EMBL – Euroopan molekyylibiologian laboratorio

Tietoa proteiinin muodosta ja konformaatiosta sekä makromolekyylien välisestä vuorovaikutuksesta saadaan sedimentaatiokokeesta saaduista sedimentaatio- ja diffuusiokertoimista. Sedimentaatiokertoimet ovat erityisen käyttökelpoisia seurattaessa muutoksia proteiinin konformaatiossa. Tuloksena saatua mallia proteiinin tai proteiinikompleksin kokonaismuodosta voidaan verrata elektronimikroskoopilla saatuihin kuviin sen arvioimiseksi, kuinka hyvin nämä kuvat soveltuvat näiden hiukkasten käyttäytymiseen liuoksessa.

Assosiaatio

Toisin kuin muut sitoutumisprosessien tutkimiseen käytettävät menetelmät, sedimentaatiotasapainomenetelmä on erityisen käyttökelpoinen tutkittaessa suhteellisen heikkoja assosiaatioita, joiden assosiaatioyhtymävakiot (Ka) ovat suuruusluokkaa 10-100 M-1. Kuitenkin myös sitoutumisprosesseja, joiden Ka-arvot ovat huomattavasti suuremmat kuin 107 M-1, voidaan tutkia.

Laite

EMBL:ssä käytössämme oleva analyyttinen ultrasentrifugi on Beckman Optima XL-A. Laite pyörittää proteiininäytettä tyhjiössä kontrolloidulla nopeudella ja lämpötilassa samalla, kun se tallentaa asetettuina aikoina pitoisuusjakauman. Roottorista riippuen nopeus voi olla jopa 60 000 rpm (mikä vastaa 250 000 x g). Mittauksissa käytetään erityisiä kennoja, jotka kestävät suuren painovoimakentän ja jotka sallivat valon kulun näytteen läpi. Varsinainen näyte asetetaan sektorin muotoiseen onteloon, joka on kahden kvartsi-ikkunan välissä (ks. kuva 1). Tämä ontelo sijaitsee alumiiniseoksesta tai vahvistetusta epoksista valmistetussa keskikappaleessa. Kaksoissektorikennoja käytetään myös näytteen liuottimen absorbanssin korjaamiseksi. Nämä kennot mahdollistavat myös sedimentaatiokertoimen erojen ja diffuusiokertoimien mittaamisen. Keskikappaleiden polunpituus on 3-12 mm, mikä yhdessä valittavien aallonpituuksien kanssa mahdollistaa laajan näytekonsentraatioalueen tutkimisen. Jos haluat tietää, miten kenno kootaan, siirry kokoonpanoprotokollaan.