Beta-Galaktosidaasimääritys (A parempi Miller)

paluu protokolliin

Tausta

β-Galaktosidaasia koodaa lacZ-geeni lac-operonista E. coli. Se on suuri (120 kDa, 1024 aminohappoa) proteiini, joka muodostaa tetrameerin. Entsyymin tehtävänä solussa on pilkkoa laktoosi glukoosiksi ja galaktoosiksi, jotta niitä voidaan käyttää hiilen/energian lähteinä. Synteettinen yhdiste o-nitrofenyyli-β-D-galaktosidi (ONPG) tunnistetaan myös substraattina, ja se pilkkoutuu galaktoosiksi ja o-nitrofenoliksi, jolla on keltainen väri. Kun ONPG:tä on reaktiossa enemmän kuin entsyymiä, o-nitrofenolin tuotanto aikayksikköä kohti on verrannollinen β-galaktosidaasin konsentraatioon; näin ollen keltaisen värin tuotantoa voidaan käyttää entsyymin konsentraation määrittämiseen.

Miksi siis välitämme? Yleensä kokeet suunnitellaan siten, että solun β-galaktosidaasikonsentraatio on tutkittavan järjestelmän jonkin näkökohdan mittari. Tutkija voi esimerkiksi sulauttaa promoottorin lacZ-geeniin ja käyttää β-Gal-pitoisuutta promoottorin aktiivisuuden mittarina eri olosuhteissa. Jeffrey Miller julkaisi vuonna 1972 kirjan ”Experiments in Molecular Genetics”, joka sisälsi protokollan β-Galin määrän määrittämiseksi ONPG:n avulla. Tämän vuoksi ONPG/β-Gal-määrityksiä kutsutaan ”Miller-määrityksiksi”, ja standardoitu β-Gal-aktiivisuuden määrä on ”Miller-yksikkö”.

1 Miller-yksikkö = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420}) – (1.75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600}))} }

joissa:

• Abs420 on keltaisen o-nitrofenolin absorbanssi,
• Abs550 on solujätteen aiheuttama hajonta, joka kerrottuna 1:llä.75 likimain vastaa 420 nm:ssä havaittua hajontaa,
• t = reaktioaika minuutteina,
• v = tutkittavan viljelmän tilavuus millilitroina,
• Abs600† kuvastaa solutiheyttä.

†Huomaa, että tämä arvo on erilainen kullakin käytetyllä spektrofotometrillä, ja se olisi kalibroitava levittämällä laimennoksia tunnetuista Abs600-viljelmistä pesäkkeitä muodostavien yksiköiden määrittämiseksi Abs600:aa kohti.

Kirjassaan tri. Miller selittää, että tällä kaavalla saadaan noin 1 Miller-yksikkö indusoimattomalle E. colille (vähäinen β-Gal-tuotanto) ja noin 1000 yksikköä täysin indusoidulle viljelmälle (kasvatettu laktoosilla tai IPTG:llä).

Kokemukseni mukaan MG1655:n viljelmillä, jotka on indusoitu 1 mM IPTG:llä log-faasissa, on 1500-1800 Miller-yksikköä. Syytä eroon ei tiedetä, mutta epäilen sen johtuvan Dr. Millerin spektrofotometrin ja minun käyttämäni spektrofotometrin välisistä eroista Abs600/solutiheydessä sekä siitä, että teen Miller-määritykset 30 °C:ssa (mukavuuden vuoksi), kun taas Dr. Miller teki määrityksensä 28 °C:ssa. Olen tehnyt promoottorifuusioita, jotka tuottavat ~40 000 Miller-yksikköä; kuten jäljempänä käsitellään, tämä on kuitenkin liian korkea määrityksen kannalta, joten protokollaa muutettiin alentamaan tätä arvoa.

Protokolla

Käyttämäni protokolla on peräisin Zhangin ja Bremerin artikkelista (JBC 270, 1995, Free full text!), jossa alkuperäistä Miller-protokollaa yksinkertaistettiin huomattavasti, jotta useampia näytteitä voitaisiin mitata vähemmällä manipuloinnilla.

Lyhyesti sanottuna protokolla koostuu bakteeriviljelmän solutiheyden mittaamisesta (Abs600), sitten solujen poistamisesta aliquotista kyvetistä ja niiden sekoittamisesta ”permeabilointi”-liuokseen, joka sisältää detergenttiä, joka hajottaa solukalvot (mutta jättää β-Gal:n ehjäksi). Tämä tappaa solut ja pysäyttää translaation. Inkuboinnin jälkeen lisätään ONPG-”substraattiliuos” ja annetaan keltaisen värin kehittyä. Tämän jälkeen lisätään ”stop”-liuos ja mitataan o-nitrofenolin absorbanssi.

1. Kasvatetaan viljelmiä niissä olosuhteissa, joita halutaan testata.
2. Kasvatuksen aikana mitataan etukäteen 80 μL:n aliquotteja permeabilointiliuosta 1.5 ml:n mikrofuugiputkiin ja sulje ne.
3. Mittaa Abs600 ja TALLENNA SE!
4. Poista 20 μL:n aliquot viljelmästä ja lisää se 80 μL:n permeabilointiliuokseen.

Näyte on nyt stabiili useita tunteja. Näin voit suorittaa aikajaksokokeita.

1. Kun viimeinen näyte on otettu, siirrä näytteet ja substraattiliuos 30 °C:n lämpimään huoneeseen 20-30 minuutiksi.
2. Lisää 600 μL substraattiliuosta jokaiseen putkeen ja HUOMAA LISÄYTYSAIKA.
3. Kun väri on kehittynyt riittävästi, lisää 700 μL Stop-liuosta, sekoita hyvin ja HUOMAA STOPAUSAIKA.
4. Kun olet pysäyttänyt viimeisen näytteen (joillakin näytteillä voi kestää kauemmin kuin toisilla, mutta yleensä ne valmistuvat 30-90 minuutissa), siirrä putket mikrofuugiin ja pyöritä 5-10 minuuttia täydellä nopeudella.
5. Poista putket varovasti sentrifugista ja siirrä liuos putkien YLÄREUNASTA kyvettiin (kyvetteihin). Yrität välttää hiukkasmaisen materiaalin joutumista kyvettiin, jotta sironta ei vaikuttaisi lukemaan.
6. Tallenna Abs420. Tämän tulisi olla pienempi kuin 1 ja suurempi kuin 0,05. Jos se on hieman tämän alueen ulkopuolella, älä hikoile.

Laskekaa Millerin yksiköt seuraavasti:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ otetun viljelmän näytteestä})*(\text{tilavuus } )*(\text{reaktioaika}))} }

Kommentteja määrityksestä

• Reshma 11:28, 15. lokakuuta 2007 (CDT): Miller suosittelee viljelyä, jonka OD600 = 0,28-0,70. Hän kuitenkin väittää, että myös yön yli -viljelmiä voidaan käyttää, mutta eksponentiaalisesti kasvavat solut antavat tarkempia määrityksiä .

• Milloin reaktio tehdään? En ole koskaan löytänyt kirjallisuudesta hyvää vastausta tähän. Jos annoin reaktion mennä loppuun, mittasin Abs420:ksi ~2-3. Tämä on tietysti spektrofotometrin luotettavan alueen ulkopuolella, mutta se antaa viitteitä siitä, kuinka pitkälle reaktio voi mennä. Sain toistettavia tietoja, kun keltainen väri oli juuri ja juuri havaittavissa ennen stop-liuoksen lisäämistä aina noin LB-liemen väriin asti ennen pysäyttämistä. Muista, että tarvitset substraattia kyllästämään entsyymin reaktion aikana, joten älä anna niiden mennä liian pitkälle. Teen rutiininomaisesti kolme erillistä mittausta jokaisesta viljelystä ja lasken niistä keskiarvon.
  • Reshma 11:28, 15. lokakuuta 2007 (CDT): Miller suosittelee, että OD420nm:n lukeman tulisi ihanteellisesti olla 0,6-0,9 .

• Tiheästi ihmiset käyttävät kertakäyttömuovikyvettejä sekä viljelmän sameuden että keltaisen o-nitropenolin mittaamiseen. Kokemukseni mukaan kertakäyttökyvetteissä on KAMALA optiikka: kyllä, ne ovat kirkkaita, mutta valon kulkureitti on säälittävän vääristynyt (katsokaa vaikka sellaisen läpi kaukaista kohdetta). Tämä ei ole suuri ongelma, jos samaa kyvettiä käytetään tyhjälle ja näytteelle ja se on suunnattu spektrofotometrissä samalla tavalla. Ongelma syntyy, kun useita eri näytteitä mitataan eri kyveteistä. Arvot voivat vaihdella SUURESTI, vaikka sama viljelmä mitattaisiin eri kyveteistä. Suosittelen käyttämään joko korkealaatuista lasi- tai kvartsikvettiä tai mittaamaan näytteet levylukulaitteessa, jossa käytetään litteäpohjaisia 96 kuoppalevyjä. Olen havainnut, että virheeni 150 μl:n kulttuurin pipetoinnissa Abs600-mittauksia varten oli PALJON pienempi kuin kertakäyttökyvettejä käytettäessä. Tietenkin mitattu sameus on kalibroitava soluihin/ml, kuten 1 cm:n kyvettiä käytettäessä.

• Kierrättämällä näytteet ja ottamalla näyte varovasti pois supernatantista, vältyt siltä, että joudut mittaamaan sirontaa 550 nm:ssä ja arvailemaan, mikä se olisi 420 nm:ssä.

• Jos reaktiossasi on liikaa β-Gal:ia, putkilo värjäytyy kellertäväksi muutamissa minuuteissa (tai jopa sekunneissa). Tämä on liian nopeaa. Yksi suurimmista virheen aiheuttajista on arviosi reaktioajasta. Kun reaktio-olosuhteet asetetaan siten, että reaktio kestää noin tunnin, aikavirheistä tulee merkityksettömiä. Jos sinun on hidastettava reaktiota, voit käyttää vähemmän soluja ja lisätä permeabilointipuskurin määrää niin, että tilavuus on edelleen 100 μl. Vaihtoehtoisesti voit muokata β-Gal-konstruktiosi ribosomiin sitoutumiskohtaa uudelleen sen heikentämiseksi. Huomasin, että jos soluni valmistivat 40 000 Miller-yksikköä β-Galia, ne olivat hyvin sairaita translaatiostressistä. Tällöin oli parempi heikentää β-Gal-mRNA:n translaatiota.
  • Hoidan näitä reaktioita kuten entsyymikiinetiikkaa. Aloitan näytteet 10 sekunnin välein (aikaa laskien), joten on mahdollista saada tarkat reaktioajat, vaikka antaisit reaktioiden mennä vain muutaman minuutin ajan. Saan hyvin toistettavia tuloksia 1,5-30 minuutin reaktioajoilla. Kun olet saanut käsityksen siitä, kuinka kauan reaktiot kestävät, on helppo ryhmitellä näytteet, jotka tarvitsevat saman reaktioajan. Kun teet jokaisen näytteen kolmena kappaleena, voit luottaa siihen, että ajoituksesi on toistettavissa.–Kathleen 16:43, 14. joulukuuta 2005 (EST)

• Tässä on esimerkki todellisista tiedoista, jotka sain käyttämällä tätä määritystä. Kyseessä oli timecourse-koe. Kullakin kerralla otin 1 ml jokaisesta viljelmästäni, mittasin OD600:n, otin kolme 20 µl:n alivoottia suoraan kyvetistä ja lisäsin jokaisen 80 µl:aan permeabilointiliuosta. Suoritin kokeen täsmälleen edellä kuvatulla tavalla, ja kaikki näytteet säilytettiin huoneenlämmössä, kunnes aikajakso oli päättynyt. Näiden viljelmien OD600 vaihteli 0,4:stä 4:ään (minun näytteessäni) tämän kokeen aikana, ja β-Gal-määritysten reaktioajat vaihtelivat 2-25 minuutin välillä. Kolme yksittäistä β-Gal-määritystä kullekin aikapisteelle kullekin viljelmälle (punaiset tai mustat symbolit) on piirretty kuvaajaan havainnollistamaan määrityksen toistettavuutta kussakin kokeessa.–Kathleen

Reseptit

Permeabilointiliuos

Tarvitaan 80 μl näytettä kohti.

• 100 mM dibasista natriumfosfaattia (Na2HPO4)
  • (Zhangin pöytäkirjassa on 200 mM natriumfosfaattia. En koskaan saanut sitä liuokseen muiden komponenttien kanssa, vaikka mitä yritin, joten vähensin sen 100 mM:iin. Olen käyttänyt jopa 50 mM ilman havaittavaa muutosta.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/ml CTAB (heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidi)
• 0.4 mg/mL natriumdeoksikolaattia
• 5,4 μL/mL beta-merkaptoetanolia

Substraattiliuos

Tarvitaan 600 μL näytettä kohti.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/ml o-nitrofenyyli-β-D-galaktosidia (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-merkaptoetanolia

(Zhangin protokollassa on myös 20 μg/mL CTAB ja 10 μg/mL deoksikolaattia. Jätän nämä pois ajatellen, että permeabilointiliuoksesta jää vielä paljon, ja jos ne eivät ole vielä kuolleet, ne eivät tule kuolemaan.)

Stop-liuos

Tarvitaan 700 μL näytettä kohti.

• 1 M natriumkarbonaattia (Na2CO3)

Sulkuliuoksen korkea pH denaturoi β-Galin ja noin kaksinkertaistaa reaktion keltaisen värin.