Bisulfiittisekvensointi

Bisulfiittisekvensoinnissa käytetään rutiininomaisia sekvensointimenetelmiä bisulfiittikäsiteltyyn genomiseen DNA:han CpG-dinukleotidien metylaatiotilanteen määrittämiseksi. Myös muita kuin sekvensointistrategioita käytetään metylaation tutkimiseen tietyissä lokuksissa tai koko genomin tasolla. Kaikissa strategioissa oletetaan, että bisulfiitin aiheuttama metyloitumattomien sytosiinien muuntuminen urasiiliksi on täydellinen, ja tämä on kaikkien myöhempien tekniikoiden perusta. Ihannetapauksessa käytetty menetelmä määrittää metylaatiotilanteen erikseen kunkin alleelin osalta. Vaihtoehtoisia menetelmiä bisulfiittisekvensoinnille ovat yhdistetty bisulfiittirajoitusanalyysi ja metyloituneen DNA:n immunoprecipitointi (MeDIP).

Menetelmiä bisulfiittikäsitellyn DNA:n analysoimiseksi kehitetään jatkuvasti. Näiden nopeasti kehittyvien menetelmien tiivistämiseksi on kirjoitettu lukuisia katsausartikkeleita.

Menetelmät voidaan yleisesti jakaa metylaatiospesifiseen PCR:ään (MSP) perustuviin strategioihin (kuva 4) ja strategioihin, joissa käytetään polymeraasiketjureaktiota (PCR), joka suoritetaan ei-metylaatiospesifisissä olosuhteissa (kuva 3). Myös mikrosirupohjaisissa menetelmissä käytetään PCR:ää, joka perustuu ei-metylaatiospesifisiin olosuhteisiin.

Ei-metylaatiospesifiseen PCR:ään perustuvat menetelmät Muokkaa

Kuva 3: DNA:n metylaatioanalyysimenetelmät, jotka eivät perustu metylaatiospesifiseen PCR:ään. Bisulfiittikonversion jälkeen genomista DNA:ta monistetaan PCR:llä, joka ei erottele metyloituja ja ei-metyloituja sekvenssejä. Lukuisilla käytettävissä olevilla menetelmillä tehdään sitten erottelu amplikonin sisällä bisulfiittikonversion seurauksena tapahtuneiden muutosten perusteella.

Suora sekvensointiEdit

Ensimmäisessä raportoidussa metylaatioanalyysimenetelmässä, jossa käytettiin bisulfiittikäsiteltyä DNA:ta, hyödynnettiin PCR:ää ja tavanomaista dideoksinukleotidi-DNA:n sekvensointia, jonka avulla voitiin määritellä bisulfiittikonversiolle vastustuskykyisiä nukleotideja suoraan. Alukkeet on suunniteltu niin, että ne ovat sekä säike- että bisulfiittispesifisiä (eli alukkeita, jotka sisältävät muita kuin CpG-sytosiiniä siten, että ne eivät ole komplementaarisia ei-bisulfiittikäsitellyn DNA:n kanssa), ja ne reunustavat kiinnostavaa metylaatiokohtaa (mutta eivät sisällä sitä). Näin ollen se monistaa sekä metyloituja että metyloitumattomia sekvenssejä, toisin kuin metylaatiospesifinen PCR. Kaikki metyloimattomat sytosiinit näkyvät tymiininä sense-juosteen monistetussa sekvenssissä ja adeniinina antisense-juosteen monistetussa sekvenssissä. Kun PCR-alukkeisiin sisällytetään korkean läpimenon sekvensointiadaptereita, PCR-tuotteet voidaan sekvensoida massiivisen rinnakkaisen sekvensoinnin avulla. Vaihtoehtoisesti ja työläs PCR-tuote voidaan kloonata ja sekvensoida. Nested PCR -menetelmiä voidaan käyttää tuotteen tehostamiseen sekvensointia varten.

Kaikki myöhemmät DNA:n metylaatioanalyysitekniikat, joissa käytetään bisulfiittikäsiteltyä DNA:ta, perustuvat tähän Frommerin ja muiden raporttiin (kuva 2). Vaikka useimmat muut modaliteetit eivät ole todellisia sekvensointiin perustuvia tekniikoita, termiä ”bisulfiittisekvensointi” käytetään usein kuvaamaan yleisesti bisulfiittimuunnos-DNA:n metylaatioanalyysitekniikoita.

PyrosekvensointiEdit

Pyrosekvensointia on käytetty myös bisulfiittikäsitellyn DNA:n analysoimiseen ilman metylaatiospesifistä PCR:ää. Kiinnostavan alueen PCR-monistamisen jälkeen pyrosekvensointia käytetään alueen tiettyjen CpG-kohtien bisulfiittimuunnetun sekvenssin määrittämiseen. C:n ja T:n suhde yksittäisissä kohdissa voidaan määrittää kvantitatiivisesti sekvenssin pidentämisen aikana tapahtuneen C:n ja T:n sisällyttämisen määrän perusteella. Tämän menetelmän tärkein rajoitus on tekniikan hinta. Pyrosekvensointi mahdollistaa kuitenkin hyvin laajennuksen korkean läpimenon seulontamenetelmiin.

Wong ym. kuvasivat hiljattain tämän tekniikan parannuksen, jossa käytetään alleelispesifisiä alukkeita, jotka sisällyttävät yksittäisnukleotidipolymorfismit sekvensointialukkeen sekvenssiin, jolloin äidin ja isän alleelit voidaan analysoida erikseen. Tämä tekniikka on erityisen käyttökelpoinen genomisen imprintingin analysoinnissa.

Metylaatio-herkkä yksijuosteinen konformaatioanalyysi (MS-SSCA)Edit

Tämä menetelmä perustuu yksijuosteiseen konformaatiopolymorfismianalyysiin (single-strand conformation polymorphism analysis, SSCA)-menetelmään, joka on kehitetty yksijuosteisten polymorfismien (single-nucleotide polymorphism, SNP) analysointiin. SSCA erottaa toisistaan samankokoiset mutta sekvenssiltään erilaiset yksijuosteiset DNA-fragmentit, jotka perustuvat erilaiseen siirtymiseen denaturoimattomassa elektroforeesissa. MS-SSCA:ssa tätä käytetään erottamaan toisistaan bisulfiittikäsitellyt, PCR:llä monistetut alueet, jotka sisältävät kiinnostavia CpG-kohtia. Vaikka SSCA:lla ei ole herkkyyttä, kun kyseessä on vain yhden nukleotidin ero, bisulfiittikäsittely tekee usein useita C-T-muunnoksia useimmilla kiinnostuksen kohteena olevilla alueilla, ja näin saatu herkkyys lähestyy 100 prosenttia. MS-SSCA tarjoaa myös puolikvantitatiivisen analyysin DNA:n metylaatioasteesta kaistojen intensiteettien suhteen perusteella. PCR-amplikonit analysoidaan suoraan lämpötilan ramppauksen ja siitä johtuvan interkaloivan fluoresoivan väriaineen vapautumisen avulla sulamisen aikana. Metylaatioaste, jota edustaa amplikonin C-to-T-pitoisuus, määrittää sulamisen nopeuden ja sitä seuraavan väriaineen vapautumisen. Tämä menetelmä mahdollistaa suoran kvantifioinnin yhden putken määrityksessä, mutta se arvioi metylaation koko monistetun alueen eikä tiettyjen CpG-kohtien metylaatiota.

Metylaatioherkkä yhden nukleotidin alukkeen pidennys (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE käyttää alukkeen pidennysmenetelmää, joka on alun perin kehitetty yhden nukleotidin polymorfismien analysointiin. DNA muunnetaan bisulfiittiseksi, ja bisulfiittispesifiset alukkeet liitetään sekvenssiin välittömästi kiinnostuksen kohteena olevaa CpG:tä edeltävään emäspariin asti. Alukkeen annetaan pidentyä yhden emäsparin verran C:hen (tai T:hen) DNA-polymeraasia lopettavien dideoksinukleotidien avulla, ja C:n ja T:n suhde määritetään kvantitatiivisesti.

Tämän C:T-suhteen määrittämiseen voidaan käyttää useita menetelmiä. Aluksi MS-SnuPE:ssä luotettiin radioaktiivisiin ddNTP:iin alukkeen pidennyksen reportterina. Myös fluoresenssiin perustuvia menetelmiä tai pyrosekvensointia voidaan käyttää. Matriisiavusteista laserdesorptioionisaatio-ionisaatio/time-of-flight (MALDI-TOF) -massaspektrometria-analyysia voidaan kuitenkin käyttää kahden polymorfisen alukkeen pidennystuotteen erottamiseksi toisistaan, ja se perustuu pohjimmiltaan SNP-genotyypin määrittämiseen suunniteltuun GOOD-määritykseen. Ioniparin käänteisfaasista korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (IP-RP-HPLC) on myös käytetty alukkeen pidennystuotteiden erottamiseen.

Emäksispesifinen pilkkominen/MALDI-TOFEdit

Ehrichin ym. hiljattain kuvaamassa menetelmässä hyödynnetään edelleen bisulfiittikonversioita lisäämällä siihen emäksispesifinen pilkkomisvaihe, jolla parannetaan nukleotidimuutoksilla saatavaa tietoa. Käyttämällä ensin kiinnostavan alueen in vitro -transkriptiota RNA:ksi (lisäämällä RNA-polymeraasin promoottorikohta PCR-alukkeeseen alkuperäisessä monistuksessa), RNaasi A:ta voidaan käyttää RNA-transkriptin pilkkomiseen emäspesifisistä kohdista. Koska RNaasi A pilkkoo RNA:ta spesifisesti sytosiini- ja urasiiliribonukleotideista, emäspesifisyys saavutetaan lisäämällä pilkkoutumiselle vastustuskykyistä dTTP:tä, kun halutaan sytosiinispesifistä (C-spesifistä) pilkkoutumista, ja lisäämällä dCTP:tä, kun halutaan urasiilispesifistä (U-spesifistä) pilkkoutumista. Halkaistut fragmentit voidaan sitten analysoida MALDI-TOF-menetelmällä. Bisulfiittikäsittely johtaa joko pilkkoutumiskohtien lisäämiseen/poistamiseen C:stä U:ksi muuntumalla tai fragmentin massan siirtymiseen G:stä A:ksi muuntumalla monistettuun käänteisjuosteeseen. C-spesifinen pilkkominen leikkaa spesifisesti kaikki metyloituneet CpG-kohdat. Analysoimalla tuloksena syntyvien fragmenttien kokoa on mahdollista määrittää alueen CpG-kohtien DNA-metylaation erityinen malli sen sijaan, että määritettäisiin koko alueen metylaation laajuus. Tämä menetelmä osoitti tehokkuutensa korkean läpimenotehon seulonnassa, sillä sen avulla voidaan tutkia lukuisia CpG-kohtia useissa kudoksissa kustannustehokkaasti.

Metylaatiospesifinen PCR (MSP)Edit

Kuva 4. Metylaatiospesifinen PCR on herkkä menetelmä, jonka avulla voidaan diskriminoidusti monistaa ja havaita kiinnostava metyloidut alue metyloidun spesifisten alukkeiden avulla bisulfiittikonvertoidusta genomitietoisesta DNAsta. Tällaiset alukkeet sitoutuvat vain metyloituneisiin sekvensseihin, jotka sisältävät 5-metyylisytosiinia, joka on resistentti bisulfiittimuunnokselle. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää metyloimattomia spesifisiä alukkeita.

Tässä vaihtoehtoisessa metylaatioanalyysimenetelmässä käytetään myös bisulfiittikäsiteltyä DNA:ta, mutta siinä ei tarvitse sekvensoida kiinnostuksen kohteena olevaa aluetta. Sen sijaan alukeparit suunnitellaan itse ”metyloitumis-spesifisiksi” siten, että ne sisältävät sekvenssejä, jotka komplementoivat vain muuntumattomia 5-metyylisytosiinien sekvenssejä, tai päinvastoin ”metyloitumis-spesifisiksi” siten, että ne komplementoivat metyloitumattomista sytosiinistä muunnettuja tymiinejä. Metylaatio määräytyy sen mukaan, kuinka hyvin spesifinen alukkeella saadaan aikaan monistuminen. Menetelmä on erityisen hyödyllinen sellaisten CpG-saarekkeiden tutkimisessa, joilla on mahdollisesti suuri metylaatiotiheys, koska CpG-parien määrän lisääntyminen alukkeessa lisää määrityksen spesifisyyttä. CpG-parin sijoittaminen alukkeen 3′-päähän parantaa myös herkkyyttä. Ensimmäisessä MSP:tä käyttävässä raportissa kuvattiin riittävää herkkyyttä havaita metylaatio 0,1 prosentissa alleeleista. Yleisesti ottaen MSP:tä ja siihen liittyviä protokollia pidetään herkimpinä, kun kysytään metylaatiotilannetta tietyssä lokuksessa.

MethyLight-menetelmä perustuu MSP:hen, mutta tarjoaa kvantitatiivisen analyysin kvantitatiivisen PCR:n avulla. Menetelmässä käytetään metylointispesifisiä alukkeita, ja lisäksi käytetään metylointispesifistä fluoresenssireportoivaa koetinta, joka kiinnittyy monistettuun alueeseen. Vaihtoehtoisesti alukkeet tai koetin voidaan suunnitella ilman metylaatiospesifisyyttä, jos kyseisissä sekvensseissä olevien CpG-parien erottelua tarvitaan. Kvantitointi tehdään suhteessa metyloituun viite-DNA:han. Tähän protokollaan tehdyssä muutoksessa PCR:n spesifisyyden lisäämiseksi onnistuneesti bisulfiittikonvertoituneelle DNA:lle (ConLight-MSP) käytetään ylimääräistä koetinta bisulfiittikonvertoitumattomalle DNA:lle tämän epäspesifisen monistumisen kvantifioimiseksi.

MSP:llä monistettua DNA:ta käyttävässä muussa menetelmässä tuotteet analysoidaan sulamiskäyräanalyysin avulla (Mc-MSP). Tässä menetelmässä bisulfiittikonvertoitua DNA:ta monistetaan sekä metyloidulle spesifisillä että metyloimattomille spesifisillä alukkeilla ja määritetään näiden kahden tuotteen kvantitatiivinen suhde vertailemalla sulamiskäyräanalyysissä syntyviä eri piikkejä. Korkean resoluution sulamisanalyysimenetelmä, jossa käytetään sekä kvantitatiivista PCR:ää että sulamisanalyysia, on otettu käyttöön erityisesti matalan tason metylaation herkkää havaitsemista varten

Mikrosirupohjaiset menetelmätMuokkaa

Mikrosirupohjaiset menetelmät ovat bisulfiittikäsitellyn DNA:n analysoimiseksi käytettävissä olevien tekniikoiden looginen laajennus, joka mahdollistaa metylaation analyysin genomin laajuisesti. Oligonukleotidimikrosarjat suunnitellaan käyttäen pareja oligonukleotidihybridisaatioantureita, jotka kohdistuvat kiinnostaviin CpG-kohtiin. Toinen on komplementaarinen muuttumattomalle metyloituneelle sekvenssille ja toinen on komplementaarinen C-U:ksi muunnetulle metyloitumattomalle sekvenssille. Koettimet ovat myös bisulfiittispesifisiä, jotta ne eivät sitoudu bisulfiitilla epätäydellisesti muunnettuun DNA:han. Illuminan Methylation Assay on yksi tällainen määritys, jossa sovelletaan bisulfiittisekvensointitekniikkaa mikrosarjatasolla genomin laajuisen metylaatiotiedon tuottamiseksi.