Biologiset kellot

Päivän ja yön vuorottelu maapallon syklissä on niin luotettavaa, että ei ole yllättävää, että eläimet, kasvit ja bakteerit säätävät käyttäytymistään ja fysiologiaansa (katsaus, ks. viite 1). Sirkadiaaniset rytmit ovat kaikkien eliöiden kaikkialle ulottuva sopeutuminen kaikkein ennustettavimpiin ympäristöhaasteisiin. Biologista rytmiä, joka säilyy pysyvissä olosuhteissa ja jonka jakso on ≈1 vuorokausi, kutsutaan ”sirkadiaaniseksi” (circa, ”noin”; dian, ”päivä”).

Hyvin viime aikoihin asti värähtelyn taustalla olevat molekyylit ovat pysyneet tuntemattomina. RNA- tai proteiinisynteesin estäjien aiheuttamat häiriöt viittaavat siihen, että tällaiset molekyylit ovat mukana (2).

Mekanismien selvittämisessä menestyksekkäästi käytetty lähestymistapa on geneettisten muutosten käyttö. Hedelmäkärpäsestä, Drosophila melanogasterista, löydetyt ensimmäinen ja toinen kellomutaatio ovat periodi- ja timeless-geenit (3-5).

Hedelmäkärpäsillä periodi- ja timeless-geenien mRNA:n ja proteiinituotteiden runsaus syklii ≈24 tuntia kärpäsen aivojen tietyissä kohdissa (6). Maki Kaneko et al. puhuivat näistä hedelmäkärpäsen aivojen oletetuista tahdistinsoluista käyttämällä näitä molekulaarisia värähtelyjä merkkiaineena (7). Aikuisen päässä proteiinitutkimukset osoittivat, että per ilmentyy rytmisesti tietyissä paikoissa, keskiaivojen ja näkölohkojen välissä sijaitsevissa lateraalisissa neuroneissa. Lateraalisia neuroneja pidetään aikuisen kärpäsen lokomotorisen aktiivisuusrytmin oletettuina tahdistinsoluina.

Kaneko ym. (7) osoittivat, että per:n ja tim:n tuotteet ovat havaittavissa rajoitetussa määrässä toukan aivojen neuroneja. Useiden tällaisten solujen ilmentymismallit ovat syklisiä. Näistä neuroneista viisi lateraalisesti sijaitsevaa solua ilmentää. PERIODia (PER) jo varhaisesta toukkavaiheesta lähtien, mikä viittaa siihen, että ne saattavat olla vastuussa toukkavaiheen ajanpidosta ekluusion ja lokomotoriikan aktiivisuudesta. Toinen mielenkiintoinen havainto on klusteri neuroneja, joiden syklinen per- ja tim-ekspressio on vastavaiheinen lateraalisiin neuroneihin nähden. Tulokset viittaavat siihen, että samassa organismissa on useita eri fysiologisten tai käyttäytymisprosessien rytmiin osallistuvia oskillaattoreita. Kaneko et al. (7) kuvasivat myös tahdistinneuronien kytkentäkuvioiden anatomista luonnehdintaa käyttämällä per-promoottorista riippuvaista reportterigeeniekspressiota. Tällaisen molekyylianatomisen lähestymistavan pitäisi tuoda uutta tietoa tämän aivojärjestelmän toiminnallisesta kartoituksesta. Lisäksi nisäkkäiden ja kärpästen kellosolujen vertailu selventänee näiden järjestelmien välisiä evolutiivisia suhteita.

Transkription sirkadiaaninen kontrolli tarjoaa lähtökohdan analysoida cis-vaikutteisia säätelyelementtejä ja trans-vaikutteisia tekijöitä, joiden kautta kello voi säädellä monia kello-ohjattujen geenien ilmentymiä (6). Näiden oletettujen cis-toimivien säätelyelementtien, joita kutsutaan ”time-boxiksi” (8), oletetaan sijaitsevan kello-ohjattujen geenien promoottori- ja enhancer-alueella. Lisäksi kello-ohjattu reagoiva elementti (6) tai time-box voi säädellä endogeenisia sirkadiaanisia fysiologisia ilmiöitä vakio-olosuhteissa. Viimeksi Drosophilan period-geenin promoottorialueelta on tunnistettu mahdollinen ehdokas time-boxiksi (9). Vaikka PER:n on ehdotettu välittävän mRNA:n kiertoa transkriptionaalisen repression kautta, suora vuorovaikutus PER:n ja DNA:n välillä on hyvin epätodennäköistä, koska PER:ltä puuttuu DNA:ta sitova domeeni. Hardinin ryhmä analysoi laajasti per-geenin promoottorialuetta tutkimuksissa, joissa käytettiin per-lacZ-fuusiogeenin siirtogeenisiä kärpäsiä (9). He tunnistivat sirkadiaanisen transkription tehostajan 69-bp:n DNA-fragmentissa, joka sisältää E-boxin per-geenin yläjuoksulla ja joka on vastuussa per-geenin ilmentymisen yöaikaisesta aktivoitumisesta. E-box on tunnettu transkriptiotekijöiden basic helix-loop-helix-luokan sitoutumiskohta.

Viimeisimpänä ehdokkaana oskillaattorin trans-aktiiviseksi tekijäksi on Clock, joka kloonattiin eteenpäin suuntautuvalla geneettisellä strategialla (10). Takahashin ryhmä (10) on eristänyt ja analysoinut sirkadiaanisten mutanttihiirikantojen lokomotoriaktiivisuutta. Clock-mutantilla oli pitkä jakso, josta tuli rytmihäiriöinen useiden päivien jälkeen jatkuvassa pimeydessä. Takahashi ja kollegat (10) kloonasivat onnistuneesti vastuussa olevan geenin ja tunnistivat mutaation Clock-geenin proteiinia koodaavalta alueelta. Mielenkiintoista oli, että Clock-proteiini sisältää Drosophilan per-geenissä sijaitsevan proteiini-proteiinia sitovan domeenin (PAS) ja DNA:n sitomiseen tarkoitetun emäksisen helix-loop-helix-motiivin. Lisäksi Takahashi ja kollegat (10) pystyivät pelastamaan täysin clock-mutanttihiirten pitkän jakson ja rytmihäiriöisen fenotyypin siirtämällä normaalin clock-geenin.

Ravi Allada ym. kuvasivat yhteisiä molekyylikomponentteja keskittyen Clockiin, joka on vastuussa vuorokausirytmin synnystä sekä kärpäsillä että ihmisillä (11). Allada ja hänen kollegansa (11) seuloivat kemiallisesti mutagenisoituja kärpäsiä etsien mutaatioita, jotka muuttavat tai poistavat lokomotoriikan sirkadiaanisen rytmin aktiivisuuden, ja löysivät uuden rytmihäiriöisen mutaation, jota aluksi kutsuttiin nimellä Jrk. Jrk-kärpäset ilmentävät vähän periodi- ja timeless-proteiineja, koska transkriptio on vähentynyt. Geeni tunnistettiin, ja sillä on silmiinpistävää sekvenssikonservaatiota nisäkkäiden vuorokausirytmigeenin Clockin kanssa; siksi Allada ym. (11) nimesivät tämän kärpäsen geenin uudelleen dClockiksi. Hiiren kellon tavoin Drosophilan kello sisältää basic helix-loop-helix- ja PAS-domeenit sekä transkriptionaalisen aktivointidomeenin.

Uudet työt sekä nisäkkäistä että kärpäsistä viittaavat siihen, että myös CLOCKin proteiinikumppanit ovat evolutiivisesti konservoituneita (nimetty BMAL) (12, 13). CLOCK-BMAL-dimeerien osoitettiin sitoutuvan periodi- ja timeless-geenien promoottorialueelle ja transaktivoivan molempia geenejä kärpäsillä. Lisäksi PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) -ekspressio tukahduttaa CLOCK-BMAL-välitteisen reportteriinduktion. Näin ollen on ehdotettu negatiivisen palautteen mallia (kuva 1).

Nisäkkäillä hypotalamuksessa sijaitsevaa SCN:ää pidetään tärkeimpänä tahdistimena vuorokausirytmi-ilmiöille, kuten monet anatomiset ja fysiologiset tutkimukset osoittavat (14). Äskettäin raportoitiin kolme Drosofilan periodigeenin homologia hiiressä ja ihmisessä (15). Huolimatta kolmen nisäkkäiden periodihomologin olemassaolosta, jotka osoittavat mRNA:n sirkadiaanista värähtelyä hiiren aivojen suprachiasmaattisessa ytimessä, ei ole raportoitu sirkadiaanisen lokomotoriakäyttäytymisen toiminnallista merkitystä.

Selvittääkseen, voisiko nisäkkäiden per-homologilla olla osuutta nisäkkäiden locomoter-käyttäytymisen sirkadiaaniseen rytmiin, Ishidan ryhmä on kloonannut rotan per-homologin ja tehnyt rytmihäiriöisiä SCN-lesioidut rotat seuratakseen sirkadiaanista rytmiä perifeerisissä kudoksissa (16).

Testaamiseksi, havaitaanko rotan PERIOD 2 (RPER2) mRNA:n rytminen ilmentyminen muissa kudoksissa kuin SCN:ssä, tehtiin Northern blot -analyysi silmän, aivojen, sydämen, keuhkojen pernan, maksan ja munuaisten kudoksista. Mielenkiintoista oli, että kaikissa testatuissa kudoksissa havaittiin RPER2-mRNA:n rytminen ilmentyminen, vaikkakin yö/päivä-suhde oli erilainen kussakin kudoksessa. RPER2 käyttäytyy nisäkkäiden homologina Drosophilan periodigeenille (16), koska sen sirkadiaaninen ilmentyminen oli korkeaa yöllä useissa eri kudoksissa, kuten periodi on Drosophilassa.

Koska SCN:ää pidetään nisäkkäiden sirkadiaanisen kellon tahdistimena, Ishidan ryhmä (16) testasi, vaikuttaako SCN:n vaurio useiden kudosten sirkadiaaniseen ilmentymiseen RPER2-mRNA:lla. Yllättäen SCN-vaurio poisti kokonaan RPER2:n monikudosekspression rytmisen luonteen. RPER2:n monikudosekspressio on siis SCN:n valvonnassa. Tämä on ensimmäinen raportti, joka osoittaa, että nisäkkäiden aivokellon, hypotalamuksen SCN:n, hallitsema monikudosrytmi on monikudosrytmi. Tiedot viittaavat myös siihen, että nisäkkäiden per-homologi (RPER2) saattaa osallistua nisäkkäiden locomoter-käyttäytymisen sirkadiaaniseen rytmiin, koska RPER2-mRNA:n sirkadiaanisen ilmentymisen menetys koko kehossa tapahtui, kun rottien sirkadiaaninen locomoter-aktiivisuus menetettiin. Tällaisen ongelman selvittämiseksi meidän on tehtävä siirtogeenisiä eläimiä, joilla on RPER2-geenin toimintahäviö- tai toimintahyödyntämismutaatio. Se, että RPER2-mRNA:n rytminen ilmentyminen useissa kudoksissa riippuu täysin SCN:stä, viittaa siihen, että joitakin signaaleja tarvitaan koko kehon rytmin ylläpitämiseksi koordinoidusti (kuva 2). SCN-siirtotutkimus viittaa myös SCN:stä peräisin olevien humoraalisten tekijöiden merkitykseen (17). Tällaiset SCN:stä peräisin olevat humoraaliset tekijät saattavat olla tärkeitä RPER2-geenin sirkadiaanisen rytmisen ilmentymisen aikaansaamiseksi perifeerisissä kudoksissa. Näyttää siis siltä, kuten kehitysbiologian tapauksessa, että tämän biologisen kellon avainmolekyylit ovat hyvin konservoituneita kärpästen ja nisäkkäiden välillä. Yhteinen molekulaarinen kellomekanismi bakteereista (18) ihmiseen saattaa olla näköpiirissä lähitulevaisuudessa.

.