahdollisuutta bakteerien DNA:ssa niin paljon, että mutageenilevyn ja kontrolliryhmän levyn revertanttien määrässä on mitattavissa oleva ero. Negatiivinen Ames-testi tarkoittaa, että mahdollinen mutageeni ei ole aiheuttanut revertanttien määrän lisääntymistä, ja positiivinen Ames-testi tarkoittaa, että mahdollinen mutageeni on lisännyt mutaation mahdollisuutta. Näitä mutageenisia vaikutuksia bakteereihin tutkitaan mahdollisena indikaattorina samoista vaikutuksista suurempiin organismeihin, kuten ihmisiin. On ehdotettu, että jos mutaatio voi syntyä bakteerien DNA:ssa mutageenin vaikutuksesta, sama vaikutus voisi esiintyä myös suuremmissa eliöissä aiheuttaen syöpää. Negatiivinen Amesin testitulos voisi viitata siihen, että aine ei ole mutageeni eikä aiheuta kasvainten muodostumista elävissä organismeissa. Kuitenkin vain muutamia Ames-testin tuloksena saaduista positiivisista kemikaaleista pidettiin merkityksettöminä, kun niitä testattiin suuremmissa organismeissa, mutta bakteereille tehtyä positiivista Ames-testiä ei silti voitu liittää lopullisesti syövän ilmenemiseen suuremmissa organismeissa. Vaikka se voi olla mahdollinen kasvainten määräävä tekijä eläville organismeille, ihmisille, eläimille ja niin edelleen, lisää tutkimuksia on saatava valmiiksi, jotta voidaan tehdä johtopäätös.
Auxotrofiaan perustuvat menetelmät luonnottomien aminohappojen sisällyttämiseksi proteiineihin ja proteomeihinToimitus
Lukuisia luonnottomia aminohappoja, jotka muistuttavat muodoltaan, kooltaan ja kemiallisilta ominaisuuksiltaan kanonisia vastineitaan, tuodaan rekombinanttivirtaisiin proteiineihin auxotrofisten ekspressioisäntien avulla. Esimerkiksi metioniini- (Met) tai tryptofaani- (Trp) auxotrofisia Escherichia coli -kantoja voidaan viljellä määritellyssä minimialustassa. Tässä koejärjestelyssä on mahdollista ekspressoida rekombinanttiproteiineja, joiden kanoniset Trp- ja Met-jäämät on korvattu kokonaan erilaisilla väliaineeseen lisätyillä vastaavilla analogeilla. Tämä menetelmä johtaa uudenlaiseen proteiinitekniikkaan, jota ei suoriteta DNA-tasolla tapahtuvalla koodonimanipulaatiolla (esim. oligonukleotidiohjatulla mutageneesillä) vaan tehokkaan valikoivan paineen alaisena tapahtuvalla proteiinien translaatiotasolla tapahtuvalla koodonien uudelleensijoittelulla. Siksi menetelmää kutsutaan nimellä selective pressure incorporation (SPI).
Yksikään tähän mennessä tutkittu organismi ei koodaa muita aminohappoja kuin kaksikymmentä kanonista aminohappoa; kaksi muuta kanonista aminohappoa (selenokysteiini, pyrrolysiini) lisätään proteiineihin koodaamalla translaation lopetussignaaleja uudelleen. Tämä raja voidaan ylittää metabolisesti vakaiden auxotrofisten mikrobikantojen adaptiivisella laboratorioevoluutiolla. Esimerkiksi vuonna 2015 tehtiin ensimmäinen selvästi onnistunut yritys kehittää Escherichia coli -bakteeria, joka pystyy selviytymään pelkästään luonnottomalla aminohapolla tienopyrrolyyli)alaniinilla ainoana tryptofaanin korvikkeena.