Frontiers in Pharmacology

Introduction

Biologisesti aktiiviset peptidit ovat yleisnimitys erilaisille peptideille, jotka koostuvat luonnollisten aminohappojen erilaisista koostumuksista ja järjestelyistä. Niillä tiedetään olevan erilaisia biologisia toimintoja, kuten antioksidanttisia, immuniteettia edistäviä, hormoneja moduloivia, antibakteerisia, antitromboottisia, antiviraalisia ja verenpainetta alentavia vaikutuksia, jotka johtuvat eläin- tai kasviproteiineista peräisin olevista monitoimisista yhdisteistä (Wang et al., 2017). Lisäksi niillä on korkea elintarviketurvallisuus ja korkea biologinen hyötyosuus, mikä tekee niistä potentiaalisia ehdokkaita funktionaalisten peptidilääkkeiden ja funktionaalisten elintarvikelisäaineiden kehittämiseen (Sarmadia ja Ismaila, 2010).

Maailman terveysjärjestön arvion mukaan sydän- ja verisuonisairaudet aiheuttavat vuosittain yli 17,5 miljoonan ihmisen kuoleman. CVD:n tärkeistä ominaisuuksista verenpainetauti on olennainen kohde CVD:n ehkäisyssä ja hoidossa (Celermajer ym., 2012). Nykyisin käytettyjen verenpainetta alentavien lääkkeiden, kuten kaptopriilin ja enalapriilin, käyttö on rajoitettua haittavaikutusten, kuten yskän, ihottuman ja päänsäryn, vuoksi (Yu ym., 2018). CVD-tapausten jatkuvasti lisääntyvät tapaukset edellyttävät kuitenkin joitakin uusia ja turvallisia vaihtoehtoja, kuten elintarvikkeista peräisin olevia aktiivisia peptidejä. Viime aikoina on edistytty merkittävästi sellaisten elintarvikekomponenttien tunnistamisessa ja seulonnassa, jotka vaikuttavat myönteisesti sydän- ja verisuoniterveyteen (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Tällaisista yhdisteistä peptidit ovat saaneet erityistä huomiota niiden verenpainetta alentavan vaikutuksen vuoksi. Aiemmin peptidien verenpainetta alentava in vitro -aktiivisuus on määritetty ensisijaisesti mittaamalla angiotensiinikonvertaasientsyymin (ACE) estävää aktiivisuutta, joka on solukalvolla sijaitseva dipeptidyylikarboksypeptidaasi ja joka voi aiheuttaa suuria vaurioita häiritsemällä kahden hormonaalisen järjestelmän välistä tasapainoa, jotka säätelevät verenpainetta ja nestetasapainoa (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Lisäksi elintarvikkeista peräisin olevien verenpainetta alentavien peptidien vahvistettiin vaikuttavan verenpainetta alentavasti hypertensiivisiin potilaisiin ilman myrkyllisyyttä tai sivuvaikutuksia (Martinez-Maqueda et al., 2012). Verenpainetta alentavien peptidien erottaminen ja puhdistaminen elintarvikeproteiineista antaisi uuden suunnan luonnollisten verenpainelääkkeiden kehittämiselle.

Ginkgo biloban siemenvaroja on tutkittu laajalti eri puolilla maailmaa niiden huomattavan biologisen aktiivisuuden ja farmakologisen vaikutuksen vuoksi. Ginkgon siemenillä on perinteisenä kiinalaisena lääkkeenä yli 600 vuoden historia, mutta sen tärkeimmistä aktiivisista ainesosista tiedetään vain vähän. Vain muutamissa tutkimuksissa raportoitiin G. biloban siementen proteiini-isolaatin antioksidanttisista, väsymystä ehkäisevistä ja bakteriostaattisista vaikutuksista (Lena ja Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hydrolysoivat ginkgo-peptidiä alkalaasilla ja pepsiinillä saadakseen kaksi antioksidanttista peptidiä, joilla on kyky raivata vapaita radikaaleja ja estää lipidiperoksidaatiota. Ginkgo-hypotensiivisiä peptidejä on kuitenkin tutkittava tarkemmin niiden taustalla olevien mekanismien selvittämiseksi korkeamman vaikutuksen osalta.

Tässä käytimme neljää erilaista proteaasia GPI:n hydrolysoimiseksi, jotta voimme valita yhden hydrolysaateista, jolla on korkea ACE:tä estävä aktiivisuus, ja suorittaa ultrasuodatuksen saadaksemme komponentteja, joilla on eri MW:t. Tutkittiin MW:n vaikutuksia GPH:iden ACE:tä estävään aktiivisuuteen. Lisäksi määritettiin aminohappokoostumuksen ja peptidiaktiivisuuden välinen suhde. Äskettäin uutetut ACE:tä estävät peptidit puhdistettiin, tunnistettiin ja syntetisoitiin; niiden IC50-arvot testattiin ja peptidien inhibitiomalleja tutkittiin Lineweaver-Burk-kaavioilla. Selvitimme myös ACE:n estomekanismia molekyylisen telakointianalyysin avulla.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

G. biloba L:n siemenet ostettiin Shandongin maakunnan Linyin kaupungista, Kiinasta. Siemenet kuorittiin, kuorittiin ja käytettiin jatkokokeisiin. Angiotensiini I:tä konvertoiva entsyymi ja hippuryyli-l-histidyyli-L-leusiini (HHL), hippuriinihappo ostettiin Sigmasta (St. Louis, MO, Yhdysvallat) ja Yuanye Bio-Technologysta (Shanghai, Kiina). Kaptopriili hankittiin MedChem Expressiltä (NJ, Yhdysvallat).

GPI:n valmistus

G. biloba L:n siemenet kuivattiin 45 °C:ssa, murskattiin sitten jauheeksi ja seulottiin 80 meshin läpi. Jauhe pakastekuivattiin fenolipoiston ja rasvanpoistokäsittelyn jälkeen. Tuloksena saatu G. biloba -siemenjauhe liuotettiin DW:hen (1:20, w/v; pH 10,0). Edellä mainittua suspensiota sekoitettiin ja uutettiin 12 tunnin ajan, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin 10 000 g:ssa 30 minuutin ajan. Saatu supernatantti asetettiin ginkgoproteiinin isoelektriseen pisteeseen pH 4,62 ja inkuboitiin 60 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin edelleen 10 000 g:ssa 30 minuutin ajan. Saatu sakka suspendoitiin uudelleen käyttäen tislattua vettä ja liuos säädettiin pH-arvoon 7. Tämän jälkeen saadut GPI:t pakastekuivattiin seuraavaan käyttöön asti.

Ginkgoproteiinihydrolysaattien (GPH:t)

Tätä varten valmistettiin 4-prosenttista GPI-liuosta, jota hydrolysoitiin erikseen neljällä proteaasilla niiden optimaalisissa hydrolyysiolosuhteissa 5 tunnin ajan. Entsyymiannokset olivat 2000 U. Hydrolyysin jälkeen entsyymit inaktivoitiin 90 °C:ssa 10 minuutin ajan ja liuos sentrifugoitiin 3000 g:ssa 30 minuutin ajan, jotta saatiin neljästä entsyymistä saadut yksittäiset supernatantit.

Hydrolyysiaste

Hydrolyysiaste (DH) laskettiin viitaten menetelmään Kimatu et al. (2017) seuraavasti:

jossa B edusti NaOH:n määrää (ml), joka lisättiin pH:n pitämiseksi vakiona hydrolyysin aikana; Nb oli NaOH-liuoksen molaarinen konsentraatio; MP oli proteiinin massa (g); α tarkoitti proteiinisubstraattien keskimääräistä dissosiaatioastetta hydrolyysin aikana; htot oli proteiiniin sisältyneiden peptidisidosten kokonaismäärä.

ACE-estäjäpeptidin eristäminen ja puhdistaminen

Näytteen ultrasuodatus suoritettiin käyttämällä MSC300-kuppityyppistä ultrasuodatinta (MoSu, Shanghai, Kiina). Näyte lisättiin syöttöaukosta ja typpipullo liitettiin ultrasuodatuskupin letkuliitäntään. Sen jälkeen ultrasuodatettu kuppi asetettiin ja pakattiin magneettisekoittimeen, joka oli liitetty typpikaasupulloon, jonka paine oli enintään 0,22 MPa. Näytteet johdettiin peräkkäin 1, 3, 5 ja 10 kDa:n ultrasuodatuskalvojen läpi ja saatiin neljä komponenttia (<1, 1-3, 3-5 ja 5-10 kDa). Neljä fraktiota kerättiin, pakastekuivattiin ja käytettiin sitten ACE:n estävän aktiivisuuden testaamiseen. Korkeamman ACE-aktiivisuuden omaavat komponentit valittiin jatkopuhdistukseen Zheng et al. (2017) esittämän menettelyn mukaisesti. Ultrasuodatuksen jälkeen saatu kylmäkuivattu hydrolysaatti (200 mg) resuspendoitiin puhdistettuun veteen, jotta saatiin lopullinen pitoisuus 50 mg/ml, ja se puhdistettiin edelleen Sephadex G-15 -geelisuodatuskolonnilla (1,5 cm × 60 cm). Näytteet suodatettiin mikrosuodatuskalvolla ja eluointi suoritettiin tislatulla vedellä virtausnopeudella 1 ml/min. Näytettä seurattiin ja erotettiin aallonpituudella 220 nm käyttäen P270-puolipreparatiivista HPLC:tä (Aixin, Guangzhou, Kiina). Fraktiot (7,5 ml kukin) kerättiin ja pakastekuivattiin.

ACE:n estävän aktiivisuuden määrittäminen

Tämä testi suoritettiin O’Loughlinin et al. (2014) aiemmassa raportissa annettujen kuvausten mukaisesti tietyin muutoksin. Lyhyesti sanottuna substraatti hippuryyli-histidyylileusiini (HHL, 5 mM) ja näytteet sekoitettiin 0,1 M Na2:ssa (pH 8,3) ja 0,3 M natriumkloridissa. Sen jälkeen 50 μl näytettä ja 150 μl substraattia lisättiin sentrifugiputkeen, sekoitettiin ja annettiin seistä vedessä 37 °C:ssa 5 minuuttia. Tämän jälkeen lisättiin ACE-liuos (50 mU/ml) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 45 min. Reaktio lopetettiin lisäämällä 250 μL 1M HCl:ää ja liuos suodatettiin 0,45 μM:n nailonruiskusuodattimen läpi ennen kuin se analysoitiin RP-HPLC:llä (Waters, Milford, MA, Yhdysvallat) Inertsil ODS-3:lla (250 × 4,6 mm, 5 μm:n hiukkaskoko). Liikkuva faasi koostui tislatusta vedestä: asetonitriili = 75:25 (V/V, jossa 0,1 % TFA:ta) virtausnopeudella 0,5 ml/min ja detektointi 228 nm:ssä. Kaptopriilia käytettiin kontrollina ja inhiboiva aktiivisuus (%) määritettiin seuraavasti:

jossa A oli hippuriinihapon piikin pinta-ala näytteen kanssa, B ilman näytettä.

LC-MS/MS-analyysi ja puhdistettujen peptidisekvenssien tunnistaminen

Puhdistetut näytteet analysoitiin Q Exactive -menetelmällä (Thermo Fisher Scientific, MA, Yhdysvallat) käyttäen Easy-nLC 1000 -laitetta (Thermo Fisher Scientific, MA, Yhdysvallat). Näyte suolattiin ja lyofilisoitiin, palautettiin 0,1-prosenttiseen FA-liuokseen ja säilytettiin -20 °C:ssa seuraavaan käyttöön asti. Kaksi liikkuvaa faasia olivat seuraavat: liikkuva faasi A oli 0,1-prosenttisen muurahaishapon vesiliuos ja liikkuva faasi B oli 0,1-prosenttisen muurahaishapon vesiliuos asetonitriilissä (asetonitriilipitoisuus oli 84 %). Kun kolonni oli tasapainotettu 95-prosenttisella A-liuoksella, näyte ladattiin autosamplerista Trap-kolonniin. Peptidien fragmenttien massa-lataussuhde kerättiin seuraavasti: yhteensä 20 fragmenttikuviota otettiin jokaisen täyden skannauksen jälkeen. Massaspektrometrian testin raakatiedostosta tehtiin haku Mascot 2.2 -ohjelmistolla vastaavaan tietokantaan.

Peptidien synteesi

Potentiaaliset ACE:n estäjäpeptidit, jotka tunnistettiin LC-MS/MS:llä, syntetisoitiin GL Biochemissä (Shanghai, Kiina). Synteettisten peptidien puhtaus varmistettiin edelleen HPLC:llä, joka oli yli 95 %.

ACE:n eston kinetiikka

G. biloba -peptidin kineettistä estomallia testattiin käyttäen Lin et al. (2017) menetelmää. Lyhyesti sanottuna substraatin HHL:n eri pitoisuuksien (0,5, 1, 2 ja 5 mM) annettiin reagoida ACE:n kanssa. Lineweaver-Burk-kaavio perustui reaktionopeuden (1/v) ja substraattikonsentraation (1/) käänteisarvoon. X- ja Y-akselien leikkauspisteet edustivat vastaavasti Km:n ja Vmax:n käänteisarvoja.

Docking-analyysi

Tätä varten ladattiin ACE-proteiinin kolmiulotteinen rakennetiedosto (PDB ID: 1O8A) RCSB:n proteiinidatapankista (RCSB Protein Data Bank, PDB1). G. biloba -peptidien kolmiulotteinen rakenne piirrettiin molekyylisimulointiohjelmalla Discovery Studio 3.5. Hydroprosessointi suoritettiin ja energia minimoitiin CHARMM-ohjelmalla. Lisäksi Zn2+ säilytettiin ACE-mallissa. DS 3.5 -ohjelmisto pisteytti telakointituloksen oman pisteytysfunktionsa mukaisesti, joka perustui kunkin tuloksen pisteisiin ja yhdistettyyn vapaaseen energiaan. Kaikkien tulosten joukosta valittiin paremmin sopiva tulos.

Statistinen analyysi

Yksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Duncanin moniarvotesti käyttäen SPSS Statistics 20.0 -ohjelmaa (SPSS, Inc, Chicago, IL, Yhdysvallat) käytettiin tietojen analysointiin merkitsevyyserolla (P ≤ 0.05).

Tulokset

GPH:iden DH- ja ACE-estäjäaktiivisuus

Kuten kuvasta 1A voidaan nähdä, DH pidentyi ajan myötä koko hydrolyysiprosessin ajan. DH kasvoi nopeasti ennen 2 h:n jaksoa, minkä jälkeen kasvuvauhti vähitellen hidastui ajan myötä. Yleisesti ottaen hydrolyysinopeus oli korkea ensimmäisen 1 tunnin ajan, minkä jälkeen se väheni tai pysyi vakiona. Neljästä proteaasista alkalaasilla oli korkein DH, joka oli 14,7 % 5 tunnin kuluttua, ja seuraavina olivat trypsiini (8,91 %) ja dispaasi (6,91 %). Alhaisin DH-arvo havaittiin flavourzyymillä, joka oli vain 3,23 % 5 h:n kuluttua. Nämä tulokset viittasivat siihen, että proteaasit pilkkovat GPI:tä eri kohdissa, mikä johti proteiinihydrolysaatteihin, joilla on erilainen peptidikoostumus.

Kuten neljän proteaasihydrolysaatin ACE:tä estävästä aktiivisuudesta voidaan todeta, että aktiivisuus lisääntyi DH:lla ajan kuluessa. Kuten kuvasta 1B käy ilmi, alakalaasin, trypsiinin, dispaasin ja flavourzyymin inhiboiva aktiivisuus 5 tunnin kohdalla oli vastaavasti 62,70, 39,81, 48,39 ja 25,95 %. Niiden erilaisten pilkkoutumiskohtien vuoksi saatiin erilaisia peptidejä, joilla oli erilaiset ACE:tä estävät aktiivisuudet. Niistä emäksisen hydrolysaatin aktiivisuus oli suhteellisen voimakkaampi, mikä osoitti, että emäksinen proteaasi voi tehokkaasti tuottaa hydrolysaattia, jolla on suurempi ACE:n estovaikutus.

GPH:iden ja membraanifraktioiden ACE:n estävä aktiivisuus

GPH:iden ja niiden tuloksena syntyneiden fraktioiden ACE:n estävä aktiivisuus riippui merkitsevästi MW:n arvosta, kuten on esitetty kuvissa 1C,D. Näytepitoisuuksilla 1 mg/ml ACE:n inhiboiva aktiivisuus kasvoi asteittain, kun komponenttien MW pieneni. Estoaktiivisuus 3-5 ja 5-10 kDa:n pitoisuuksilla oli 44,94 % (IC50 = 1,257 mg/ml) ja 44,04 % (IC50 = 1,765 mg/ml). Tämän jälkeen aktiivisuus kasvoi asteittain pienemmän MW:n myötä ja saavutti korkeimman tason (69,86 %; IC50 = 0,224 mg/ml) <1 kDa:n kohdalla.

Ginkgo-peptidien puhdistus

Alkalaasia käytetään usein aktiivisten peptidien valmistukseen sen laajan spesifisyyden ja vahvan proteiinien hajotuskyvyn vuoksi. Ultrasuodatuskäsittelystä kävi ilmi, että ACE:tä estävä aktiivisuus parani polypeptidin MW:n pienentyessä. Siksi <1 kDa:n fraktion peptidi puhdistettiin edelleen Sephadex G-15 -kolonnilla. Kuvasta 2A nähdään, että Sephadex G-15 jakautui kolmeen komponenttiin (A1, A2 ja A3). Kolme komponenttia kerättiin ja lyofilisoitiin, ja niiden ACE:tä estävä aktiivisuus mitattiin. Tulokset on esitetty kuvassa 2B. Kolmen komponentin ACE:tä estävä aktiivisuus (1 mg/ml) oli 64,08 %, 58,55 % ja 74,96 %. Siksi aktiivisin A3-komponentti valittiin seuraavan vaiheen rakenteellista tunnistusta varten.

Ginkgo-peptidien tunnistaminen ja peptidisynteesi

Potentiaalisen ACE:tä estävän peptidin tunnistamiseksi aktiivisin komponentti A3 analysoitiin LC-MS/MS-analyysillä (lisätaulukko S1). Tämän perusteella A3-komponentista seulottiin kolme peptidiä, joiden aminohapposekvenssit olivat Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY) ja Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (kuva 3). Näiden peptidien tunnistetut sekvenssit koostuivat 5-7 aminohappojäännöksestä. Näiden kolmen peptidifraktion ACE:tä estävän aktiivisuuden tunnistamiseksi peptidit syntetisoitiin kemiallisesti. Saadut syntetisoidut peptidit tunnistettiin massaspektrometrisesti (kuvat 4A-C). Tulokset osoittivat, että TNLDWY:n, RADFY:n ja RVFDGAV:n IC50-arvot olivat vastaavasti 1,932, 1,35 ja 1,006 mM (kuva 4D).

Ginkgo-peptidien estomekanismi

G. biloba -peptidin estomekanismia analysoitiin Lineweaver-Burk-plotin mukaisesti. Kuten kuvasta 5 voidaan nähdä, kun Ginkgo-peptidiä TNLDWY lisättiin, sekä Vmax että Km muuttuivat, Vmax kasvoi peptidikonsentraation kasvaessa; sen sijaan Km ei muuttunut merkittävästi peptidikonsentraation myötä, mikä osoitti, että sen inhibitiomalli voi olla ei-kilpaileva inhibitiotapa. RADFY:n ja RVFDGAV:n osalta Vmax ei muuttunut merkittävästi konsentraation myötä; kun taas Km kasvoi peptidikonsentraation kasvaessa, mikä osoittaa, että molemmat peptidit ovat kilpailevia inhibiittoreita, jotka voivat sitoutua ACE:n aktiivisiin kohtiin, jolloin ne estävät ACE:n sitoutumisen substraattiin ja estävät ACE:n aktiivisuutta.

Peptidien ja ACE:n välinen molekulaarinen telakoitumissimulaatio

Tässä tutkimuksessa arvioitiin kolmen peptidin vuorovaikutusta ACE:n kanssa. Tulokset osoittivat, että kaikki peptidit pystyivät sitoutumaan hyvin ACE:hen ja muodostamaan vakaan kompleksin, mikä viittaa niiden käyttöön potentiaalisena ACE:n estäjänä. Taulukossa 1 esitetään – Cdockerin vuorovaikutusenergian pisteet. TNLDWY-, RADFY- ja RVFDGAV-fraktioiden pisteet olivat vastaavasti 102,995, 105,335 ja 117,706. Molekyylidockaustulokset on esitetty kuvassa 6 ja taulukossa 2. TNLDWY:n optimaalinen telakointiasento voi muodostaa kuusi vetysidosta, joista se muodosti vetysidoksia Ala 354:n, Tyr523:n kanssa aktiivisessa taskussa S1, His353:n, His513:n kanssa aktiivisessa taskussa S2 ja Zn2+ -jäännösten kanssa, ja sen todettiin olevan vakaasti sidoksissa kaikkien niiden kanssa. Tämä saattaa liittyä peptidin voimakkaaseen ACE:tä estävään aktiivisuuteen. Kuvasta 6B havaittiin, että RADFY voi muodostaa seitsemän vetysidosta aminohappojäämien kanssa ja molekyylien välisiä vetysidoksia jäännösten Gln281, His353, His513 ja Tyr520 kanssa aktiivisessa S2-taskussa. Näiden vetysidosten muodostuminen vakautti entsyymi-peptidikompleksia huomattavasti. Lisäksi RADFY muodosti ionisidoksen Zn2+:n kanssa, konjugaattivoimia Val380:n, His383:n, Glu384:n, His387:n, Glu411:n, Lys511:n ja Tyr523:n kanssa sekä van der Waalsin voiman aminohappojäämän Trp356 kanssa. Nämä vuorovaikutukset voivat johtaa Zn2+ -ligandin deformaatioon ja ACE:n inaktivoitumiseen. TNLDWY:hen ja RADFY:hen verrattuna RVFDGAV voi muodostaa neljä vetysidosta aminohappojäämien kanssa, mikä oli vakaasti yhteydessä ALA354:ään, TYR523:een S1-aktiivisessa taskussa ja Glu162:een S1′-aktiivisessa taskussa. RVFDGAV pystyi kuitenkin muodostamaan ionisidoksia Zn2+:n kanssa, mikä johti suoraan ACE-molekyylien deaktivoitumiseen. Lisäksi se muodosti konjugaatin aminohappojäännösten, kuten Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 ja Phe527 kanssa (kuva 6C).

Keskustelu

Viime vuosina kasviproteiinista elintarvikkeisiin johdetut ACE:n estäjäpeptidit ovat herättäneet yhä enemmän huomiota niiden vähäisempien sivuvaikutusten vuoksi. Tässä tutkimuksessa Ginkgo-proteiinin hydrolysoimiseen käytettiin alkalaasia, dispaasia, trypsiiniä ja flavorzyymiä. Alkalaasilla hydrolysoimalla saadun ginkgoproteiinihydrolysaatin DH- ja ACE:tä estävä aktiivisuus ilmoitettiin korkeimmaksi. Hydrolyysiprosessi tapahtui nopeasti alkuvaiheessa, mikä johti monien peptidisidosten hydrolyysiin, minkä jälkeen hydrolyysinopeus hidastui hydrolyysin käytettävissä olevien substraattien asteittaisen vähenemisen vuoksi (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Nämä havainnot olivat yhdenmukaisia aiemman raportin kanssa, jonka mukaan rypsiproteiinihydrolysaateilla oli tehokas ACE:tä estävä vaikutus, kun ne hydrolysoitiin alkalaasilla (He et al., 2013).

Angiotensiinikonvertaasientsyymi on monitoiminen solunulkoinen dipeptidaasi, jota esiintyy eri kudoksissa. ACE:n estävä vaikutus alentaa verenpainetta vähentämällä angiotensiini II:n tuotantoa ja vähentämällä kiniinien tuhoutumista (Zheng ym., 2017). Hydrolysaatin ACE:tä estävä aktiivisuus liittyi molekyylipainojakaumaan. Ultrasuodatusta käytettiin ginkgohydrolysaatin erottamiseen viideksi komponentiksi. Molekyylipainon <1 kDa kohdalla Ginkgo-hydrolysaatin ACE:tä estävän aktiivisuuden ilmoitettiin olevan korkein. Tämä havainto oli yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, joissa raportoitiin alhaisen MW:n polypeptidien korkeammasta ACE-aktiivisuudesta (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Lisäksi Silvestre et al. (2012) vahvistivat, että ultrasuodatuskäsittely voi pidättää peptidejä (AAA) C-terminaalisessa asemassa edistääkseen ACE:n inhiboivaa aktiivisuutta.

Korkea-aktiivisen ACE:n inhiboivan peptidin jatkopuhdistamiseksi Ginkgo-komponentti (<1 kDa) erotettiin geelisuodatuskromatografialla ja aminohapposekvenssi identifioitiin LC-MS/MS:llä. Näin saatiin kolme uutta ACE:tä estävää peptidiä: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) ja RVFDGAV (1,006 mM), jotka osoittivat voimakasta ACE:tä estävää aktiivisuutta. Hernández-Ledesman ym. (2011) raportin mukaan useimmat ACE:tä estävät peptidit olivat lyhyitä sekvenssejä, jotka koostuivat 2-12 aminohaposta. Lisäksi ACE:tä estävän peptidin aktiivisuus oli vahvasti yhteydessä sen C-terminaalisen aminohapon, aromaattisen aminohapon ja hydrofobisen aminohapon läsnäoloon. Esimerkiksi aromaattisen aminohapon (Tyr, Phe ja Trp) läsnäolo lisäsi merkittävästi ACE:tä estävän peptidin aktiivisuutta. Lisäksi Argilla tiedetään olevan myös tärkeä rooli inhiboivassa peptidissä. Toopcham et al. (2017) osoittivat, että polypeptidin inhiboiva aktiivisuus väheni merkittävästi Argin poistamisen jälkeen. Lisäksi Liu et al. (2018) osoittivat, että peptidissä oleva aminohappo, kuten Leu, vaikutti merkittävästi ACE:n inhiboivaan aktiivisuuteen riippumatta sen sijainnista C-terminaalissa tai N-terminaalissa. Samanlaisia tuloksia raportoivat myös Lee ja Hur (2017). Näissä tutkimuksissa raportoitiin, että eri proteiinimateriaaleista peräisin olevilla KPLL-, VLAQYK- ja DLP-peptideillä oli huomattava ACE:tä estävä aktiivisuus hydrofobisen aminohapon (Leu) läsnä ollessa. Tutkimuksessamme Tyr sijaitsi TNLDWY:n ja RADFY:n C-terminaalissa. Lisäksi RADFY:n ja RVFDGAV:n kaksi peptidiä sisälsivät Argia N-terminaalissa, ja hydrofobisten aminohappojen pitoisuus näissä kolmessa peptidissä oli suurempi. Ennen kaikkea peptidifragmentit vastasivat ACE:tä inhiboivien peptidien rakenteellisia ominaisuuksia.

ACE:tä inhiboivien peptidien inhibointitapa havaittiin yleisesti ei-kilpailulliseksi, kilpailulliseksi ja sekamuotoiseksi. Lyhyiden peptidien (2-12 aminohappoa) osalta useimmat niistä olivat kilpailevia estäjiä, ja ne kiinnittyivät ACE-entsyymiin estääkseen substraatin HHL:n sitoutumisen. Lin et al. (2017) samankaltainen tutkimus osoitti, että Qula-kaseiinista peräisin olevilla peptideillä KYIPIQ ja LPLPLL oli kilpailullinen inhibitiotapa. Ei-kompetitiivisten inhibiittorien osalta ne kuitenkin sitoutuvat muihin kohtiin kuin entsyymin substraatin sitoutumiskohtaan ja vaikuttavat lopulta substraatin sitoutumiseen entsyymiin. Samanlaisia malleja havaittiin elintarvikkeista peräisin olevien inhiboivien peptidien, kuten Qula-kaseiinista peräisin olevan PFPGPIPN:n ja hasselpähkinäpeptidin YLVR:n, kohdalla (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). Tässä kilpailutilassa ACE, substraatti ja peptidi muodostivat entsyymi-substraatti-inhibiittorikompleksin, joka esti tuotteen vapautumisen edelleen ja johti Vmax:n pienenemiseen (Barbana ja Boye, 2011).

ACE:n ja inhiboivien peptidien välisen molekulaarisen vuorovaikutusmekanismin tutkiminen on hyödyllistä uusien ACE:n inhiboivien peptidien seulonnassa ja suunnittelussa. Inhiboivien peptidien molekulaarisista vuorovaikutussuhteista on kuitenkin saatavilla riittämättömästi tietoa. Molekulaarinen telakointi perustuu ligandien ja reseptorien ”lukko- ja avainperiaatteeseen”, jolla simuloidaan pienten molekyylien ligandien ja reseptorien biomakromolekyylien välistä vuorovaikutusta. Niiden välinen sitoutumistapa ja affiniteetti mahdollistaa lääkkeiden virtuaalisen seulonnan. ACE on Zn2+-riippuvainen karboksidipeptidientsyymi, jossa Zn2+ on tärkeä osa ACE:n aktiivista keskusta (Pina ja Roque, 2009). Aiemmin raportoitujen tietojen mukaan (Pan et al., 2012) ACE:n aktiivisen keskuksen tärkeimmät vuorovaikutusjäännökset jaettiin kolmeen aktiiviseen taskuun (S1, S2 ja S1′). S1 (Ala354, Glu384 ja Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 ja Tyr520); ja S1′ (Glu162-jäännös). ACE:n aktiivisessa keskuksessa kaksi histidiiniä (His383 ja His387) yhdessä Glu 411:n kanssa muodostivat Zn2+-ligandin. On raportoitu, että peptidien aiheuttaman ACE-aktiivisuuden esto voidaan saavuttaa vetysidostabiilien entsyymi-peptidikompleksien yhdistelmällä (Fu et al., 2017). Lisäksi van der Waalsin voimien muodostuminen aminohappojäämien, kuten His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 ja Pro519, kanssa, konjugaattivuorovaikutus Tyr360:n kanssa ja ei-kovalenttiset vuorovaikutukset Glu384:n, Arg522:n kanssa voivat myös osaltaan vaikuttaa entsyymi-peptidikompleksien vakauteen. Näiden voimien läsnäolo tekee entsyymi-peptidikompleksin rakenteesta vakaamman, mikä edistää ACE-aktiivisuuden estämistä, mikä voi olla syynä TNLDWY:n, RADFY:n ja RVFDGAV:n voimakkaaseen ACE:tä estävään aktiivisuuteen.

Loppupäätelmä

Tässä tutkimuksessa G. biloban siemeniä käytettiin potentiaalisten ACE:tä estävien peptidien valmistamiseen. Eri proteaaseista valmistetut GPH:t osoittivat erilaista ACE:tä estävää aktiivisuutta in vitro. Korkeimmat DH- ja in vitro ACE:tä estävät aktiivisuudet havaittiin alkalaasista valmistetuissa GPH:issa. Alkaasilla ultrasuodattamalla saadut komponentit osoittivat, että pienemmän MW:n peptidit antoivat voimakkaamman ACE:tä estävän aktiivisuuden. Peptidifraktiosta (<1 kDa) saatiin LC-MS/MS:llä kolme potentiaalista ACE:tä estävää peptidiä (TNLDWY, RADFY ja RVFDGAV). RVFDGAV osoitti suurinta ACE:tä estävää aktiivisuutta IC50-arvon ollessa 1,006 mM, ja se vaikutti kilpailevalta inhibiittorilta. Molekyylien telakointitulokset osoittivat, että peptidit pystyivät sitoutumaan kiinteästi ACE:hen ja vuorovaikuttamaan edelleen ACE:n aktiivisen alueen aminohappojäännösten kanssa. Tuloksemme osoittivat, että alkalaasin entsymaattisella hydrolyysillä saaduilla peptideillä oli tehokas ACE-estäjäaktiivisuus in vitro, mikä tekee niistä potentiaalisia ehdokkaita funktionaalisten elintarvikkeiden tai verenpainelääkkeiden kehittämiseen tulevaisuudessa.

Tekijän myötävaikutukset

F-FM, HW, C-KW ja KT osallistuivat projektin suunnitteluun, suorittivat suurimman osan kokeista ja laativat käsikirjoituksen. Z-JW ja LJ osallistuivat koesuunnitteluun, käsikirjoituksen valmisteluun ja toimittamiseen. Kaikki kirjoittajat osallistuivat käsikirjoituksen kirjoittamiseen ja/tai tarkistivat sitä kriittisesti tärkeän henkisen sisällön osalta.

Rahoitus

Tämä tutkimus sai tukea Anhuin maakunnan tieteen ja teknologian suurhankkeista (17030701024, 17030701058 ja 17030701028) ja Anhuin maakunnan keskeisestä tutkimus- ja kehitysprojektista (1704g07020110 ja 1804b06020347).

Irintaristiriitoja koskeva lausunto

HW oli Anhui Habopharmqnceutical Co.:n palveluksessa, Ltd. Z-JW oli Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd:n palveluksessa.

Muut kirjoittajat ilmoittavat, että tutkimus suoritettiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdolliseksi eturistiriidaksi.

Täydentävä aineisto

Tämän artikkelin täydentävä aineisto löytyy verkosta osoitteesta: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Alaviitteet

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do