Brainbow
Brainbow-tekniikat perustuvat Cre-Lox-rekombinaatioon, jossa Cre-rekombinaasi-proteiini ohjaa DNA:n inversiota tai erkaantumista loxP-kohtien välillä. Alkuperäiseen Brainbow-menetelmään kuuluvat sekä Brainbow-1 että Brainbow-2, jotka hyödyntävät Cre/lox-rekombinaation eri muotoja. Brainbow-3, Brainbow-1:n muunnettu versio, kehitettiin vuonna 2013. Kaikissa Brainbow-alatyypeissä tietyn XFP:n ilmentyminen on stokastinen eli satunnainen tapahtuma.
Brainbow-1:ssä käytetään DNA-konstruktioita, joissa on erilaisia fluoresoivia proteiinigeenejä (XFP), jotka on erotettu toisistaan loxP:n mutanttisilla ja kanonisilla muodoilla. Tämä luo joukon toisensa poissulkevia erotusmahdollisuuksia, koska cre-välitteinen rekombinaatio tapahtuu vain identtisten loxP-kohtien välillä. Kun rekombinaatio on tapahtunut, suoraan promoottorin jälkeen jäljelle jäävä fluoresoiva proteiini ilmentyy ainutlaatuisesti. Siten konstruktio, jossa on neljä XFP:tä, jotka on erotettu toisistaan kolmella eri loxP-kohdalla, kolmella ekskisiotapahtumalla ja alkuperäisellä konstruktiolla, voi tuottaa neljä erilaista fluoresoivaa proteiinia.
Brainbow-2 käyttää Cre-ekskisiota ja -inversiota salliakseen useita ilmentymismahdollisuuksia tietyssä konstruktiossa. Yhdessä DNA-segmentissä, jossa on kaksi vastakkaisesti suuntautunutta XFP:tä, Cre saa aikaan satunnaisen inversiotapahtuman, joka jättää toisen fluoresoivan proteiinin oikeaan orientaatioon ekspressiota varten. Jos kaksi tällaista invertoituvaa sekvenssiä on linjassa, kolme erilaista inversiotapahtumaa on mahdollista. Kun myös ekskisiotapahtumat otetaan huomioon, yksi neljästä fluoresoivasta proteiinista ekspressoituu tietyllä Cre-ekskisioiden ja inversioiden yhdistelmällä.
Brainbow-3 säilyttää Brainbow-1:n loxP-muodon, mutta korvaa RFP-, YFP- ja CFP-geenit mOrange2:lla, EGFP:llä ja mKate2:lla. mO2, EGFP ja mK2 valittiin sekä siksi, että niiden fluoresoiva heräte- ja emissiospektri on mahdollisimman vähän päällekkäinen, että siksi, että niiden sekvenssihomologia on minimaalinen, mikä mahdollistaa sellaisten selektiivisten vasta-aineiden suunnittelun, joita voidaan käyttää niiden havaitsemiseen immunohistokemiallisissa protokollissa. Brainbow-3 ratkaisee myös ongelman, joka liittyy hermosolujen epätasaiseen täyttymiseen XFP:llä, käyttämällä XFP:n farnesyloituja johdannaisia, jotka kulkeutuvat tasaisemmin hermosolukalvoille.
Brainbow toteutetaan in vivo risteyttämällä kaksi siirtogeenistä organismikantaa: toinen, joka ilmentää Cre-proteiinia, ja toinen, joka on transfektoitu useilla versioilla loxP/XFP-konstruktiosta. Kun käytetään useita kopioita siirtogeenistä, XFP:t voivat yhdistyä tavalla, joka voi antaa yhden noin sadasta eri väristä. Näin kukin hermosolu merkitään eri värisävyllä, joka perustuu sen annettuun fluoresoivien proteiinien kombinatoriseen ja stokastiseen ilmentymiseen.
Erottelevaisten XFP-ilmentymismallien selvittämiseksi näkyvään muotoon aivoviipaleita kuvataan konfokaalimikroskopialla. Kun kukin fluorofori altistetaan fotonille, jolla on sen tietty heräteaallonpituus, se lähettää signaalin, joka kerätään punaiseen, vihreään tai siniseen kanavaan, ja saatu valoyhdistelmä analysoidaan data-analyysiohjelmistolla. Eriväristen neuronien päällekkäin asettaminen mahdollistaa monimutkaisten hermopiirien visuaalisen purkamisen.
Brainbowta on tähän mennessä testattu pääasiassa hiirillä; edellä kuvattua perustekniikkaa on kuitenkin muokattu käytettäväksi myös uudemmissa tutkimuksissa sen jälkeen, kun alkuperäinen menetelmä esiteltiin vuonna 2007.
MiceEdit
Hiiren aivoissa on 75 000 000 neuronia, ja ne muistuttavat enemmän ihmisen aivoja kuin drosofila ja muut yleisesti tämän tekniikan mallintamiseen käytetyt organismit, kuten C. elegans. Hiiret olivat ensimmäiset organismit, joihin Brainbow-menetelmää neurokuvantamisessa käytettiin onnistuneesti. Livet et al. (2007) kehittivät kaksi versiota Brainbow-hiiristä, Brainbow-1 ja Brainbow-2, jotka on kuvattu edellä. Käytettäessä näitä menetelmiä täydellisen kartan luomiseksi ja hiiren lihaksen aksonien seuraamiseksi on tarpeen kerätä kymmeniä tuhansia kuvia ja koota ne pinoiksi täydellisen kaaviokuvan luomiseksi. Tämän jälkeen on mahdollista jäljittää jokainen motorinen aksoni ja sen synaptiset kontaktit lihaksen täydellisen konnektomin rakentamiseksi.
Lisäesimerkkejä Brainbow-tekniikalla tutkituista hermosoluista siirtogeenisillä hiirillä sijaitsevat korvan lihaksia hermottavassa motoriikkahermossa, aivorungon aksoniradoissa ja hippokampuksen dentate gyrusissa.
DrosophilaEdit
Drosophilan aivojen monimutkaisuus, joka koostuu noin 100 000 neuronista, tekee siitä erinomaisen ehdokkaan Brainbow’n kaltaisten neurofysiologisten ja neurotieteellisten tekniikoiden toteuttamiseen. Stefanie Hampel et al. (2011) yhdistivätkin Brainbow’n yhdessä geneettisten kohdentamistyökalujen kanssa yksittäisten neuronien tunnistamiseksi Drosophilan aivoissa ja eri hermosolulinjoissa. Yksi geneettisistä kohdentamisvälineistä oli GAL4/UAS- binääri-ekspressiojärjestelmä, joka kontrolloi UAS-Brainbow:n ilmentymistä ja kohdistaa ilmentymisen pieniin neuroniryhmiin. Flip Out -menetelmien käyttö lisäsi raportointikonstruktion soluresoluutiota. Fluoresoivien proteiinien ilmentyminen riippui alkuperäisen Brainbow’n tavoin Cre-rekombinaatiosta, joka vastaa yhteensopivia lox-kohtia. Hampel et al. (2011) kehittivät myös oman Brainbow-muunnoksensa (dBrainbow), joka perustuu endogeenisen fluoresenssin sijasta epitooppien vasta-ainemerkintään. Kaksi kopiota heidän konstruktiostaan tuottaa kuusi kirkasta, toisistaan erotettavaa väriä. Tämän ja värien osoittamisen yksinkertaistamisen ansiosta he pystyivät tarkkailemaan kunkin hermosolun liikeratoja pitkien etäisyyksien päähän. Erityisesti he jäljittivät motorisia neuroneja antennilohkosta hermo-lihasliitoksiin, minkä ansiosta he pystyivät tunnistamaan yksittäisten neuronien erityiset lihaskohteet.
Viime kädessä tämä tekniikka tarjoaa mahdollisuuden kartoittaa tehokkaasti Drosophilan hermopiiriä niin, että tutkijat pystyvät paljastamaan enemmän tietoa tämän selkärangattoman eläimen aivojen rakenteesta ja siitä, miten se liittyy siitä johtuvaan käyttäytymiseen.