HPV-genotyyppien yhteys ulkoisiin anogenitaalisiin syyliin: poikkileikkaustutkimus

Tutkimusasetelma ja osallistujat

Tutkimus tehtiin poikkileikkaustutkimuksena, jossa käytettiin ei-todennäköistä otosta. Tutkimukseen rekrytoitiin potilaita, jotka kävivät ihotautipoliklinikoilla Farwanian terveyspiirin alueella, peräkkäin marraskuusta 2016 toukokuuhun 2017. Immunokompetentteja potilaita, joilla oli aiempi kliininen diagnoosi ulkoisista anogenitaalisyyteistä, jotka oli suunniteltu kylmähoitoon tai laserhoitoon, pyydettiin allekirjoittamaan suostumuslomake sen jälkeen, kun ihotautilääkäri oli selittänyt suullisesti heidän osallistumistaan. Näytteenottohetkellä syylänäytteet kerättiin universaaliin kuljetusalustaan (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italia) ja säilytettiin – 80 °C:ssa. Eettinen hyväksyntä saatiin terveystieteiden keskuksen eettiseltä komitealta (numero: VDR/EC/2310) ja terveysministeriöltä.

Kustakin potilaasta otettiin demografiset ja kliiniset tiedot, mukaan lukien: ikä (vuotta), sukupuoli (mies, nainen), kansallisuus (kuwaitilainen, ei-kuwaitilainen), syylien lukumäärä (yksi, kahdesta neljään ja vähintään viisi), syylien esiintymisen kesto (< yksi kuukausi, yhdestä kuuteen kuukautta, seitsemästä kahteentoista kuukauteen ja yli kaksitoista kuukautta), kunkin syylän koko (senttimetreinä) (< yksi, yksi, yhdestä kahteen ja enemmän kuin kaksi), kumppaneilla on syyliä (kyllä, ei) ja onko syyliä hoidettu aiemmin (kyllä, ei). Kukaan osallistujista ei saanut HPV-rokotusta, koska HPV-rokotusta ei ole vielä otettu käyttöön Kuwaitissa, vaikka sen käyttöönotosta keskustellaan parhaillaan terveysministeriössä.

DNA:n louhinta ja kontrollit

Vastaanotetut kudosnäytteet säilytettiin – 80 °C:ssa. Saatujen näytteiden suuren määrän vuoksi kaikki potilaskohtaiset syylät jauhettiin yhdessä ja niistä tehtiin yksi DNA-eristys. Kudos jauhettiin steriileillä saksilla ja pihdeillä Petri-maljalla ja noin 25 mg kudosta punnittiin. Kudos pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja siirrettiin 1,5 ml:n Eppendorf-putkiin. Genominen DNA uutettiin kudosnäytteistä QIAmp DNA Mini kitillä (Qiagen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

HPV-tyypin 2, HPV-tyypin 1 ja HPV-tyypin 16 vektoreita (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) käytettiin kontrolleina PCR-kokeissa.

Reaaliaikainen PCR

Reaaliaikaisella PCR-määrityksellä seulottiin genitaalisyylien syyliä sisältävästä HPV:n DNA:sta. Viisi mikrolitraa (5-μl) uutettua DNA:ta yhdistettiin 12,5-μl:aan 2X Syber Green master mixiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), joka sisälsi ROX:n passiivisena referenssinä, ja 10 pmol:aan eteen- ja taaksepäin suuntautuvia alukkeita (10-uM, kuvattu jäljempänä). Kaikki alukesarjat olivat Thermo Fisher Scientificin (Waltham, Massachusetts, Yhdysvallat) mittatilaustyönä syntetisoimia. Seos täytettiin 25 μl:n tilavuuteen nukleaasivapaalla vedellä (Ambion, Austin, TX, USA). Väärien positiivisten tai negatiivisten tulosten määrän vähentämiseksi näytteet analysoitiin kahtena kappaleena 96 optisen kuopan reaktiolevyllä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Jokaiseen monistuserään sisältyi positiivinen ja negatiivinen kontrolli. Näytteiden HPV:n kvantifioimiseksi näytteiden rinnalla tehtiin 5-10-kertainen sarjalaimennus tunnetusta positiivisesta kontrolli-DNA:sta. Reaaliaikainen PCR-monistaminen suoritettiin ABI 7500 -reaaliaikaisessa PCR:ssä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Reaaliaikainen PCR-määritys suoritettiin kolmella eri levyllä. Ensimmäistä levyä käytettiin kohde-DNA:n eheyden määrittämiseen β-globiinin PCR-määrityksellä, jossa monistettiin 268 bp:n suuruinen kohdefragmentti, kuten Lum ja Le Marchand ovat aiemmin kuvanneet vuonna 1998 . β-globiinin alukkeiden nukleotidisekvenssi on seuraava: β-globiinin PCR-alkuaine: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. β-globiinin käänteinen PCR-alkuaine: 5′-AACAGCATCAGGAGGAGTGGACAGAT-3′.PCR-monistaminen aloitettiin 95 °C:ssa kymmenen minuutin ajan ja saatiin päätökseen 45 monistussyklillä (denaturointi 95 °C:ssa 15 sekuntia, hehkutus 55 °C:ssa 45 sekuntia ja pidennys 65 °C:ssa minuutin ajan).

Toisella levyllä seulottiin HPV:n infektio HPV:n L1-ORF:stä peräisin olevien MY11/GP6-alkuaineiden avulla . MY11/GP6-alukkeiden nukleotidisekvenssit ovat seuraavat: ja GP6 käänteisaloitin: 5′- GAAAAATATAAACTGTAAATCATATTC-3′. Monistetun fragmentin odotettu koko on 185-bp. PCR-monistaminen aloitettiin 95 °C:ssa kymmenen minuutin ajan ja saatiin päätökseen 45 monistussyklillä (denaturointi 95 °C:ssa 15 sekuntia, hehkutus 45 °C:ssa 45 sekuntia ja pidennys 65 °C:ssa minuutin ajan).

Kolmannella levyllä seulottiin HPV-infektion esiintyminen HPV L1 ORF:stä peräisin olevilla HVP2/B5-alukkeilla. HVP2/B5-alukkeiden nukleotidisekvenssit ovat seuraavat: B5 käänteisaloitin: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Monistetun fragmentin odotettu koko on 650 bp. PCR-monistaminen aloitettiin 95 °C:ssa kymmenen minuutin ajan ja saatiin päätökseen 45 monistussyklillä (denaturointi 95 °C:ssa 15 sekuntia, hehkutus 50 °C:ssa 45 sekuntia ja pidennys 65 °C:ssa minuutin ajan).

Fluoresenssispektrit rekisteröitiin kunkin PCR-syklin elongaatiovaiheen aikana. ABI 7500:n reaaliaikaisen PCR:n Sequence Detection Software (SDS v1.7) -ohjelmistoa (SDS v1.7) käytettiin kunkin reaktion amplifikaatiokäyrän luomiseen. Kunkin reaktion jälkeen luotiin dissosiaatiokäyrä spesifisten ja epäspesifisten amplikonien erottamiseksi toisistaan. Amplifikaatiokäyrän perusteella analyysiin valittiin kaikki näytteet, joissa HPV:n amplifikaatio alkoi mistä tahansa syklistä sykliin 40 asti (cut-off-viiva 0,2). Ainoastaan näytteitä, joiden dissosiaatiokäyrä oli 70-80 °C:n välillä ja joiden derivaatta-arvo oli 0,100-0,500, pidettiin HPV-DNA-positiivisina.

Sanger-sekvensointi

Syylien HPV-DNA monistettiin ennen sekvensointia pesäkkeellisellä PCR:llä käyttäen AmpliTaq Gold Master Mixiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) Ensimmäisessä PCR:ssä käytettiin HVP2/B5-alukkeita ja toisessa PCR:ssä CN1F/CN1R-, CN2F/CN2R-, CN3F/CN3R- ja C4F/C4R-alukkeita. Ensimmäinen PCR-monistaminen aloitettiin 95 °C:ssa kymmenen minuutin ajan, ja sitä täydennettiin 35 monistussyklillä (denaturointi 95 °C:ssa 15 sekuntia, hehkutus 50 °C:ssa 45 sekuntia ja pidennys 68 °C:ssa minuutin ajan). Toinen PCR-monistus tehtiin käyttäen 3 μl ensimmäistä PCR-tuotetta ja samoja sykliolosuhteita. Odotettavissa olevat laajakirjoiset HPV-genotyypit, jotka voitiin havaita ihosyylissä käyttämällä HVP2/B5- ja CN1F/CN1R-, CN2F/CN2R-, CN3F/CN3R- ja C4F/C4R-alkukkeita, sisältävät HPV-tyyppejä suvuista alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 ja 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 ja 88), mu (HPV 1 ja 63) ja nu (HPV 41) .

PCR-tuotteet puhdistettiin PCR-puhdistussarjalla (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen niille tehtiin Sanger-sekvensointireaktio käyttäen BigDye terminator v3.1 -syklisekvensointisekoitusta (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja edellä kuvattuja pesäkkäisiä PCR-alukkeita. Sekvensoinnin jälkeiset PCR-puhdistukset suoritettiin sitoutumattomien fluoresoivan väriaineen deoksiterminaattoreiden poistamiseksi BigDye XTerminator™ Purification kitillä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Näytteet denaturoitiin 2 minuutin ajan 95 °C:ssa, jäähdytettiin välittömästi jäällä ja ladattiin ABI 3100 Genetic Analyzer -laitteeseen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Näytteet elektroforeerattiin 50 cm:n kapillaarialustalla käyttäen erotteluvälineenä POP 6 -polymeeriä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Näytteet analysoitiin käyttäen Sequencing Analysis -ohjelmistoa v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). HPV-sekvenssien kohdistaminen suoritettiin GenBank-tietokannassa esitettyjen sekvenssien kanssa käyttäen BLASTn-ohjelmistoa (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) ja Los Alamosin kansallisen laboratorion teoreettisen biologian ja biofysiikan HPV-tietokantaa (https://pave.niaid.nih.gov/).

Jos saadut sekvenssit olivat huonolaatuisia PCR-tuotteen alhaisen saannon vuoksi, PCR-tuotteet kloonattiin pGEM-T Easy Vector -vektoriin (Promega, Madison, WI) sen jälkeen, kun ne oli puhdistettu Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System -järjestelmäkitillä (Promega), ja inserttien sekvensointi suoritettiin käyttämällä M13-alkukkeita eteenpäin ja taaksepäin.

Tilastollinen analyysi

Kliinistä diagnoosia, demografisia tietoja ja virologista analyysia koskevat tiedot taulukoitiin ja analysoitiin käyttämällä SPSS-tilasto-ohjelmaa ”Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0” (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Kuvailevat tilastot: frekvenssit/prosentit, keski- ja hajontamitat laskettiin. Keskiarvojen yhdenvertaisuuden testaamiseen käytettiin kahden otoksen t-testiä kaikkien jatkuvien muuttujien osalta, jos ne olivat normaaleja, ja muussa tapauksessa Mann Whitneyn U-testiä. Kolmen ryhmän keskiarvojen vertailuun käytettiin joko varianssianalyysia tai Kruskal-Wallisin testiä riippuen siitä, täyttyvätkö oletukset. Kahden kategorisen muuttujan välisten yhteyksien testaamiseen käytettiin Pearsonin khiin neliö -testiä tai Fisherin tarkkaa testiä, kun oletukset täyttyivät. Binaarisen lopputuloksen mallintamiseksi kovariaattien kanssa käytettiin logistista regressiota ja arvioitiin karkeat ja oikaistut odds-suhteet ja niiden 95 prosentin luottamusvälit. Kaikki testit olivat kaksihaaraisia, ja alle 5 %:n P-arvoa pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.