Frontiers in Plant Science

Introduction

Abioottiset stressit vähentävät dramaattisesti viljelykasvien satoja, mikä johtaa valtaviin taloudellisiin tappioihin ja uhkaa elintarviketurvaa (Boyer, 1982; Bray et al., 2000; Cramer et al., 2011), ja ilmastonmuutos todennäköisesti pahentaa tätä ongelmaa (Mittler ja Blumwald, 2010; Lobell et al., 2011; Lesk et al., 2016). Samaan aikaan maailmanlaajuinen ihmisväestö kasvaa jatkuvasti; vuoden 2011 lopun 7 miljardista ihmisestä sen odotetaan ylittävän 9 miljardia ihmistä vuoteen 2050 mennessä (Yhdistyneiden kansakuntien talous- ja sosiaaliasioiden osaston väestöosasto, 2011). Näin ollen maailmanlaajuisen kasvintuotannon kysynnän odotetaan kaksinkertaistuvan vuoteen 2050 mennessä (Tilman et al., 2011). Suurin osa uudesta maatalouskelpoisesta maasta sijaitsee kuitenkin karuissa ympäristöissä, kuten kuivilla alueilla ja aavikoilla, jotka kattavat noin 41 prosenttia maailman maa-alasta (Millennium Ecosystem Assessment, 2005). Sen vuoksi satojen parantaminen useissa stressitilanteissa on elintärkeää, jotta voidaan ehkäistä menetyksiä siellä, missä nykyisin viljellään viljelykasveja, ja jotta niitä voidaan viljellä marginaalisemmalla maalla.

Mallikasvi Arabidopsis thaliana on tarjonnut paljon tietoa kasvien molekulaarisista vasteista stressiin. Arabidopsis on kuitenkin stressille herkkä kasvi, ja siksi uusien stressinsietomekanismien ja -geenien etsiminen on johtanut kasvavaan kiinnostukseen luonnostaan stressiä sietäviä kasveja kohtaan, jotka ovat kotoisin ääriympäristöistä – niin sanottuja ”extremofyyttejä” (John ja Spangenberg, 2005; Amtmann, 2009; Dassanayake et al., 2009; Smaoui et al., 2011; Gechev et al., 2012; Oh et al., 2012; Bressan et al., 2013; Cheeseman, 2014; Flowers et al., 2015; Zhu et al., 2015). Yksi menestyksekäs strategia on ollut tutkia extremofyytti Arabidopsis-sukulaisia (Brassicaceae), kuten metallin hyperakkumulaattoria Arabidopsis halleri (Hanikenne et al., 2008) sekä halofyytit Schrenkiella parvula (aiemmin Thellungiella parvula) ja Eutrema salsugineum (aiemmin Thellungiella salsuginea tai Thellungiella halophila) (Volkov ym., 2003; Inan ym., 2004; Orsini ym., 2010; Koch ja German, 2013). Sen lisäksi, että E. salsugineum sietää suolaa (esim. Inan et al., 2004; Taji et al., 2004; Kant et al., 2006), se sietää myös alhaisia maaperän typpipitoisuuksia (Kant et al., 2008), korkeita booripitoisuuksia (Lamdan et al., 2012), alhaisia fosfaattitasoja (Velasco et al., 2016), lämpöstressiä (Higashi et al., 2013), ja se osoittaa samanlaista kylmä- ja pakkasstressin sietokykyä kuin Arabidopsis (Griffith et al., 2007; Lee et al., 2012). Useat tekijät vaikuttavat E. salsugineumin stressinsietokykyyn, mukaan lukien stressinsietogeenien ja aineenvaihduntatuotteiden konstitutiivinen ylös- ja alasregulaatio, mikä viittaa siihen, että E. salsugineum on ”viritetty” stressiä varten, ionikuljetukseen liittyvien geenien geenikopiolukumäärän laajeneminen, duplikoituneiden geenien ali- ja uusfunktionaalistuminen, vinoutunut koodoninkäyttö, joka helpottaa ionikuljetukseen liittyvien proteiinien tehokkaampaa translaatiota, ja linjaspesifisten geenien mahdollinen osallistuminen (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005; Kant et al., 2006, 2008; Lugan et al., 2010; Oh et al., 2010, 2012, 2014; Sun et al., 2010; Dassanayake et al., 2011; Wu et al., 2012; Champigny et al., 2013; Kazachkova et al., 2013; Yang et al., 2013).

Erilaiset rasitukset, joita kohtaan ekstremofyytti osoittaa sietokykyä, kuvastavat kullekin tietylle elinympäristölle ominaista rasitusten yhdistelmää. Jotta siis saataisiin kattava käsitys siitä, miten kasvit selviytyvät useista stressitekijöistä, on elintärkeää tutkia extremofyyttejä useista eri elinympäristöistä. Etelä-Israelissa sijaitsevalle Negevin aavikolle, joka on osa Saharan ja Arabian aavikkovyöhykettä, on ominaista äärimmäisten lämpötilojen, veden ja ravinteiden vähäisen saatavuuden sekä korkean suolapitoisuuden ja säteilytason yhdistelmä, ja sitä pidetään ”kuivana” vyöhykkeenä, jossa vuotuinen sademäärä on 25-200 millimetriä, mikä on arvaamatonta, ja sen alueellinen ja ajallinen vaihtelu on voimakasta (Gutterman, 2002; Ward, 2009). Lämpötilat voivat vaihdella sekä päivittäin että kausittain absoluuttisen päivittäisen enimmäis- ja vähimmäislämpötilan vaihdellessa 46,8 °C:n ja -3,6 °C:n välillä1. Nämä ääriolosuhteet yhdessä maaperän suolapitoisuuden saarekkeiden kanssa ovat johtaneet erityisiin morfologisiin, fysiologisiin ja geneettisiin sopeutumisiin, joiden ansiosta kasvit voivat menestyä. Näin ollen Negevin autiomaa on todennäköisesti abioottiseen stressiin sopeutumiseen liittyvien geenien biogeneettinen aarrearkku.

Olemme seuloneet useita 25:stä Negevin autiomaassa elävästä brassicaceae-lajista sietokyvyn suhteen useisiin abioottisiin stressitekijöihin. Yksi näistä on Anastatica hierochuntica (True Rose of Jericho), talvella yksivuotinen, Sahara-Arabian aavikon kasvilaji, jonka Linnaei (1753) kuvasi ensimmäisen kerran ja joka kolonisoi wadies- tai runnelien ylimmät, kuivimmat vyöhykkeet (Friedman ja Stein, 1980; Friedman et al., 1981). A. hierochuntica on tunnettu hygrochasy-siementen leviämismekanismista, jossa kasvi kuolee, kuivuu ja turgoripaineen aleneminen saa oksat käpristymään, jolloin ne suojaavat siemeniä ja estävät niiden leviämisen (Friedman ym., 1978; Hegazy ym., 2006). Kun vakava sadekuuro aiheuttaa kuolleen kasvin kastumisen, oksat avautuvat ja siemenkapselit (siliculae) avautuvat. Siemenet leviävät sadepisaroiden osuessa avoinna oleviin siliculaeihin (Gutterman, 2002; Hegazy et al., 2006). Vaikka A. hierochuntica on kuollut, sitä on usein luultu ylösnousemuskasviksi.

Tässä tutkimuksessa selvitetään, kestääkö A. hierochuntica kuumuutta, vähäistä nitraattipitoisuutta ja suolaista stressiä, jotka liittyvät sen aavikkoympäristöön. Ottaen suolastressin tapaustutkimukseksi selvitämme, onko A. hierochunticalla samanlaisia fysiologisia suolan sietomekanismeja kuin sen halofyyttisellä sukulaisella E. salsugineumilla, ja ovatko nämä kaksi hyvin erilaisista ympäristöistä peräisin olevaa extremofyyttiä kehittäneet yhteisiä ja/tai lajikohtaisia aineenvaihduntastrategioita selviytyäkseen suolastressistä.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvimateriaali ja kasvuolosuhteet

Anastatica hierochuntican siemenet kerättiin alun perin Negevin autiomaasta (455881′ pohjoista leveyttä ja 200751′ itäistä pituutta) Israelista. Alkuperäiset siemenet kerättiin Ben-Gurionin yliopiston koekentillä Midreshet Ben-Gurionissa, ja tästä kokoelmasta saatuja siemeniä kasvatettiin edelleen kasvihuoneolosuhteissa (16 h valoa (150 μmol m-2 s-1)/8 h pimeää; 22 °C). F4-sukupolven siemeniä käytettiin tässä raportissa esitetyissä kokeissa. A. thalianan (Col-0), A. hierochuntican ja E. salsugineumin (Shandong-ekotyyppi) siemenet steriloitiin pintasteriloimalla 50-prosenttisella kaupallisella valkaisuaineella 5 minuutin ajan ja huuhdeltiin sitten neljä kertaa steriilillä vedellä. A. hierochuntican siemenet kylvettiin ravinneagarlevyille, jotka sisälsivät MS-mediumia (Murashige and Skoog, 1962), pH 5,7, 0,5 g L-1 MES, 2 % (w/v) sakkaroosia ja 0,8 % (w/v) agaria (Duchefa Biochemie), kun taas Arabidopsiksen ja E. salsugineumin siemenet suspendoitiin 0,12 % agaroosiin ennen levylle kylvämistä. Siemenet kerrostettiin 4 °C:ssa (Arabidopsis, 4 päivää; E. salsugineum, 7 päivää; A. hierochuntica, 1 päivä) ja levyjä inkuboitiin kasvihuoneessa. Kolmen lajin siemenet kylvettiin porrastetusti siten, että itäminen tapahtui suunnilleen samaan aikaan. Maaperäkokeita varten taimet, joiden sikiöt olivat täysin kehittyneet, siirrettiin levyiltä 7 cm × 7 cm × 8 cm:n ruukkuihin, jotka sisälsivät Arabidopsis-multaa (Weizmann Institute of Science; 70 % hienoturvetta, 30 % perliittiä 4), ja ne kasteltiin kenttäkapasiteettiin asti 1 g L-1:llä 20-20-20 NPK + hivenaineita sisältävällä liuoksella (Haifa Chemicals). Ruukut sisältävät tasot peitettiin muovikupuilla ja sijoitettiin kasvihuoneeseen. Kahden päivän kuluttua kupolit poistettiin vähitellen, jotta taimet kovettuisivat. Levyjä tai ruukkuja sekoitettiin joka päivä hyllyasennon vaikutusten poistamiseksi. Vaikka Arabidopsiksen ja E. salsugineumin kanssa tehtäviä vertailututkimuksia varten kasvihuoneen valo-olosuhteet olivat alhaisemmat kuin A. hierochuntican tavallisesti kohtaamat valo-olosuhteet, täydentävästä kuvasta S1 käy ilmi, että A. hierochuntican kasvuvauhti pysyy aina alhaisempana kuin Arabidopsiksen kasvuvauhti korkeammillakin valon intensiteeteillä. Tämä viittaa siihen, että A. hierochuntican hitaampi kasvu suhteessa Arabidopsikseen ja E. salsugineumiin ei johtunut kasvihuoneen valo-olosuhteista.

Abioottiset stressitutkimukset

Levyihin perustuvia in vitro -analyysejä varten lämpöstressiä (45 °C) sovellettiin eri pituisia aikoja, ja levyt siirrettiin takaisin kasvihuoneeseen vielä 48 tunniksi. Suolastressiä, matalaa NO3:n pitoisuutta aiheuttavaa stressiä, vähäistä NO3:n pitoisuutta aiheuttavaa stressausta ja hapettumisstressiä varten taimet kylvettiin ensin kontrollinmukaisille MS-levyille. Juurten erilaisen kasvunopeuden vuoksi A. hierochuntican ja Arabidopsiksen taimet siirrettiin stressikäsittelylevyille 1 ja 5 päivän kuluttua stratifioinnista. Juurten pidentymismääritystä varten 10 yhtenäistä taimea siirrettiin pystysuorille neliönmuotoisille MS-levyille, jotka sisälsivät eri NaCl-pitoisuuksia. Sakkaroosin ottamisesta ilmakudoksiin johtuvien osmoottisten vaikutusten estämiseksi (MacGregor et al., 2008) agarin yläosa leikattiin pois ennen taimien siirtoa sen varmistamiseksi, että versot eivät olleet kosketuksissa väliaineen kanssa. Matalan NO3-pitoisuuden ja oksidatiivisen stressin kokeita varten yhdenmukaiset Arabidopsis- tai A. hierochuntica -taimet siirrettiin viideksi päiväksi pystysuorille neliönmuotoisille levyille, jotka sisälsivät MS-makroelementtejä (vähennettynä ammoniumnitraatilla matalan N-pitoisuuden kokeita varten) ja mikroelementtejä, pH 5,7 (säädetty KOH:lla), 0,5 g L-1:n MES:ää, 2 % (w/v) sakkaroosia, 0.8 % (w/v) agaria (Duchefa Biochemie) ja eri pitoisuuksia joko KNO3- tai metyyliviologenia (MV; Sigma, M-2254).

Maaperäkokeissa suolakäsittelyt annettiin kasveille, joilla oli neljä todellista lehteä (Arabidopsis ja E. salsugineum) tai kaksi todellista lehteä (A. hierochuntica). Ruukut kasteltiin 1 g L-1:llä 20-20-20 NPK + hivenaineet -liuosta, jota täydennettiin eri NaCl-pitoisuuksilla. Suolakäsittelyt aloitettiin 50 prosentilla lopullisesta suolapitoisuudesta, ja viikkoa myöhemmin annettiin 100 prosenttia kustakin suolapitoisuudesta. Kasvit korjattiin vielä viikon kuluttua.

Kasvuston kasvu, pigmentti-, ioni- ja klorofyllifluoresenssimittaukset

Versojen kuivapainot saatiin kuivaamalla näytteitä 75 °C:ssa 3 päivän ajan. Juurten pidentymismäärityksiä varten juuren pituus mitattiin 24 tunnin välein neljän päivän ajan, ja juuren suhteellinen kasvunopeus laskettiin jokaiselta peräkkäiseltä päivältä Huntin (1990) mukaisesti. Hapetusstressikokeissa juurten pituuskasvu laskettiin kaavalla (L4-L0)/L4, jossa L0 ja L4 ovat juurten pituudet päivinä 1 ja 4 MV-levyille siirtämisen jälkeen. Lehtien kokonaispinta-alan arvioimiseksi lehdet irrotettiin, asetettiin kahden läpinäkyvän kalvon (Graphic Vision Media) väliin ja skannattiin. Lehtien pinta-ala laskettiin ImageJ 1.43 -ohjelmistolla2. Antosyaanipitoisuus analysoitiin Kant et al. (2006) mukaan. Na+- ja K+-ionit uutettiin Kant ym. (2006) kuvauksen mukaisesti ja ionipitoisuudet määritettiin liekkifotometrialla (Model 410 Flame photometer, Sherwood Scientific, Ltd, UK). Klorofylli ja karotenoidit uutettiin 100-prosenttiseen metanoliin suhteessa 1:10 kudoksen ja liuottimen välillä, säilytettiin yön yli 4 °C:ssa pimeässä ja mitattiin Lichtenthalerin (1987) mukaisesti. Klorofyllin fluoresenssi mitattiin Mini-PAM-laitteella (Walz, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Saksa) käyttäen nopeaa valokäyrää (White ja Critchley, 1999). Ei-fotokemiallinen vaimennus (NPQ) ja PSII ETR laskettiin Bilgerin ja Björkmanin (1990) sekä Krallin ja Edwardsin (1992) mukaan.

Kromosomien lukumäärä ja DNA-pitoisuus

Kromosomien lukumäärän analyysi suoritettiin nuorista verson kärjen meristemiprotoplasteista käyttäen pisara-levitystekniikkaa, jota seurasi DAPI-värjäys ja kirkkaankenttämikroskopia Anamthawat-Jonssonin (2003) mukaan. 2C-DNA-pitoisuuden virtaussytometristä analysointia varten valmistettiin ydinsuspensiot pilkkomalla 60-100 mg nuorta verson kärjen kudosta 1 ml:aan jääkylmää ydinten eristyspuskuria (NIB; Dolezel et al., 1989), johon lisättiin 5 % polyvinyylipirrolidonia PVP-40. Kun näytteitä oli lisätty vielä 2 ml NIB:tä, niitä ravistettiin 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne suodatettiin 50 μm:n nailonverkon läpi ja sentrifugoitiin 1 900 rpm 8 minuutin ajan. Ytimiä sisältävä pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan jääkylmää NIB:tä, jota täydennettiin 50 μg m-1 DNaasivapaalla RNaasi A:lla ja 2 μg ml-1 propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich Chemical, Co., USA), vorteksoitiin varovasti muutaman sekunnin ajan ja inkuboitiin sitten jäällä 10 minuutin ajan. Näytteet suodatettiin 35 μm:n suodattimen läpi ja ajettiin Becton Dickinson FACSVantage SE -laitteella, joka on varustettu 640 nm:n dikroottisella pitkälle läpäisevällä suodattimella, 585/42 nm:n kaistanpäästösuodattimella ja ilmajäähdytteisellä argoni-ionilaserilla, joka on viritetty 15 mW:iin ja toimii 488 nm:ssä. Jokaisesta näytteestä tallennettiin 10 000 ydintä, jotta voitiin laskea G1-piikin keskimääräinen sijainti histogrammissa. Kunkin näytteen G0/G1-piikkien sijaintien suhteellisen fluoresenssin suhdetta verrattiin sisäiseen standardiin Raphanus sativus cv. Saxa, joka on genomin koon vertailukohde (2C = 1,11 pg DNA:ta). Sytometrin vahvistus säädettiin siten, että R. sativuksen G0/G1-piikki sijaitsi kanavalla 1500.

2C-DNA-pitoisuus laskettiin seuraavasti:

Näyte 2C = (näytteen G1-piikin keskimääräinen sijainti/vertailuhuipun G1-piikin keskimääräinen sijainti) × vertailunäytteen 2C-DNA.

Metaboliset profiilit

Kasvit kasvatettiin mullassa, ja ne altistettiin suolaiseen stressiin, kuten edellä on kuvattu. Arabidopsis- ja E. salsugineum -kasvien viides ja kuudes lehti sekä A. hierochuntica -kasvin kolmas ja neljäs lehti kerättiin, yhdistettiin, pakastettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 °C:ssa. Kullekin käsittelylle analysoitiin neljä biologista toistoa ja tehtiin kaksi riippumatonta koetta. Metaboliittien uuttaminen suoritettiin Lisecin ym. (2006) mukaisesti pienin muutoksin (Kazachkova ym., 2013).

Derivatisointi suoritettiin Lisecin ym. (2006) mukaisesti, kun taas erottelu, kromatogrammien arviointi ja metaboliittien tunnistaminen/annotointi suoritettiin Kazachkovan ym. (2013) mukaisesti. Metaboliittien suhteellinen runsaus määritettiin normalisoimalla kunkin metaboliitin piikin intensiteetti ribitol-standardiin, jolloin saatiin ”vaste”-arvot. Nämä arvot normalisoitiin log10-muunnoksella ja analysoitiin tilastollisesti MultiExperiment Viewer Version 3.1 -ohjelmistolla (Saeed et al., 2003). Kaksisuuntaiset ANOVA-testit tehtiin kaikkien lajien ja parillisten lajien välillä. Niiden aineenvaihduntatuotteiden määrittämiseksi, joihin suolakäsittely vaikutti merkittävästi kunkin lajin sisällä (kuva 8), suoritettiin yksisuuntainen ANOVA (lisätaulukko S3), jota seurasi Dunnettin testi. Pääkomponenttianalyysissä (PCA) käytettiin log10-muunnettuja vastetietoja, kun taas hierarkkinen klusterointi suoritettiin lineaaristen vastearvojen perusteella, jotka jaettiin kunkin aineenvaihduntatuotteen mediaanirunsaudella.

Tulokset

A. hierochuntica Morphology, Genome Organization, and DNA Content

Luonnossa A. hierochuntica -kasvit vaihtelevat suuresti kehitysnopeudessa ja rungon koossa muutamasta millimetristä 15-20 senttimetrin korkeuteen riippuen maaperän kosteuden saatavuudesta. Kuvassa 1 esitetään A. hierochuntican eri kehitysvaiheet laboratorio-olosuhteissa. Kasvun alkuvaiheessa kasvit ovat hyvin yhdenmukaisia, ja ne tuottavat kaksi sikiölehteä, joita seuraa kaksi vastakkaista paria soikeanmuotoisia, tiheästi karvapeitteisiä todellisia lehtiä (kuvat 1A-C). Verson haarautuminen alkaa, kun kolmas ja neljäs lehti erkanevat yksittäisiksi oksiksi. Haarakohtaan muodostuu kainalomainen kukinto, joka muodostaa tiheän rykelmän valkoisia kukkia, joissa on neljä terälehteä (kuvat 1D,G,H). Toistuva haarautuminen jatkuu seuraavien lansettimaisempien, hammastetumpien ja karvapeitteisempien lehtiparien välillä, mikä johtaa monihaaraiseen, sympodiaaliseen versorakenteeseen, jonka kolmiulotteinen kokonaisarkkitehtuuri voi vaihdella suuresti (kuvat 1E,F). Hedelmät ovat karvaisia, kaksisiipisiä silikulaareja, joissa kussakin on neljä siementä (kuvat 1I-K).

Happokarmiinivärjäystä käyttäen on raportoitu, että A. hierochuntican genomi on järjestäytynyt 11 (haploidiseen) kromosomiin (Lifante et al., 1992). Vahvistaaksemme tämän havainnon visualisoimme A. hierochuntica -kromosomeja protoplastipudotusprotokollaa käyttäen (Anamthawat-Jonsson, 2003). 4′, 6-diamidino-2-fenylindoli (DAPI) -värjäyksen analyysi osoitti selvästi 22 kromosomin läsnäolon (diploidi) (kuva 2A). Virtaussytometria osoitti, että A. hierochuntican genomi on noin 4,5 kertaa suurempi kuin Arabidopsiksen genomi (kuvat 2B,C). Validoidaksemme tuloksemme suoritimme virtaussytometriaa myös E. salsugineum -lajilla ja osoitimme, että tämän lajin genomi on noin kaksi kertaa niin suuri kuin Arabidopsiksen genomi, kuten Inan et al. (2004) aiemmin raportoivat. Näin ollen A. hierochuntican genomin koko on noin 607 Mbp.

A. hierochuntica Exhibits Tolerance to Abiotic Stresses Associated with Its Desert Habitat

Anastatica hierochuntica -kasvit voivat kokea yli 40 °C:n päivittäisiä lämpötiloja. Lisäksi Negevin aavikolle on ominaista, että maaperän typpivarastot ovat hajanaisia (Zaady, 2005). Esimerkiksi maaperän NO3- pitoisuudet vaihtelivat 0,4 ja 4 mM:n välillä (tietoja ei ole esitetty). Siksi testasimme, kestääkö A. hierochuntica paremmin lämpöstressiä ja kasvualustan alhaisia NO3- pitoisuuksia kuin Arabidopsis. Molempien lajien in vitro-kasvatetut taimet (kahden siemenlohkon vaiheessa) selvisivät 1 tunnin lämpöstressistä (45 °C) siten, että molempien lajien tuorepaino väheni noin 25 prosenttia, mutta klorofylli- tai karotenoidipitoisuuteen ei ollut vaikutusta (kuvat 3A-D; täydentävä kuva S2). Kahden tunnin lämpöstressi vaikutti vakavasti Arabidopsis-taimiin jättäen ne kalpeiksi tai valkeiksi (kuva 3A). Tämä vaikutus näkyi FW:n vähenemisenä 67 prosentilla ja klorofylli- ja karotenoidipitoisuuden vähenemisenä 45 ja 54 prosentilla verrattuna kontrollitaimiin. Toisaalta A. hierochuntica -taimien FW ei enää vähentynyt 1 tunnin lämpöstressiin verrattuna eikä klorofylli- ja karotenoidipitoisuuksiin ollut vaikutusta kontrolliin verrattuna. Kolmen ja neljän tunnin lämpöstressi aiheutti vakavaa stressiä Arabidopsis-taimille, mikä näkyi siinä, että taimet eivät enää kasvaneet ja sytyliledonit valkaistuivat lähes kokonaan. Sitä vastoin A. hierochuntica osoitti huomattavasti suurempaa lämmönkestävyyttä kuin Arabidopsis 3 ja 4 tunnin lämpöstressin jälkeen. Esimerkiksi 4 tunnin lämpöstressi aiheutti A. hierochuntican FW:n 50 prosentin laskun, kun taas Arabidopsiksen FW:n lasku oli 73 prosenttia. Lisäksi A. hierochuntican taimet eivät valkaistuneet, vaan klorofyllipitoisuus säilyi noin 65 %:ssa kontrollitasosta, eikä lämpöstressillä ollut vaikutusta karotenoidipitoisuuteen.

Anastatica hierochuntica osoitti myös sietokykyä alhaiselle N-stressille verrattuna Arabidopsikseen (Kuva 3E). Arabidopsis osoitti FW:n asteittaista, jyrkkää vähenemistä, kun NO3- pitoisuuksia vähennettiin ravintoagarissa, ja FW:n väheneminen oli 75 % 0,05 mM NO3-:n kohdalla (Kuva 3F; Täydentävä kuva S3). Sitä vastoin A. hierochuntica osoitti paljon maltillisempaa FW:n laskua, kun NO3- pitoisuuksia vähennettiin, ja FW laski vain 25 prosenttia 0,05 mM NO3-:ssa. Arabidopsiksen taimien erittäin stressaantunut tila alhaisilla NO3- pitoisuuksilla ilmeni asteittain suurempien antosyaanimäärien tuotantona, kun NO3- pitoisuudet laskivat (kuva 3G). Toisaalta A. hierochuntican antosyaanipitoisuudessa ei ollut havaittavissa merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna millään NO3–tasolla.

Koska Negevin autiomaassa on korkean suolapitoisuuden saarekkeita ja A. hierochunticaa tavataan kasvamassa myös Kuolleenmeren laaksossa, testasimme, kestääkö A. hierochuntica suolaista stressiä paremmin kuin Arabidopsis. Arabidopsiksen kasvu väheni suolapitoisuuden kasvaessa paljon enemmän kuin A. hierochunticalla (kuvat 4A-C; täydentävä kuva S4). Esimerkiksi 100 ja 200 mM NaCl:n pitoisuuksissa Arabidopsiksen FW väheni 55 ja 77 prosenttia, kun taas A. hierochuntican FW väheni vain 30 ja 48 prosenttia vastaavissa isosuolapitoisuuksissa (kuva 4A). Vastaavasti A. hierochuntican kuivapainoon vaikutti vähemmän kuin Arabidopsiksen kuivapainoon 100 ja 200 mM NaCl:ssa (kuva 4B). Suolastressi vaikutti myös Arabidopsiksen lehtipinta-alaan suuremmassa määrin kuin A. hierochuntican. Esimerkiksi Arabidopsiksen lehtipinta-ala pieneni 74 prosenttia 200 mM NaCl:ssa, kun taas A. hierochuntican lehtipinta-ala pieneni vain 49 prosenttia (kuva 4C). Lisäksi in vitro -levyjuurten pidentymismäärityksessä Arabidopsis-taimet osoittivat selkeää ja jyrkkää suolan aiheuttamaa annosvasteista vähenemistä juurten suhteellisessa kasvuvauhdissa siten, että 200 mM NaCl:n NaCl:n lämpötilassa juurten pidentyminen oli käytännöllisesti katsoen loppunut (kuva 4D). Toisaalta 100 mM NaCl:llä oli vain lievä vaikutus A. hierochuntican juurten suhteelliseen kasvunopeuteen, kun taas juurten pidentyminen jatkui jopa 200 mM NaCl:lla (Kuva 4E).

A. hierochuntica kontrolloi tiukasti Na+ -kertymistä ja osoittaa fotokemiallisia ominaisuuksia, jotka kestävät suolastressiä

Yksi luonnollisen suolansietokyvyn piirteeksi on todettu kasvien kyky kontrolloida tiukasti Na+ -kertymistä (esim. Kant ym., 2006). Kontrolliolosuhteissa A. hierochunticalla oli versoissa noin 4,5 kertaa enemmän Na+:aa kuin Arabidopsiksella, mikä oli samanlaista kuin E. salsugineumin versojen Na+:n kolminkertainen määrä Arabidopsikseen verrattuna (Kuva 5A; Kant ym., 2006). Molemmat lajit keräsivät kasvavia määriä Na+:aa suolapitoisuuden kasvaessa, mutta Arabidopsis keräsi Na+:aa paljon enemmän kuin A. hierochuntica (kuva 5B). Arabidopsiksen ja A. hierochuntican versojen K+-pitoisuudet olivat vertailukelpoisia kontrolliolosuhteissa ja K+-pitoisuus väheni samalla tavalla suolastressin vaikutuksesta (kuva 5C). Näin ollen kontrolliolosuhteissa A. hierochuntican Na+/K+ -suhde oli korkeampi kuin Arabidopsiksen (kuva 5D), mutta kun maaperän suolapitoisuudet kasvoivat, Na+/K+ -suhde nousi paljon vähemmän A. hierochunticalla (kuvat 5D,E). Molemmilla lajeilla oli samanlaiset FW/DW-suhteet kaikilla suolapitoisuuksilla (kuva 5F), mikä viittaa siihen, että erot ionipitoisuuksissa eivät johtuneet kudosten vesipitoisuuden vaihteluista. Kaiken kaikkiaan ionianalyysitietomme viittaavat siihen, että A. hierochuntica pystyy kontrolloimaan tiukasti Na+:n kertymistä.

Raportoimme hiljattain, että A. hierochunticalla on kontrolliolosuhteissa alhaisempi NPQ, mekanismi ylimääräisen valoenergian hajottamiseksi, kuin Arabidopsiksella ja suhteellisesti korkeampi fotosysteemi II:n elektroninsiirtonopeus (PSII ETR) (Eppel et al., 2014). Tässä tutkimuksessa A. hierochuntican NPQ oli noin 50 prosenttia alhaisempi kuin Arabidopsiksen NPQ kontrolliolosuhteissa (kuva 5G), ja vaikka suolastressi ei vaikuttanut Arabidopsiksen NPQ:hen, se aiheutti vielä 50 prosentin laskun A. hierochuntican NPQ:ssa. Kontrolliolosuhteissa PSII ETR oli noin 55 % korkeampi A. hierochunticassa kuin Arabidopsiksessa (kuva 5H). Suolastressi aiheutti PSII ETR:n laskun molemmissa lajeissa, mutta A. hierochuntican PSII ETR pysyi silti 45 prosenttia korkeampana kuin Arabidopsiksen. Siten NPQ- ja PSII ETR-tiedot viittaavat siihen, että A. hierochuntican fotokemia osoittaa huomattavaa kestävyyttä suolastressiä vastaan.

Arabidopsis, E. salsugineum ja A. hierochuntica Metabolinen uudelleenohjelmointi vasteena suolastressiin

Eutrema salsugineum osoittaa äärimmäistä suolan sietokykyä (Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013), mikä antoi meille mahdollisuuden vertailla kolmea sukulaislajia, jotka ovat peräisin hyvin erilaisista ympäristöistä ja eroavat toisistaan suolan sietokyvyltään: suolan suhteen herkkä glykofyytti Arabidopsis (lauhkean Kolumbian osavaltiossa, MT, USA) ja kaksi extremofyyttiä – kohtalaisen suolan sietokykyinen A. hierochuntica (kuuma, kuiva Negevin autiomaa) ja erittäin sietokykyinen E. salsugineum (kylmät, suolaiset rannikkoalueet Shandongin maakunnassa, Kiinassa).

Arabidopsis-, E. salsugineum- ja A. hierochuntica -kasvit, jotka on kasvatettu maaperässä, altistettiin kasvaville NaCl-pitoisuuksille (E. salsugineumia ei altistettu 50 mM NaCl:lle tämän pitoisuuden lievän vaikutuksen takia; Kazachkova ym, 2013), ja primaaristen hiili- ja typpiaineenvaihduntatuotteiden suhteellinen runsaus määritettiin lehtikudoksesta. Jotta saataisiin kokonaiskuva kasvilajien välisistä ja eri käsittelyjen välisistä eroista, käytettiin PCA:ta. Kahden ensimmäisen pääkomponentin tarkastelu, jotka muodostavat 68 prosenttia aineiston kokonaisvarianssista, mahdollisti näytteiden luokittelun lajeittain ja käsittelyittäin (kuva 6). Ensimmäinen pääkomponentti, joka vastaa 48,2 prosenttia kokonaisvarianssista, erotti selvästi Arabidopsiksen aineenvaihdunnan sen kahdesta extremofyyttisukulaisesta (kuva 6A). Lajien väliseen erotteluun eniten vaikuttavia aineenvaihduntatuotteita (absoluuttisen ominaisvektorin arvon mukaan laskevassa järjestyksessä ja kaksisuuntaisella ANOVA:lla vahvistettuna) olivat raffinoosi, malaatti, galaktinoli, fumaraatti, fosforihappo ja glyseraatti (täydentävät taulukot S1 ja S2). Kaiken kaikkiaan kaksisuuntainen ANOVA-testi kaikille kolmelle lajille osoitti, että 25 aineenvaihduntatuotetta 33:sta erosi merkittävästi lajien välillä (lisätaulukko S2). Näistä 25 aineenvaihduntatuotteesta 22 aineenvaihduntatuotteessa havaittiin myös merkitsevä laji × suola-käsittely -vuorovaikutus.

Toinen pääkomponentti, jonka osuus kokonaisvarianssista oli 19,8 %, erotteli näytteet suolakäsittelyn mukaan. Näytteiden erotteluun eniten vaikuttavia aineenvaihduntatuotteita (absoluuttisen ominaisvektorin arvon alenevassa järjestyksessä ja kaksisuuntaisella ANOVA:lla vahvistettuna) olivat proliini, malaatti, raffinoosi, seriini, fumaraatti ja myo-inositoli. Kaiken kaikkiaan 20 aineenvaihduntatuotteen havaittiin eroavan merkittävästi suolakäsittelyjen välillä (lisätaulukko S2). Kontrolli- ja suolakäsiteltyjen Arabidopsis-näytteiden ryhmät hajaantuivat huomattavasti toiselle komponentille, kun taas E. salsuginem- ja A. hierochuntica -näytteiden ryhmät olivat tiivistyneempiä.

Arabidopsiksen ja näiden kahden extremofyytin aineenvaihduntaprofiilien täydellinen erottuminen toisistaan sekä E. salsuginem- ja A. hierochuntica -näytteiden osittain päällekkäiset aineenvaihdunnalliset vasteet viittasivat siihen, että extremofyytit reagoivat sekä yhteisiin että lajikohtaisiin vasteisiin, joita niillä on suola-stressin vaikutuksesta (Kuva 6A). Tätä käsitystä tuki hierarkkinen klusterointianalyysi (HCA), joka sijoitti molemmat extremofyytit Arabidopsiksesta erilliseen kladiin mutta erotti E. salsugineumin ja A. hierochuntican kahteen alakladiin (kuva 6C). Pelkästään näiden kahden extremofyytin PCA osoitti selvästi lajikohtaisen metabolisen vasteen suolastressiin (kuva 6B). Metaboliitit, jotka vaikuttivat ensisijaisesti extremofyyttien erotteluun (absoluuttisen ominaisvektorin arvon alenevassa järjestyksessä ja vahvistettu kaksisuuntaisella ANOVA-testillä), olivat: proliini, sitraatti, aspartaatti, raffinoosi, treonihappo ja pyroglutamiinihappo (täydentävät taulukot S1 ja S2).

Yksittäisten aineenvaihduntatuotteiden tarkastelu kontrolliolosuhteissa paljasti yleisesti ottaen vertailukelpoisen metabolisen fenotyypin näiden kahden extremofyytin välillä, ja useimmilla aineenvaihduntatuotteilla oli huomattavasti suurempi runsaus A. hierochunticassa ja E. salsugineumissa verrattuna Arabidopsikseen (kuva 7). Arabidopsiksen ja näiden kahden extremofyytin välillä eroavia metaboliitteja kontrolliolosuhteissa olivat muun muassa seuraavat: (i) TCA-syklin välituotteet, sitraatti ja malaatti, jotka olivat merkitsevästi korkeammat extremofyyteissä, ja fumaraatti, joka oli merkitsevästi korkeampi Arabidopsiksessa; (ii) sokerit, glukoosi ja fruktoosi; (iii) heksoosifosfaatit, fruktoosi-6-fosfaatti ja glukoosi-6-fosfaatti; (iv) fosforihappo; (v) hapettumisenestoaineet, askorbaatti ja dehydroaskorbaatti (Foyer ja Noctor, 2011). Kohdissa (ii)-(v) mainittujen aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet olivat kaikki korkeampia extremofyyteissä. Lisäksi osmoprotektantti proliini (Smirnoff ja Cumbes, 1989) oli korkeampi extremofyyttikasveissa kontrolliolosuhteissa, kun taas osmoprotektantit myo-inositoli (myös osmoprotektantin galaktinolin esiaste; Bohnert ym., 2006) ja galaktinoli (myös osmoprotektantin raffinoosin esiaste; Taji ym., 2002; Nishizawa ym., 2008) olivat korkeammat Arabidopsiksessa. Mielenkiintoista oli, että useimpien aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet olivat huomattavasti alhaisemmat A. hierochunticassa kuin E. salsugineumissa.

Metaboliittien pitoisuuksien tarkastelu vasteena suolastressiin paljasti vain muutamia yhteisiä metaboliittien vasteita. Kaikkien kolmen lajin osmoprotektanttien myo-inositolin ja proliinin pitoisuudet kasvoivat suolastressin vaikutuksesta (kuva 8). E. salsugineumilla oli suurempi proliinipitoisuus kuin Arabidopsiksella ja A. hierochunticalla kontrolli- ja 100 mM NaCl:ssa. Korkeat proliinipitoisuudet ovat hyvin tunnettu piirre maaperässä kasvatetulla, hyvin lannoitetulla E. salsugineumilla (Kant et al., 2006; Guevara et al., 2012; Kazachkova et al., 2013). Lisäksi glysiinipitoisuudet vähenivät stressin vaikutuksesta kaikissa kolmessa lajissa, vaikka todellinen glysiinipitoisuus oli korkein Arabidopsiksessa kaikilla käsittelytasoilla verrattuna extremofyytteihin.

Vastakohtana harvoille yhteisille aineenvaihdunnallisille vasteille kolmen lajin välillä, huomattavalla määrällä aineenvaihduntatuotteita oli molemmissa extremofyyteissä yleinen yhteinen vaste, joka erosi Arabidopsiksessa havaitusta. Esimerkiksi aminohapoista alaniinin määrä Arabidopsiksessa vähitellen laski vasteena suolaan, kun taas se pysyi konstitutiivisesti korkeana extremofyyteissä ja jopa nousi hieman A. hierochunticassa 200 mM NaCl:ssa. Aspartaattia oli tuskin havaittavissa Arabidopsiksessa, mutta se kasvoi huomattavasti suolapitoisuuden kasvaessa molemmissa extremofyyttilajeissa, mutta erityisesti E. salsugineumissa. Sitä vastoin treoniinipitoisuudet kasvoivat dramaattisesti Arabidopsiksessa, kun taas ne pysyivät suhteellisen alhaisempina extremofyyteissä, ja A. hierochunticassa ne kasvoivat hieman mutta merkittävästi korkeammilla suolapitoisuuksilla. Seriinin ja glyseraatin, jotka ovat fotorespiraatiokierron välituotteita, kertymisessä oli myös eroja extremofyyttien ja Arabidopsiksen välillä. Seriinipitoisuus kasvoi suolan vaikutuksesta sekä Arabidopsiksessa että A. hierochunticassa, mutta Arabidopsiksessa se kasvoi huomattavasti korkeammaksi korkeimmalla suolapitoisuudella. Toisaalta E. salsugineumissa seriinin määrä väheni vain hieman suolan vaikutuksesta. Kaiken kaikkiaan glyseraattitasot olivat paljon alhaisemmat Arabidopsiksessa kuin extremofyyteissä. Lisäksi kun glyseraatti ei reagoinut suolan vaikutuksesta Arabidopsiksessa, se pysyi jatkuvasti korkeammalla tasolla A. hierochunticassa ja kasvoi suolan vaikutuksesta E. salsugineumissa.

TCA-syklin välituotteiden, sitraatin ja malaatin, tasot olivat huomattavasti korkeammat extremofyyteissä kuin Arabidopsiksessa. Kuitenkin kun E. salsugineumissa sekä sitraatti- että malaattitasot nousivat merkittävästi vasteena suolaan, A. hierochuntica -kasvintuhoojan sitraattitasot nousivat merkittävästi, kun taas malaattitasot pysyivät jatkuvasti korkeammalla tasolla kuin Arabidopsiksessa. Fumaraattipitoisuus oli sitä vastoin huomattavasti korkeampi Arabidopsiksessa, se väheni vasteena suolastressiin, mutta pysyi jatkuvasti alhaisena extremofyyteissä. Muiden karboksyylihappojen, kuten askorbaatin ja dehydroaskorbaatin, pitoisuudet olivat konstitutiivisesti korkeammat extremofyyteissä kuin Arabidopsiksessa.

Eroja havaittiin myös sokeripitoisuuksissa Arabidopsiksen ja extremofyyttien välillä. Silmiinpistävimmät erot olivat osmoprotektanttien galaktinolin ja raffinoosin pitoisuuksissa (Taji ym., 2002; Nishizawa ym., 2008). Molemmat lisääntyivät dramaattisesti Arabidopsiksessa, mutta ne indusoituivat paljon vähäisemmässä määrin extremofyyteissä. Lisäksi fruktoosi-6-fosfaatti ja glukoosi-6-fosfaatti kumuloituivat suuremmassa määrin extremofyyteissä, ja ne pysyivät yleisesti ottaen vakiotasolla A. hierochunticassa, kun taas E. salsugineumissa ne vähenivät merkittävästi suolan vaikutuksesta.

Olimme havaitsevinamme myös lajikohtaisia vasteita, jotka erosivat toisistaan extremofyytien välillä. Esimerkiksi E. salsugineumissa seriinipitoisuus väheni merkittävästi suolastressin vaikutuksesta, kun taas A. hierochunticassa seriinipitoisuus kasvoi merkittävästi. Pyroglutamaatti (mahdollisesti osa glutationin kierrätysreittiä, osmoprotectantti ja Glu-säiliö (Ohkama-Ohtsu ym., 2008; Kumar ja Bachhawat, 2012; Schreiber ym, 2012), fruktoosin ja glyserofosfoglyserolin konstitutiivisesti korkeammat tasot E. salsugineumissa verrattuna A. hierochunticaan.

A. hierochuntica kestää vakavaa oksidatiivista stressiä

Konstitutiivisesti korkeammat antioksidanttiyhdisteiden askorbaatin ja dehydroaskorbaatin tasot A. hierochunticassa. hierochuntica (ja E. salsugineum) Arabidopsikseen verrattuna (kuvat 7 ja 8) viittasivat siihen, että A. hierochunticalla on konstitutiivisesti aktiivinen antioksidanttijärjestelmä. Arabidopsiksen ja A. hierochuntican taimien vasteen vertailu ROS:ia muodostavaan metyyliviologeeniin (MV) (Babbs et al., 1989; Fujii et al., 1990) osoitti, että A. hierochuntican taimet sietivät huomattavan hyvin MV:n lisääntyviä pitoisuuksia verrattuna Arabidopsikseen (kuva 9A). A. hierochuntican versojen FW- ja juurten pidentyminen väheni huomattavasti vähemmän kuin Arabidopsiksen MV-pitoisuuden kasvaessa. Lisäksi A. hierochuntica säilytti kokonaisklorofyllipitoisuudet vasteena äärimmäisille MV-pitoisuuksille (12 μM), kun taas Arabidopsiksessa klorofyllipitoisuudet pienenivät, ja siinä näkyi merkkejä valkaisusta (kuvat 9A-D; lisäkuva S5). Arabidopsiksessa havaitut vakavat stressioireet näkyivät myös antosyaanien suurena kertymisenä MV:n vaikutuksesta, kun taas A. hierochunticassa havaittiin vain alhaisia antosyaanipitoisuuksia (kuva 9E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että A. hierochunticalla on erittäin aktiivinen antioksidanttijärjestelmä.

Keskustelu

Anastatica hierochuntica – Linjan III aavikkokasvi, joka sietää useita abioottisia stressitekijöitä

Rassicaceae-sukuun kuuluu yli 3600 lajia, mukaan lukien monet tärkeät viljelykasvit sekä ensiluokkainen mallikasvijärjestelmä A. thaliana (Franzke et al., 2011; Al-Shehbaz, 2012). Se sisältää 301 sukua, jotka on luokiteltu 49 monofyleettiseen heimoon. Suku voidaan jakaa kahteen pääryhmään: Aethionema-ryhmään ja ydinryhmään (Franzke et al., 2011), joista jälkimmäinen voidaan jakaa kolmeen päälinjaan (linjat I, II ja III).

Viime vuosina Brassicaceae-suvusta on tuotettu useita genomiresursseja, mikä on tarjonnut vaikuttavan alustan evoluutio- ja vertailevan biologian tutkimuksille. Ainakin 36 genomia on sekvensoitu tai sekvensoidaan parhaillaan (Koenig ja Weigel, 2015), mukaan lukien 13 lajia linjasta I (esim. A. thaliana, Arabidopsis lyrata, Capsella rubella), 17 lajia linjasta II tai laajennetusta linjasta II (esim, Arabis alpina, Brassica napus, E. salsugineum, S. parvula) mutta vain kolme lajia linjasta III (Diptychocarpus strictus, Euclidium syriacum, Malcolmia maritima) (Franzke et al., 2011; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015). Lisäksi valmistuneista genomeista yksikään ei ole peräisin linjan III lajeista. Tämä runsas genomikokoelma tarjoaa mahdollisuuden ymmärtää sellaisia ominaisuuksia, kuten kehitys- ja elämänhistorian piirteitä, jotka saattavat puuttua A. thalianasta. Erityisesti Brassicaceae-suvun extremofyytit, jotka viihtyvät eräissä äärimmäisissä ympäristöissä, tarjoavat erinomaisia järjestelmiä, joiden avulla voidaan ymmärtää molekyylimekanismeja, jotka ovat sopeutumisen taustalla ankariin ympäristöihin.

Anastaticeae-heimoon kuuluva extremofyytti A. hierochuntica kuuluu aliedustettuihin III-linjan lajeihin (Couvreur ym. 2010; Kiefer ym. 2014; Huang ym. 2015), joiden fysiologista ja molekulaarista tietämystä on niukasti saatavilla. Lisäksi A. hierochuntica tarjoaa mahdollisuuden vertailla aavikon yksivuotista lajia Brassicaceae-ekstremistofyytteihin, kuten E. salsugineumiin, mikä helpottaa ymmärrystämme siitä, miten kasvit ovat sopeutuneet hyvin erilaisiin äärimmäisiin elinympäristöihin.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että A. hierochuntica sietää useita aavikkoelinympäristöönsä liittyviä stressitekijöitä, nimittäin korkeita lämpötiloja, matalaa maaperän N-pitoisuutta ja suolapitoisuutta (Kuvat 3 ja 4). Sekä kuumuuden sietokyky että alhaisen typpipitoisuuden sietokyky ovat tärkeitä ominaisuuksia, joiden osalta A. hierochuntica saattaa olla uusien sietokykyä määrittävien tekijöiden lähde. Lämpöstressi, erityisesti yhdistettynä kuivuuteen, voi johtaa valtaviin tappioihin kasvintuotannossa (Mittler, 2006; Mittler ja Blumwald, 2010; Lesk et al., 2016) erityisesti siksi, että viljat ovat herkimpiä näille stressille jyvien täyttymisvaiheessa (Barnabas et al., 2008). Tuoreessa raportissa todettiinkin, että vehnän kuumuuden sietokyky lisääntymisvaiheessa on keskeinen ominaisuus satojen kasvattamiseksi ennustetun ilmastonmuutoksen aikana (Stratonovitch ja Semenov, 2015). Vaikka yksityiskohtaisia raportteja äärimmäisen korkeita lämpötiloja sietävistä extremofyyteistä on niukasti, jonkin verran työtä on aloitettu (Emad El-Deen, 2005; Lawson et al., 2014; Yates et al., 2014; Gallas ja Waters, 2015). Erityisesti Rhazya stricta pystyy ylläpitämään täysin toimivaa fotosynteesiä kentällä jopa 43 °C:n lehtilämpötiloissa sekä valon intensiteetillä >1000 μmol fotoneja m-1 s-1 (Lawson et al., 2014).

Typen käytön tehokkuus (NUE) on toinen ominaisuus, joka on ollut paljon tutkimus- ja jalostustyön kohteena (McAllister et al., 2012; Han et al., 2015). Viljelykasvit hyödyntävät vain noin 30-40 prosenttia levitetystä typestä (Raun ja Johnson, 1999), ja loput typestä häviää huuhtoutumisen, denitrifikaation, haihtumisen, maaperän eroosion ja mikrobien kulutuksen kautta, mikä lisää sekä ympäristön typpikuormitusta että tuotantokustannuksia (Good et al., 2004). Koska NUE:n parantamiseen tähtäävä perinteinen jalostus on pysähtynyt, on ehdotettu matalaa N-pitoisuutta sietävien extremofyyttien käyttöä yhtenä lähestymistapana uusien alleelien ja geenien tunnistamiseen (Kant et al., 2011). E. salsugineum sietää paremmin N-rajoitteisia olosuhteita kuin Arabidopsis, ja sen N-pitoisuus, aminohappojen kokonaismäärä ja liukoisen proteiinin kokonaismäärä ovat korkeammat alhaisilla maaperän N-pitoisuuksilla (Kant et al., 2008). E. salsugineumin korkeampi NUE voidaan osittain selittää konstitutiivisesti korkeammalla NO3-ottokyvyllä alhaisissa N-olosuhteissa sekä NO3-assimilaatio- ja kuljettajageenejä koodaavien geenien erilaisella ilmentymisellä.

A. hierochuntica ja E. salsugineum jakavat samanlaiset suolanotto- ja fotosynteettiset ominaisuudet vasteena suolastressiin

Anastatica hierochunticalla oli useita suolan sietoon liittyviä fysiologisia piirteitä, jotka ovat samankaltaisia kuin ne, jotka havaittiin E. salsugineumilla (Inan et al., 2004; Kant et al., 2006). Ensinnäkin kontrolliolosuhteissa A. hierochuntican versojen Na+ -tasot ovat korkeammat kuin Arabidopsiksen (kuva 5). E. salsugineumissa korkeampi verson Na+-pitoisuus auttaa todennäköisesti ylläpitämään konstitutiivisesti negatiivisempaa lehtien osmoottista potentiaalia kuin Arabidopsiksessa (Inan et al., 2004). Toiseksi, suolaolosuhteissa A. hierochuntica kontrolloi tiukasti Na+ -kertymää Arabidopsikseen verrattuna (kuvat 5A-D), mikä on jälleen samanlaista kuin E. salsugineumissa (Kant et al., 2006). Merkittävästi pienempi sisäänpäin suuntautuva Na+ -virta ja pienempi Na+ -tulva E. salsugineumin juuriin verrattuna Arabidopsikseen (Volkov ja Amtmann, 2006; Wang ym., 2006) sekä Na+/H+ -antiportteria koodaavan geenin, SOS1:n, erilainen ilmentyminen (Kant ym., 2006), 2006), vaikuttavat todennäköisesti siihen, että Na+:n ottoa kontrolloidaan tiukasti extremofyytissä.

Kolmanneksi A. hierochuntica osoittaa suurempaa PSII:n elektroninkuljetusta ja alhaisempaa NPQ:ta kuin Arabidopsis kontrolli- ja suolapitoisissa olosuhteissa, mikä viittaa siihen, että A. hierochuntica käyttää suuremman määrän valoenergiaa tuottaviin tarkoituksiin kuin Arabidopsis (Kuvat 5G,H). E. salsugineum pystyy myös ylläpitämään alhaisemman NPQ:n kuin Arabidopsis suolapitoisissa olosuhteissa, kun taas PSII:n elektroninsiirto itse asiassa lisääntyy vasteena suolalle (Stepien ja Johnson, 2009).

A. hierochunticalla on erittäin aktiivinen antioksidanttijärjestelmä

Anastatica hierochunticalla on konstitutiivisesti korkea antioksidanttiyhdisteiden määrä (kuvat 7 ja 8) ja silmiinpistävän suuri sietokyky ROS:ia tuottavaa MV:tä kohtaan (kuva 9), mikä viittaa siihen, että A. hierochunticalla on erittäin aktiivinen antioksidanttijärjestelmä, joka on yhteinen piirre extremofyytille. Esimerkiksi E. salsugineumissa ja S. parvulassa useat ROS-puhdistukseen osallistuvat entsyymit ovat erittäin aktiivisia, ja antioksidanttisten aineenvaihduntatuotteiden, kuten tioredoksiinin, askorbaatin ja dehydroaskorbaatin, pitoisuudet ovat konstitutiivisesti korkeammat kuin Arabidopsiksessa (M’rah ym., 2007; Kazachkova ym., 2013; Uzilday ym., 2014). Antioksidanttikoneiston komponentteja koodaavien E. salsugineum -geenien korkeampi ilmentyminen sekä kontrolli- että suolastressiolosuhteissa saattaa olla korkeampien entsyymiaktiivisuuksien ja antioksidanttitasojen taustalla (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005).

Aktiiviset antioksidanttimekanismit eivät ole tärkeitä vain aavikko- tai halofyyttien kannalta, vaan ne ovat ratkaisevia myös muille ääri-ilmiöille. Esimerkiksi arktisten kasvien, kuten Deschampsia antarctican, on ylläpidettävä fotokemiaa matalien lämpötilojen ja korkean valon yhdistelmässä. D. antarcticalla on konstitutiivisesti korkeampi superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuus verrattuna muihin Poaceae-kasveihin, se ilmentää vetyperoksidille vastustuskykyistä MnSOD-isotsyymiä kylmäaklimaation aikana ja tuottaa useita indusoituvia UV-B-suojayhdisteitä (Xiong ja Day, 2001; Perez-Torres ym., 2004; Ruhland ym., 2005).

Antioksidanttisten mekanismien lisäksi myös energiahäviöprosesseja voidaan käyttää estämään vahingollisten ROS-rasvahappojen syntymistä. Esimerkiksi extremofyyteillä, kuten A. hierochunticalla ja alppikasvilla Ranunculus glacialis, fotorespiraatiolla on merkitystä energian haihduttamisessa (Streb et al., 2005; Eppel et al., 2014). Näin ei kuitenkaan näytä olevan E. salsugineumissa. Pikemminkin plastidien terminaalisen oksidaasin proteiinitasot nousevat stressin välityksellä, mikä voisi toimia vaihtoehtoisena elektroninieluna ja estää ROS:ien syntymisen (Stepien ja Johnson, 2009). Mielenkiintoista on, että PTOX:n määrä R. glacialis -lajin lehdissä on suurempi kuin kaikissa muissa tutkituissa kasvilajeissa, ja jopa silloin, kun elektronivirta assimilaatioon, fotorespiraatioon ja Mehlerin reaktioon estyy, R. glacialis -lajin lehdet pystyvät korkeassa valon intensiteetissä ylläpitämään elektronivirtaa (Streb ym., 2005; Laureau ym., 2005), 2013).

Siten äärimmäisissä elinympäristöissä selviytymisen kannalta erittäin aktiiviset antioksidanttijärjestelmät, jotka usein yhdistyvät ylimääräisen energian haihdutusmekanismeihin, näyttäisivät olevan ratkaisevia äärimmäisissä elinympäristöissä selviytymisen kannalta, kun kyseessä ovat extremofyytit, jotka joutuvat kohtaamaan A. hierochuntican kaltaisten vakavien stressitekijöiden yhdistelmän (korkea valon intensiteetti, korkeat lämpötilat, maaperän heikko ravinnetilanne, suolaiset maaperät).

Erilaisista elinympäristöistä peräisin olevilla ekstremofyyteillä on yhteisiä ja toisistaan poikkeavia metabolisia strategioita suolastressistä selviytymiseksi

Aineenvaihdunnalliset profilointitietomme viittasivat siihen, että ekstremofyyteillä on sekä yhteisiä että lajispesifisiä stressin välittämiä muutoksia aineenvaihdunnassa, jotka eroavat Arabidopsiksesta (kuvat 6-8). Lisäksi PCA-analyysi viittasi siihen, että suolastressin eri tasot aiheuttavat paljon suurempia muutoksia Arabidopsiksessa kuin extremofyyteissä (kuva 6), mikä viittaa siihen, että A. hierochuntica ja E. salsugineum saattavat olla valmiita stressiin, mikä on sopusoinnussa muiden E. salsugineum -lajia koskevien raporttien kanssa (esim. Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013; Vera-Estrella et al., 2014). Lisätukea käsitykselle, jonka mukaan extremofyytit ovat valmiita stressiin, saatiin analysoimalla metaboliittien tasoja kontrolliolosuhteissa (kuva 7). Molemmissa extremofyyteissä havaittiin antioksidanttien, sokerien ja TCA-syklin välituotteiden kertymistä, joiden on aiemmin osoitettu olevan tärkeitä kasvien vasteissa erilaisiin stressitekijöihin, kuten suolaan ja kuivuuteen (Smirnoff, 1996; Urano et al., 2009; Lugan et al., 2010; Obata ja Fernie, 2012). Kaikki extremofyytit eivät kuitenkaan ole valmiita stressiin. Esimerkiksi suolaa sietävässä extremofyyttipalkokasvissa Lotus creticus ei esiinny tällaista ilmiötä (Sanchez ym., 2011).

Erikoisten TCA-syklin välituotteiden runsaudessa havaittiin silmiinpistäviä eroja extremofyyttien ja Arabidopsiksen välillä. Molemmilla extremofyyteillä oli korkeat malaatti- ja sitraattipitoisuudet mutta alhaiset fumaraattipitoisuudet, kun taas Arabidopsiksella oli päinvastainen kuvio (kuvat 7 ja 8). Tämä aineenvaihdunnallinen allekirjoitus näyttää olevan tärkeä piirre extremofyytti Brassicaceae -kasvustoissa kontrolli-, suola- ja matalan N-pitoisuuden olosuhteissa sekä kasvualustoista riippumatta (Kant ym., 2008; Kazachkova ym., 2013). Spekuloimme aiemmin, että malaattialtaan suuri kasvu ja alhaiset fumaraattitasot voisivat heijastaa oksaloasetaatin tuottamista hiilirunkojen tuottamiseksi E salsugineumin tehostettua aminohapposynteesiä varten (Kazachkova et al., 2013). Oksaloasetaatti voidaan edelleen metaboloida aspartaatiksi (Sweetlove et al., 2010), ja havaitsimmekin korkeampia kontrolli- ja suolan aiheuttamia aspartaattipitoisuuksia extremofyyteissä verrattuna Arabidopsikseen. Yksi korkeampien aspartaattipitoisuuksien käyttökohde voisi olla aminoryhmien syöttäminen fotorespiraattikiertoon glysiinin kautta (Novitskaya et al., 2002). Alaniini voi myös tarjota aminoryhmiä glysiinille fotorespiraation aikana (Liepman ja Olsen, 2001; Novitskaya et al., 2002), ja extremofyytit pystyivät ylläpitämään alaniinipitoisuuksia kontrolli- ja suolastressiolosuhteissa, kun taas Arabidopsiksessa alaniinipitoisuus väheni suolaan reagoidessaan. Yhtäpitävästi sen ajatuksen kanssa, että extremofyytit pystyvät ylläpitämään aineenvaihduntavirtaa fotorespiraatiokierron kautta, glysiinin ja seriinin suhde oli aina pienempi extremofyyteissä kuin Arabidopsiksessa. Korkea glysiini-seriinisuhde korreloi usein rubiscon hapettumisen kanssa lyhytaikaisissa vaiheissa fotorespiratoristen olosuhteiden induktion jälkeen (Novitskaya et al., 2002). Lisääntynyt virtaus fotorespiratorisen reitin kautta aiheuttaa kuitenkin glysiini-seriinisuhteen pienenemisen (Timm ym., 2012). Lisätukea suuremmalle fotorespiraatiovirralle extremofyyteissä voidaan saada A. heirochuntican ja E. salsugineumin korkeammista glyseraattitasoista kontrolli- ja suolastressiolosuhteissa verrattuna Arabidopsikseen. Glyseraatti on fotorespiratorisen reitin toiseksi viimeisen reaktion tuote, ja se muunnetaan 3-fosfoglyseraatiksi, joka syötetään takaisin Calvinin sykliin (Hagemann ja Bauwe, 2016). Kuten edellä mainittiin, fotorespiraatiolla on tärkeä rooli ylimääräisen energian hävittämisessä A. hierochunticassa (Eppel et al., 2014).

Toinen syy Arabidopsiksen alhaisiin malaattitasoihin verrattuna extremofyytteihin saattaa johtua siitä, että Arabidopsiksessa fotosynteesi on todennäköisesti voimakkaammin estynyt suolan vaikutuksesta (Stepien ja Johnson, 2009). Tämä voisi johtaa pienempään hiilivirtaan glykolyyttisen reitin kautta ja siten tarpeeseen muuttaa malaatti pyruviitiksi omenahappoentsyymin avulla TCA-kierron toiminnan ylläpitämiseksi (Casati et al., 1999). Toisaalta sekä A. hierochuntica että E. salsugineum osoittavat suhteellisen korkeampaa fotosynteesinopeutta ja alhaisempaa NPQ:ta kuin A. thaliana ja muut kasvilajit kontrolli- ja suolaolosuhteissa sekä erilaisissa hiilidioksidipitoisuuksissa ja valon intensiteeteissä (kuvat 5G,H; Stepien ja Johnson, 2009; Eppel et al., 2014). Itse asiassa glukoosin, fruktoosin, glukoosi-6-fosfaatin ja fruktoosi-6-fosfaatin korkeammat kokonaispitoisuudet extremofyyteissä voivat viitata suurempaan glykolyysivirtaan joko fotosynteesistä tai tärkkelyksen kulutuksesta, mikä voi ylläpitää pyruvaatin pääsyä TCA-kiertoon.

Raffinoosin ja sen esiasteena toimivan galaktinolin ajatellaan toimivan osmoprotektantteina ja antioksidantteina (Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008; Farrant et al., 2009). Havaitsimme galaktinoli- ja raffinoosipitoisuuden suuren nousun Arabidopsiksessa vasteena suolalle, kun taas näiden aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet pysyivät alhaisina extremofyyteissä (kuva 8). On huomionarvoista, että kahdesta hyvin erilaisesta elinympäristöstä peräisin olevat extremofyytit ovat molemmat kehittyneet välttämään suurten raffinoosipitoisuuksien kertymistä stressinsietokomponenttina, joka on samanlainen kuin kuivumista sietävä piikkisammal Selaginella lepidophylla (Yobi et al., 2012). Vaikka on epäselvää, mitä etua raffinoosin kertymättä jättämisestä saadaan, tämä sokeri voidaan metaboloida sakkaroosiksi ja sen jälkeen glukoosiksi ja fruktoosiksi glykolyysiä varten.

Extremofyyteissä havaittu aineenvaihduntatuotteiden lisääntynyt kertyminen on kallista (Munns, 2002), ja se voi osaltaan vaikuttaa E. salsugineumin hitaampaan kasvunopeuteen Arabidopsikseen verrattuna (Lugan et al., 2010). A. hierochuntica, jossa useimpien aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet ja siten myös kustannukset ovat alhaisemmat kuin E. salsugineumissa, itää ja taimettuu kuitenkin nopeasti. On mahdollista, että E. salsugineumin suolainen elinympäristö vaatii jatkuvasti suuria määriä yhteensopivia liuottimia ja antioksidantteja. Sitä vastoin A. hierochuntica altistuu alhaisemmille suolapitoisuustasoille kuin E. salsugineum, mutta kokee voimakasta valonsäteilyä, heikkoa veden ja ravinteiden saatavuutta sekä äärimmäisiä lämpötiloja. Keräämällä erityisiä yhdisteitä, kuten antioksidantteja, ja keräämällä samalla kohtalaisesti muita liuottimia, kuten sokereita ja aminohappoja, A. hierochuntica on saattanut kehittää stressinsietostrategian, jolla on alhaisemmat aineenvaihduntakustannukset ja joka sopii sen erityiseen elinympäristöön, mikä mahdollistaa nopean taimien istuttamisen ja elinkierron nopean loppuunsaattamisen, jotta voidaan välttää kuivuuskausi.

Tekijän panos

Ge, R.S.S.-R.S. ja S.B.B. ideoivat ja suunnittelivat tämän tutkimuksen. GE ja RS suorittivat kaikki kokeet lukuun ottamatta kromosomilukua, klorofyllifluoresenssia ja virtaussytometriaa, jotka suorittivat vastaavasti AK, AE ja AC SB:n, SR:n ja NT-Z:n valvonnassa. GE ja YK suorittivat AF:n valvonnassa aineenvaihdunnan profilointikokeet ja tietojen analysoinnin. TA osallistui hapetusstressikokeisiin. YG valvoi A. hierochuntican kenttäkeräyksiä ja osallistui niihin sekä neuvoi kasvuprotokollien laadinnassa. GE ja SB kirjoittivat artikkelin, ja kaikki kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät käsikirjoituksen.

Rahoitus

Tätä tutkimusta ovat tukeneet Koshland Foundation for Support of Interdisciplinary Research in Combatting Desertification (Koshlandin säätiö aavikoitumisen torjuntaan liittyvän tieteidenvälisen tutkimuksen tukemiseksi), Goldinger Trustin juutalainen tulevaisuusrahasto (Goldinger Trust Jewish Fund for the Future) sekä suunnittelu- ja budjetointikomitean ja Israelin tiedesäätiö (The Israel Science Foundation) I-CORE-ohjelma .

Conflict of Interest Statement

Tekijät ilmoittavat, että tutkimus tehtiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdolliseksi eturistiriidaksi.

Kiitokset

Tekijät kiittävät Noga Sikronia erinomaisesta teknisestä avusta ja Albert Batushanskya tilastollisista neuvoista. Arvostamme professori J. Doleželin ystävällistä lahjoitusta R. sativus -siemenistä. Kiitokset Gilat Hasade Services -laboratoriolle ionipitoisuusmittauksista ja María Fernanda Arroyave Martínezille kuvasta Arabidopsiksen ja A. hierochuntican kasvusta suuremmilla valon intensiteeteillä. Olemme erittäin kiitollisia Anna Amtmannille tämän käsikirjoituksen kriittisestä lukemisesta.

Lisäaineisto

Tämän artikkelin lisäaineisto löytyy verkosta osoitteesta: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01992/full#supplementary-material

Alaviitteet

1. ^http://www.ims.gov.il/IMSENG/All_Tahazit/homepage.htm
2. ^http://rsbweb.nih.gov/ij/