Hypoxia ja hypoksia-mimeettiset aineet vaikuttavat aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattoriin (Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT/HIF-1β) is Influenced by Hypoxia and Hypoxia-Mimetics

BY admin
|

Abstract

Tausta: Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT, HIF-1β) on basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) -proteiiniperheen jäsen ja elintärkeä transkriptionaalinen säätelijä kehityksen ja fysiologisten sopeutumisprosessien suhteen. ARNT:n on keskusteltu olevan yhteydessä syöpään ja muihin sairauksiin. ARNT:n tiedetään siirtyvän solun tumaan, jossa proteiini kertyy. ARNT on heterodimerisaatiokumppani ksenobioottiligandilla aktivoidulle aryylihiilivetyreseptorille (AhR), Single Minded -proteiineille (SIM), kardiovaskulaariselle helix-loop-helix-tekijälle 1 ja hypoksiaa indusoiville tekijäproteiineille (HIF-α). ARNT on välttämätön HIF-1:n, HIF-2:n ja HIF-3:n sitoutumiselle DNA:han. Hypoksia estää HIF-α-alayksiköiden hajoamisen, mutta ARNT:n katsotaan yleensä ilmentyvän solussa konstitutiivisesti liikaa, ja sen stabiloitumisen ajatellaan yleisesti olevan hapesta riippumatonta. Esitämme kuitenkin todisteita siitä, että ARNT:n säätely on paljon monimutkaisempaa. Tutkimuksemme tavoitteena oli arvioida uudelleen ARNT:n ilmentymisen säätelyä. Menetelmät: Tutkimme eri alkuperää olevia solulinjoja, kuten MCF-7- ja T47D-solulinjoja (ihmisen rintasyöpä), HeLa-solulinjoja (ihmisen kohdunkaulan karsinooma), Hep3B- ja HepG2-solulinjoja (ihmisen hepatooma), Kelly-solulinjoja (ihmisen neuroblastooma), REPC-solulinjoja (ihmisen munuaiset) ja Cos7-solulinjoja (primaariset kädellisten munuaiset). Käytimme immunoblot-analyysiä, densitometriaa, RT-PCR:ää ja ohimenevää transfektiota. Tulokset ja päätelmät: Tuloksemme osoittavat, että hypoksia ja hypoksiaa jäljittelevät aineet, kuten koboltti(II)kloridi (CoCl2) ja dimetyylioksalyyliglysiini (DMOG), vaikuttavat ARNT-proteiinitasoihin solulinjakohtaisesti. Osoitamme, että tämän vaikutuksen saattaa laukaista HIF-1α, jolla on tärkeä rooli ARNT:n vakauttamisessa hypoksiassa.

© 2013 S. Karger AG, Basel

Esittely

Aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattori (ARNT) on basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) -proteiiniperheen jäsen ja ratkaiseva transkriptionaalinen säätelijä organogeneesissä ja hermoston kehityksessä sekä fysiologisissa sopeutumisprosesseissa hypoksiaan ja saasteisiin . ARNT:n (HIF-1β) lisäksi eri lajeissa esiintyy kaksi muuta isomuotoa ARNT2 ja ARNT3 (BMAL1, MOP3, JAP3, ARNTL1). ARNT:n ja ARNT2:n aminohappoidentiteetti on >90 %. ARNT:n ilmentymismalli on yleisempi kuin ARNT2:n aikuiskudoksessa. Viimeaikaisissa tutkimuksissa on raportoitu ARNT:n yhteydestä useisiin solujen toimintahäiriöihin ja sairauksiin, kuten syöpään ja diabetekseen.

Kuten kaikkien bHLH-molekyylien, myös ARNT:n on dimerisoiduttava muodostaakseen aktiivisia DNA:ta sitovia komplekseja. ARNT:n tiedetään muodostavan heterodimeerejä ksenobioottiligandin aktivoiman aryylihiilivetyreseptorin (AhR) kanssa, jonka avulla metaboloituvat entsyymit indusoituvat, HIF-α-alayksiköiden (Hypoxia Inducible Factors) kanssa alhaisen happipitoisuuden vallitessa, SIM-proteiinien (Single Minded) kanssa hermoston kehitystä varten ja CHF1:n (cardiovascular helix-loop-helix factor 1) kanssa . Osoitimme aiemmin, että ARNT translokoituu todennäköisesti ytimeen klassisen ydintuonnin avulla, jota välittävät importiinit α/β . Samanaikaisesta ydinviennistä huolimatta ARNT kertyy pääasiassa ytimeen .

Hypoksiassa hypoksiaa indusoivien tekijöiden (HIF-α) α-alayksiköt stabiloituvat ja muodostavat ARNT:n kanssa heterodimeerejä (HIF-1β), jotka säätelevät solujen vastetta mataliin happipitoisuuksiin. Happiriippuvaisista HIF-α-alayksiköistä on tällä hetkellä tunnistettu kolme erilaista isoformia: HIF-1α, HIF-2α (EPAS1) ja HIF-3α . Normoksisissa olosuhteissa HIF-α-proteiinit hydroksyloidaan prolyyli-hydroksylaasi-domain-entsyymien 1-3 (PHD1-3) toimesta. Prolyylihydroksyloitunut HIF-α toimii tunnistusmotiivina Von Hippel-Lindau -proteiinin (pVHL) polyubikitinaatiolle ja sitä seuraavalle proteasomaaliselle hajoamiselle. ARNT:ltä puuttuu kuitenkin hapesta riippuvainen hajoamisdomeeni (ODDD), ja sen katsotaan ilmentyvän jatkuvasti normoksisissa olosuhteissa. Nykyisen käsityksen mukaan hypoksia ei vaikuta ARNT:n määrään . On kuitenkin olemassa hajanaisia tutkimuksia, joissa on havaittu ARNT-proteiinipitoisuuksien osittain samanaikaista kasvua hypoksiassa . Tässä tutkimuksessa esitetään näyttöä siitä, että ARNT:n ilmentyminen todellakin vaikuttaa ja moduloituu arvioitavasta solutyypistä riippuen. Tämä viittaa siihen, että kasvainsolut saattavat menettää kykynsä säädellä ARNT:tä kasvainten synnyn aikana. Tietomme osoittavat, että ARNT:n ilmentymisen säätely on paljon monimutkaisempaa kuin yleisesti ajatellaan.

Tutkimuksessamme selvitimme ARNT:n ilmentymistä erityyppisen hypoksian, hypoksian mimeettien ja hypoksiaa indusoivien tekijöiden vallitessa paljastaen solulinjakohtaisia ja kofaktorista riippuvaisia ilmentymismalleja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, hypoksian indusointi ja hypoksiamimeettiset aineet

Solulinjat MCF-7 (ihmisen rintarauhaskarsinooma), T47D (ihmisen rintarauhaskarsinooma), Hep3B (ihmisen hepatosellulaarinen karsinooma), HeLa (ihmisen kohdunkaulan adenokarsinooma), HepG2 (ihmisen hepatosellulaarinen karsinooma) ja Cos-7 (kädellisten fibroblastien kaltaiset munuaissolut) inkuboitiin DMEM-viljelyaineessa (Gibco). Solulinjoja REPC (ihmisen primaarinen munuainen, ) ja Kelly (ihmisen neuroblastooma) kasvatettiin RPMI-1640-mediassa (Gibco). Viljelyalustaa täydennettiin 10 %:lla vasikan sikiöseerumia (FCS, Gibco) ja 100 IU/ml penisilliiniä / 100µg/ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin kostutetussa ilmakehässä 37 °C:ssa, 5 % CO2:ssa ja 20,9 % O2:ssa (normoksia). Hypoksisia tutkimuksia varten solut sijoitettiin kostutettuun ilmakehään, jossa oli 37 °C, 5 % CO2, tasapainotettu N2 ja joko 1 % tai 3 % O2. Koboltti(II)-kloridia (CoCl2) käytettiin 50 µM:n laimennoksessa ja dimetyylioksalyyliglysiiniä (DMOG) 1 mM:n laimennoksessa hypoksiamimeettinä.

Transienttinen transfektio

Solulinjat MCF-7, T47D ja Hep3B transfektoitiin siRNA:lla Lipofectamine™ RNAiMAX transfektioreagenssilla (Invitrogen). Solut kasvatettiin 50 %:n konfluenssiin 6-kuoppalevyillä ennen kuin transfektio tehtiin valmistajan protokollan mukaisesti. Ennen hypoksiaa kasvatusalusta vaihdettiin ja soluja inkuboitiin vielä 6 tuntia normoksisissa olosuhteissa.

Immunoblot-analyysi ja tiheysmittaus

Western-blottausta varten solut kerättiin hoidon jälkeen, pestiin jääkylmällä PBS:llä, uutettiin urealyysipuskurilla ja sonikoitiin, jolloin saatiin kokosolulysaatteja. Proteiinipitoisuudet määritettiin käyttämällä Bio-Rad DC Protein Assay -menetelmää valmistajan protokollan mukaisesti. Proteiiniuutteet elektroforeerattiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvoille puolikuivalla elektroblotilla. Kalvot estettiin käyttämällä 5 % rasvatonta maitoa PBS:ssä. Ensisijaisia vasta-aineita (HIF-1α: BD transduction, 1:1000; ARNT: Novus 1:1000) inkuboitiin yön yli, minkä jälkeen lisättiin HRP:tä vastaavat toissijaiset vasta-aineet (DAKO 1:5000) 2 tunniksi. Detektioreagenssina käytettiin ECL:ää (GE Healthcare). Proteiinien määrää verrattiin Aida Image Analyser v.4.27 (Raytest) -ohjelmalla protokollien mukaisesti. Kunkin Western blotin tausta vähennettiin yksittäisestä mittausalueesta. Vastaavaa Lamin A/C-kuormitusta pidettiin 100 %:na ja suhteellinen arvo laskettiin.

RNA:n eristäminen ja RT-PCR

Spesifisten kvantitatiivisten mRNA-tasojen mittaamiseksi soluista eristettiin totaalista RNA:ta ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation -laitteella (Applied Biosystems) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten 0,2 µg RNA:ta käänteistranskriboitiin käyttäen Superscript III:a (Invitrogen). Tuotettua cDNA:ta käytettiin mallina kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa PCR-analyysissä (RT-PCR). RT-PCR suoritettiin käyttäen ABI 7000 Sequence Detection Systemiä (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mixiä (Applied Biosystems) ja KAPA SYBR FAST Universalia (Peqlab). Amplifikaatio suoritettiin TaqMan Gene Expression Assays (Hs01100353_m1, Applied Biosystems) -menetelmällä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Normalisoinnissa käytettiin L28-hallintageenille spesifisiä alukkeita (sense: 5`-ATGGTCGTGCGGGAACTGCT-3` ja reverse: 3`-TTGTAGCGGAAGGAATTGCG-5`). Pyöritysolosuhteet olivat alustava polymeraasin aktivointivaihe 95 °C:ssa 10 minuutin ajan, jota seurasi 45 sykliä 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan, 55 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja 72 °C:ssa 20 sekunnin ajan. Näytteet analysoitiin nelinkertaisina, ja mRNA:n suhteelliset määrät laskettiin ∆∆CT-menetelmällä.

Statistiikka

Statistinen analyysi suoritettiin GraphPad InStat -ohjelmistolla. Käytettiin parittelematonta t-testiä. Kaaviot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta (SD). MTT-eloonjäämismääritykset tehtiin (tietoja ei ole esitetty) sen varmistamiseksi, että solujen eloonjääminen ei eronnut näytteiden välillä.

Tulokset

ARNT-ekspressio indusoituu hypoksiassa MCF-7:ssä, HeLassa, Hep3B- ja REPC-soluissa

Tutkimme ARNT-proteiinipitoisuuksien määrää kasvattamalla MCF-7-soluja normoksisissa (21 % O2) olosuhteissa 24 tuntia, jota seurasi joko 48 tunnin normoksia (Nox) tai 24 tunnin normoksia ja 24 tunnin 1 %:n hypoksia (Hox 1 % 24h, 1 % O2) tai vain 48 tunnin 1 %:n hypoksia (Hox 1 % 48h, 1 % O2). Kokosoluuutteet analysoitiin immunoblottaamalla käyttäen monoklonaalista hiiren anti-ARNT-vasta-ainetta. HIF-1α-proteiini havaittiin hypoksisen soluinduktion vahvistamiseksi. Kuten kuvasta 1 käy ilmi, ARNT-proteiinitasot kohosivat vasteena hypoksiaan MCF-7-soluissa. 24 tunnin 1 %:n hypoksia-inkubointi johti merkittävään ARNT:n lisääntymiseen verrattuna 48 tunnin 1 %:n hypoksiaan.

Kuva 1

Immunoblot-analyysi ARNT-proteiinitasoista MCF-7:ssä. Analysoitiin kokonaisia solulysaatteja (50 µg). Soluja kasvatettiin normoksisissa (21 % O2) olosuhteissa, joita seurasi joko 24 tunnin (Hox1 % 24h) tai 48 tunnin (Hox 1 % 48h) hypoksinen (1 % O2) induktio. ARNT-proteiinitasojen hypoksinen induktio esitetään verrattuna niiden normoksisiin (Nox) kontrolleihin densitometrialla mitattuna. Keskiarvo ± SD; * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001 (kahden hännän P-arvo; n=6-11). Keskiarvot on esitetty prosentteina. Edustava immunoblot on esitetty. HIF-1α-proteiinitasot toimivat hypoksisen induktion kontrollina. Lamin A/C toimii lastauskontrollina.

http://www.karger.com/WebMaterial/ShowPic/173824

MCF-7-soluja inkuboitiin jopa 96 tuntia 1 %:n hypoksiassa hypoksian pitkäaikaisvaikutusten paljastamiseksi. MCF-7-soluissa ARNT-pitoisuus kasvoi 12 tunnin kuluttua. Jatkuvassa hypoksia-altistuksessa ARNT-pitoisuudet alkoivat laskea perusarvoon (kuva 2).

Kuva 2

Aikariippuvainen immunoblot-analyysi ARNT-proteiinista MCF-7-soluissa. Analysoitiin kokonaisia solulysaatteja (50 µg). Soluja viljeltiin hypoksisissa (1 % O2) olosuhteissa 12h, 24h, 48h, 72h ja 96h. Viljelyalusta vaihdettiin päivittäin 1 %:n O2-tasapainotettuun väliaineeseen. ARNT-proteiinitasot mitattiin densitometrialla, ja ne esitetään prosentteina verrattuna 12 tunnin hypoksiaan 1 % (H1% 12h). Lamiini A/C toimii kuormituskontrollina.

http://www.karger.com/WebMaterial/ShowPic/173823

ARNT:n induktio eri intensiteetin hypoksiasta johtuen mitattiin viljelemällä MCF-7-soluja 3 %:n hypoksiassa (3 % O2) ja 1 %:n hypoksiassa (1 % O2) 12 tunnin ja 24 tunnin ajan (Kuva. 3a).

Kuva 3

Kuva 3

Immunoblot-analyysi ARNT-proteiinitasoista MCF-7:ssä, HeLassa, Hep3B:ssä ja REPC:ssä. Analysoitiin kokonaisia solulysaatteja (50 µg). Soluja kasvatettiin hypoksisissa olosuhteissa (3 % O2 tai 1 % O2) 12 tuntia tai 24 tuntia (H3 % 12h, H1 % 12h, H3 % 24h, H1 % 24h). ARNT-proteiinitasot mitattiin densitometrialla, ja ne esitetään prosentteina suhteessa normoksisiin kontrolleihin (Nox). HIF-1α-proteiinitasot toimivat hypoksisen induktion kontrollina. Lamin A/C toimii lastauskontrollina.

http://www.karger.com/WebMaterial/ShowPic/173822

Erojen selvittämiseksi erilaisten solulinjojen välillä viljelimme HeLa-, Hep3B- ja REPC-soluja samalla tavalla kuin MCF-7-soluja (Kuva 3b-d). Kaikissa hypoksiaa käsitellyissä solutyypeissä ARNT-proteiinitasot olivat koholla. 1 prosentin hypoksia johti ARNT-proteiinitasojen nopeampaan nousuun mutta myös nopeampaan normalisoitumiseen kuin 3 prosentin hypoksia. 3 prosentin hypoksia osoittaa ARNT:n maksimaalista induktiota 24 tunnin kuluttua.

Erilaiset solulinjat reagoivat eri tavoin hypoksiaan ja hypoksia-mimeetteihin ARNT-proteiinipitoisuuksien suhteen

ARNT-pitoisuuksien ja HIF-α:n välisen suhteen tutkimiseksi MCF-7-, HeLa-, Cos7-, REPC-, HepG2-, Hep3B- ja Kelly-soluja käsiteltiin hypoksia-mimeeteillä koboltti(II)-kloridilla (CoCl2) ja dimetyylioksyyliglysiinillä (DMOG) (Kuva. 4a-g).

Kuva 4

Kuva 4

Immunoblot-analyysi ARNT-proteiinipitoisuuksista MCF-7:ssä, HeLassa, Cos7:ssä, REPC:ssä, HepG2:ssa, Hep3B:ssä ja Kellyssä. Analysoitiin kokonaisia solulysaatteja (50 µg). Soluja kasvatettiin normoksisissa (21 % O2) olosuhteissa (Nox), hy-poksisissa (3 % O2) olosuhteissa 24 tuntia (Hox 3 % 24h), normoksisissa olosuhteissa, joissa oli 50 µM koboltti(II)-kloridia (CoCl2), ja normoksisissa olosuhteissa, joissa oli 1 mM dimetyylioksalyyliglysiiniä (DMOG). ARNT-proteiinitasojen induktio on esitetty verrattuna niiden normoksisiin (Nox) kontrolleihin densitometrialla mitattuna. Keskiarvo ± SD; * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001 (kahden hännän P-arvo; n = 3 – 7). Keskiarvot esitetään prosentteina. Edustava immunoblot on esitetty. Lamin A/C toimii lastauskontrollina.

http://www.karger.com/WebMaterial/ShowPic/173821

HepG2- ja Kelly-solut eivät reagoineet 24 tunnin hypoksiaan ARNT-proteiinipitoisuuksien nousulla. HeLa-soluissa havaittiin lievää ARNT:n induktiota hypoksiassa ja hypoksia-mimeettisillä aineilla hoidettaessa, mutta tämä vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevä. MCF-7-soluissa näkyi selvästi ARNT-proteiinipitoisuuksien nousu 24 tunnin 3 prosentin hypoksiassa ja ARNT-proteiinipitoisuuksien nousu CoCl2-hoidon seurauksena. Toisaalta DMOG-hoito ei vaikuttanut ARNT-tasoihin MCF-7-soluissa, vaikka DMOG on erittäin voimakas HIF-stabilisaattori. Cos7-soluissa havaittiin voimakas ARNT-induktiovaikutus hypoksiaan sekä hypoksiaa jäljitteleviin CoCl2- ja DMOG-valmisteisiin. REPC-solut osoittivat voimakasta vastetta hypoksiaan, mutta CoCl2:n aiheuttama ARNT:n induktio oli suhteellisen vähäistä. DMOG vähensi ARNT-proteiinitasoja REPC-soluissa. HepG2-solut eivät reagoineet ARNT-proteiinitason induktiolla hypoksiaan eivätkä DMOG:hen. HepG2-solut osoittivat kuitenkin erittäin voimakasta ARNT-induktiota CoCl2:n vaikutuksesta. Hep3B-solut reagoivat ARNT-proteiinitasojen nousulla kaikkiin käsittelyihin. Kelly-solut eivät reagoineet ARNT-proteiinipitoisuuksiin sen enempää hypoksiaan kuin hypoksiamimeetteihinkään.

ARNT:n mRNA-tasojen muutokset eivät korreloi ARNT-proteiinipitoisuuksien kanssa hypoksian ja hypoksiamimeettien vaikutuksesta

Käytimme kvantitatiivista RT-PCR-menetelmää tutkiaksemme mRNA-tasoja, jotka liittyvät havaittuihin ARNT-proteiinipitoisuuksien muutoksiin. MCF-7-, HeLa-, REPC- ja Hep3B-soluja kasvatettiin normoksisissa olosuhteissa ennen 3 %:n hypoksiaa, 1 %:n hypoksiaa, CoCl2- ja DMOG-käsittelyä 24 tunnin ajan (kuva 5). MCF-7-soluissa ARNT:n mRNA-tasot laskivat merkitsemättömästi vasteena hypoksiaan. CoCl2- ja DMOG-käsittelyn aiheuttama ARNT:n mRNA-tasojen merkittävä väheneminen kuitenkin havaittiin. HeLa- ja REPC-soluilla ei ollut vaikutusta ARNT:n mRNA-tasoihin käsittelyjen jälkeen, mutta Hep3B-solut reagoivat hypoksiaan vähentämällä voimakkaasti ARNT:n mRNA:ta. Näissä soluissa havaittiin lievempi vähenevä reaktio CoCl2:een.

Kuva 5

Kvantitatiivinen RT-PCR ARNT:n mRNA-tasoista MCF-7-, HeLa-, REPC- ja Hep3B-soluissa. Soluja kasvatettiin normoksisissa (21 % O2) olosuhteissa, joita seurasi joko 24 tunnin normoksia (Nox), 24 tunnin 3 % hypoksia (Hox 3 % 24h), 24 tunnin 1 % hypoksia (Hox 1 % 24h), 50 µM CoCl2 24 tunnin ajan (CoCl2) tai 1 mM DMOG 24 tunnin ajan (DMOG). L28-hallintageeniä käytettiin normalisointiin. MRNA:n suhteelliset määrät laskettiin ∆∆CT-menetelmällä. Kaaviossa esitetään ARNT:n mRNA-tasojen suhteellisten määrien keskiarvot verrattuna normoksiaan (Nox). Keskiarvo ± SD; * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001 (kahden hännän P-arvo; n = 4).

http://www.karger.com/WebMaterial/ShowPic/173820

ARNT-proteiini stabiloituu HIF-1α:n läsnäollessa

MCF-7-, T47D- ja Hep3B-solut transfektoitiin transienttisesti HIF-1α-siRNA:lla, jotta selvitettäisiin Hif-1α:n vaikutus ARNT-proteiinipitoisuuksiin (kuva 6). Soluja inkuboitiin 48 tuntia normoksiassa transfektioreagenssilla RNAiMAX ja siRNA:lla, minkä jälkeen seurasi 6 tunnin palautumisvaihe. Tämän jälkeen soluja pidettiin 1 prosentin hypoksiassa 24 tuntia. Havaitsimme, että ARNT-proteiinitasot vähenivät hypoksiassa, jos HIF-1α estettiin. Epäspesifinen siRNA-transfektio ei kuitenkaan vaikuttanut havaittuun ARNT-proteiinitasojen nousuun hypoksiassa.

Kuva 6

Immunoblot-analyysi ARNT-proteiinitasoista siRNA:lla käsitellyissä MCF-7-, T47D- ja Hep3B-yksiköissä. Analysoitiin kokonaisia solulysaatteja (50 µg). Soluja kasvatettiin normoksisissa (21 % O2) olosuhteissa ja transfektoitiin transientisti käyttäen Lipofectamine™ RNAiMAX -transfektioreagenssia (Invitrogen) ja HIF-1α siRNA:ta (Hox1% 24h siRNA HIF-1a) tai BlockIt™ (Invitrogen) siRNA:ta (Hox1% 24h siRNA BlockIt) negatiivisena kontrollina HIF-1α-spesifistä knock downia varten. ARNT-proteiinitasot mitattiin densitometrialla, ja ne esitetään prosentteina. HIF-1α-proteiinitasot toimivat hypoksisen induktion ja Hif-1α knock downin kontrollina. Lamin A/C toimii lastauskontrollina. (n=4).

http://www.karger.com/WebMaterial/ShowPic/173819

Keskustelu

Aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattorilla (ARNT/HIF-1β) on keskeinen rooli transkriptionaalisena säätelijänä solujen homeostaasissa. Se toimii useiden tärkeiden säätelijäproteiinien, kuten HIF-α:n, SIM-proteiinien, AhR:n ja CHF1:n heterodimerisaatiokumppanina. Siksi se on mukana monissa erilaisissa solun säätelyreiteissä. Koska ARNT:n uskotaan ilmentyvän konstitutiivisesti eivätkä fysiologiset tai farmakologiset muutokset, esimerkiksi hypoksia, vaikuta siihen, ARNT:tä ei aiemmissa raporteissa pidetty rajoittavana tekijänä ja mahdollisena terapeuttisena kohteena . Viimeaikaisissa tutkimuksissa on kuitenkin raportoitu ARNT:n ja useiden sairauksien, kuten syövän, välisestä yhteydestä . HIF-1α:lla ja HIF-2α:lla tiedetään olevan ratkaisevia tehtäviä syövän kehityksessä ja/tai hoidossa . Koska ARNT on niiden pakollinen kofaktori, ARNT:n puute johtaisi HIF-α-kompleksien inaktiivisuuteen tai alentuneeseen tasoon. Korostaaksemme edelleen ARNT:n merkitystä osoitamme ensimmäistä kertaa, että hypoksialla, hypoksiamimeeteillä ja HIF-1α:lla on tärkeä rooli ARNT:n ilmentymisen säätelymekanismeissa arvioitavasta solutyypistä riippuen.

Tutkimme kahta eri isäntälajia edustavia kahdeksaa erilaista solulinjaa osoittaaksemme hypoksian ja hypoksiamimeettien vaikutuksen ARNT-proteiinin ilmentymiseen. MCF-7-rintasyöpäsolut reagoivat hypoksiaan ARNT-proteiinitasojen nousulla, kun taas ARNT:n mRNA-tasot näyttävät laskevan tai pysyvän ennallaan. Tämä viittaa siihen, että proteiinin stabiloinnin ja de novo -synteesin välillä on vastavuoroinen palautesäätely. Samanlainen geenien transkription alas- ja ylössääntely hypoksiassa tunnetaan useiden entsyymien ja molekyylien osalta. Havaintomme eivät välttämättä johdu mRNA-synteesin yleisestä vähenemisestä solussa vastauksena solustressiin, koska ESR2-geenin transkriptio indusoituu hypoksiassa ja HIF-1α:n knock-downissa (julkaisemattomat tiedot).

Hypoksialle altistuminen pidemmäksi ajaksi kuin 48 tunniksi johtaa paluuseen ARNT-proteiinien perustasolle, joka on havaittavissa normoksiassa. Samanlainen ilmentymishuippu tunnetaan HIF-1α-proteiinin osalta 4-12 tunnin kuluttua hypoksisessa hoidossa. Jatkuva hypoksinen inkubaatio johtaa HIF-1α-tasojen laskuun, kunnes saavutetaan vakaa tila . Tämä seikka voisi viitata HIF-1α:n yliekspression vakauttavaan vaikutukseen ARNT:n suhteen. HIF-1α/ARNT-kompleksien muodostuminen ytimessä voisi estää ARNT:n hajoamisen proteasomien kautta, mikä on linjassa Choin ym. ja Mandlin ym. kanssa. Tutkiaksemme havaintojamme pudotimme HIF-1α:ta ohimenevästi MCF-7-soluissa ja havaitsimme ARNT-proteiinipitoisuuksien vähenevän jopa 90 prosenttia hypoksiassa verrattuna normoksiaan. Tämä vaikutus voitiin havaita myös T47D- ja Hep3B-soluissa. SiRNA:n ja geenisekvenssien in silico -analyysi sulki pois sen, että HIF-1α-siRNA:n ristikkäisreaktio, joka tyrmäisi ARNT:n ARNT:n, koska ARNT:n ja HIF-α:n sekvenssit ovat vahvasti samankaltaisia, ei ollut mahdollista. Nämä havainnot viittaavat vahvaan korrelaatioon ARNT:n ja HIF-1α-proteiinin ilmentymisen välillä. Selityksenä voisi olla O2:sta riippumattomien ARNT:n sitoutumiskumppaneiden, kuten AhR:n, SIM:n ja CHF1:n, vakauttava vaikutus ARNT:hen normoksiassa. Hypoksiassa AhR:n, SIM:n ja CHF1:n vähentyneet tasot voitaisiin kompensoida HIF-α:n yliekspressiolla ARNT:n stabiloinnin osalta. HIF-1α:n vähentäminen voisi siis johtaa ARNT-tasojen voimakkaaseen laskuun vähentyneen de novo -synteesin ja heikentyneen ubikvitinaation ja proteasomaalisen hajoamisen stabiilisuuden vuoksi, koska dimerisaatiokumppanit puuttuvat. Tämä hypoteesi korostaisi ARNT:n säätelyä, joka riippuu suuresti sitoutumiskumppaneista, mikä olisi linjassa Choin ym. ja Mandlin ym. kanssa. Tutkiaksemme, johtaako HIF-α-induktio samanaikaisesti ARNT:n ilmentymisen lisääntymiseen, käsittelimme soluja CoCl2:lla ja DMOG:lla. Huolimatta siitä, että CoCl2:n ja DMOG:n HIF-α:ta stabiloiva vaikutus on analoginen, MCF-7-solut reagoivat DMOG:n jälkeen vähemmän voimakkaasti ARNT-proteiinin lisääntymisellä kuin CoCl2-hoidon jälkeen. Nämä havainnot ovat linjassa ARNT:hen kohdistuvan HIF-α:ta stabiloivan vaikutuksen kanssa. HepG2-soluissa voitiin havaita päinvastainen käyttäytyminen CoCl2:n indusoiman ARNT:n välillä toisin kuin DMOG:n. Mielenkiintoista on, että REPC-solut reagoivat ARNT-tasojen laskulla DMOG-hoidon yhteydessä. Vaikka DMOG:n HIF-α:ta stabiloiva vaikutus on samanlainen kuin CoCl2:lla, DMOG:n erilainen solureaktio ei ole epätavallista erilaisen vaikutustavan vuoksi. Toisaalta Cos7- ja Hep3B-solut reagoivat hypoksiaan ja molempiin hypoksiaa jäljitteleviin aineisiin ARNT-proteiinipitoisuuksien voimakkaalla nousulla, mikä vastaa Mandlin ym. postuloimaa HIF-α:ta stabiloivaa vaikutusta. Se, että toisin kuin useissa kasvainsolulinjoissa hypoksia ja hypoksia-mimeettiset aineet vaikuttavat hyvin ARNT:n pitoisuuksiin primaarisessa Cos7-solulinjassa, saattaa viitata siihen, että ARNT:n funktio katoaa kasvainten synnyn aikana tietyissä kasvaimissa. Tietoa ARNT:stä solusyövän kehityksessä on niukasti, ja siksi tarvitaan lisätutkimuksia.

Hep3B-solulinjassa ARNT-proteiinipitoisuudet nousevat merkittävästi kaikkien kolmen hypoksiakäsittelyn seurauksena, kun taas hypoksia ja CoCl2 vähentävät ARNT-mRNA:ta merkittävästi. Nämä havainnot tukevat hypoteesia vastavuoroisesta palautemekanismista, jota voidaan hypoteesata myös MCF-7-soluissa. REPC-munuaissolulinja osoittaa poikkeavaa käyttäytymistä. Nämä solut reagoivat ARNT-proteiinin voimakkaalla lisääntymisellä hypoksiaan, mutta vähemmän voimakkaalla induktiolla CoCl2:n vaikutuksesta, ja toisin kuin edellä käsiteltiin, ARNT-proteiinitasot laskevat DMOG-käsittelyssä. REPC-soluissa ei kuitenkaan näy ARNT:n mRNA-tasojen vaihtelua eri käsittelyissä, mikä viittaa proteiiniperusteiseen säätelyyn.

Kelly-soluissa ARNT-proteiinitasot ovat vakaita. Hypoksia tai hypoksiaa jäljittelevät aineet eivät pysty vaikuttamaan ARNT:hen. Tällaisia vakaita ARNT-tasoja voidaan havaita myös HepG2-soluissa hypoksia- ja DMOG-käsittelyssä, mutta tämä solulinja reagoi voimakkaalla ARNT-proteiinin nousulla CoCl2-käsittelyssä. HeLa-soluissa ARNT-tasot eivät muutu merkittävästi sen enempää proteiinin kuin mRNA:nkaan osalta. Nämä havainnot tukevat nykyistä näkemystä, jonka mukaan ARNT ilmentyy jatkuvasti eikä hypoksia vaikuta siihen, kuten Semenza on todennut. Me ja muut olemme osoittaneet, että tätä näkemystä ei voida yleistää. Esitämme täten tietoja, jotka ovat ristiriidassa hypoteesin kanssa jatkuvasti ilmentyvästä ja sääntelemättömästä ARNT:n heterodimerisaatiokumppanista, mutta jotka ovat samansuuntaisia kuin Chilovin ja muiden, . Myös Choi et al. ja Mandl et al. tukevat, osoitamme, että heterodimerisaatio HIF-α:n kanssa on tärkeä mekanismi ARNT-proteiinin stabiloimiseksi hypoksiassa .

Johtopäätöksenä tietomme viittaavat ARNT:n sitoutumiskumppaneiden, kuten HIF-α:n, AhR:n, SIM:n ja CHF1:n, yleiseen stabiloivaan säätelyyn ARNT:n ilmentymisen suhteen. Lisäksi voimme osoittaa, että kukin solulinja / solutyyppi reagoi selvästi hypoksiaan ja hypoksiaa jäljitteleviin aineisiin ARNT-proteiinisynteesin induktion osalta. Näin ollen ARNT-proteiinin ilmentymisen yleispätevä solurajat ylittävä ennustaminen ei ole sallittua. Nämä havainnot osoittavat, että ARNT:n säätelyä olisi tutkittava edelleen, erityisesti kasvainten synnyn osalta, koska ARNT:n säätely on paljon monimutkaisempaa kuin nykyisin arvioidaan.

Kiitokset

Olemme kiitollisia T. Svenssonille, B. Rudzewskille ja A.-K. Hellbergille erinomaisesta teknisestä tuesta. Kirjoittajat ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

  1. Kewley RJ, Whitelaw ML, Chapman-Smith A: The mammalian basic helix-loop-helix/PAS family of transcriptional regulators. Int J Biochem Cell Biol 2004;36:189-204.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  2. Shimoda LA, Semenza GL: HIF and the lung: role of hypoxia-inducible factors in pulmonary development and disease. Am J Respir Crit Care Med 2011;183:152-156.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  3. Nakabayashi H, Ohta Y, Yamamoto M, Susuki Y, Taguchi A, Tanabe K, Kondo M, Hatanaka M, Nagao Y, Tanizawa Y: Kello-ohjattu lähtögeeni Dbp on Arnt/Hif-1β-geenin ilmentymisen säätelijä haiman saarekkeen β-soluissa. Biochem Biophys Res Commun 2013;434:370-375.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  4. Labrecque MP, Prefontaine GG, Beischlag TV: Aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattoriproteiiniperhe (ARNT): Transkription modifioijat, joilla on monitoimiset proteiiniliitännät. Curr Mol Med 2013;13:1047-1065.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  5. Liang Y, Li W-W-W, Yang B-W, Tao Z-H, Sun H-C, Wang L, Xia JL, Qin LX, Tang ZY, Fan J, Wu WZ: Aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattori liittyy kasvaimen kasvuun ja hepatosellulaarisen karsinooman etenemiseen. Int J Cancer 2012;130:1745-1754.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  6. Shi S, Yoon DY, Hodge-Bell K, Huerta-Yepez S, Hankinson O: Aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattorin (hypoxia indusoituva tekijä 1beta) aktiivisuutta tarvitaan enemmän varhaisen kuin myöhäisen kasvainkasvun aikana. Mol Carcinog 2010;49:157-165.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  7. Chin MT, Maemura K, Fukumoto S, Jain MK, Layne MD, Watanabe M, Hsieh CM, Lee ME: Cardiovascular basic helix loop helix factor 1, uusi transkriptionaalinen repressori, joka ilmentyy ensisijaisesti kehittyvässä ja aikuisessa sydän- ja verisuonijärjestelmässä. J Biol Chem 2000;275:6381-6387.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  8. Depping R, Steinhoff A, Schindler SG, Friedrich B, Fagerlund R, Metzen E, Hartmann E, Köhler M: Hypoksia-indusoituvien tekijöiden (HIF) ydintranslokaatio: klassisen importin alfa/beta -reitin osallistuminen. Biochim Biophys Acta 2008;1783:394-404.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  9. Berchner-Pfannschmidt U, Frede S, Wotzlaw C, Fandrey J: Hypoksia-indusoituvan tekijän reitin kuvantaminen: oivalluksia hapen aistimisesta. Eur Respir J 2008;32:210-217.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  10. Lisy K, Peet DJ: Turn me on: regulating HIF transcriptional activity. Cell death Differ 2008;15:642-649.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  11. Semenza GL: Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell 2012;148:399-408.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  12. Kallio PJ, Pongratz I, Gradin K, McGuire J, Poellinger L: Hypoksia-indusoituvan tekijä 1alfa:n aktivoituminen: transkription jälkeinen säätely ja konformaatiomuutos Arnt-transkriptiotekijän rekrytoinnin avulla. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:5667-5672.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  13. Huang LE, Gu J, Schau M, Bunn HF: Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:7987-7992.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  14. Kaelin WG: Proline hydroxylation and gene expression. Annu Rev Biochem 2005;74:115-128.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  15. Wang GL, Jiang BH, Rue EA, Semenza GL: Hypoxia-induktiivinen faktori 1 on basic-helix-loop-helix-PAS heterodimeeri, jota säätelevät solujen O2-jännitykset. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:5510-5514.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  16. Iyer N V, Kotch LE, Agani F, Leung SW, Laughner E, Wenger RH, Gassmann M, Gearhart JD, Lawler AM, Yu AY, Semenza GL: O2-homeostaasin solu- ja kehitysohjaus hypoksia-indusoituvan tekijän 1 alfan avulla. Genes Dev 1998;12:149-162.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  17. Chilov D, Camenisch G, Kvietikova I, Ziegler U, Gassmann M, Wenger RH: Hypoksia-indusoituvan tekijä-1:n (HIF-1) induktio ja ydintranslokaatio: heterodimerisaatio ARNT:n kanssa ei ole välttämätöntä HIF-1alfa:n ydinkertymiselle. J Cell Sci 1999;112:1203-1212.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)

  18. Frede S, Freitag P, Geuting L, Konietzny R, Fandrey J: Erytropoietiinigeenin hapen säätelemä ilmentyminen ihmisen munuaissolulinjassa REPC. Blood 2011;117:4905-4914.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  19. Gu YZ, Hogenesch JB, Bradfield CA: PAS-superperhe: Ympäristö- ja kehityssignaalien sensorit. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2000;40:519-561.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  20. Choi H, Chun Y-S, Kim S-W, Kim M-S, Park J-W: Curcumin inhibits hypoxia-induktiivinen faktori-1 hajottamalla aryylihiilivetyreseptorin ydintranslokaattoria: kasvaimen kasvun estomekanismi. Mol Pharmacol 2006;70:1664-1671.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  21. Rankin EB, Giaccia AJ: The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis. Cell Death Differ 2008;15:678-685.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  22. Wenger RH, Rolfs A, Marti HH, Bauer C, Gassmann M: Hypoxia, uudenlainen akuutin faasin geenien ilmentymisen indusoija ihmisen hepatoomasolulinjassa. J Biol Chem 1995;270:27865-27870.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

  23. Mandl M, Kapeller B, Lieber R, Macfelda K: Hypoxia-induktiivinen tekijä-1β (HIF-1β) on HIF-1α-riippuvaisesti ylössäätynyt ihmisen melanoomasoluissa 518A2 hypoksisissa olosuhteissa. Biochem Biophys Res Commun 2013;434:166-172.
    Ulkoiset lähteet

    • Pubmed/Medline (NLM)
    • Crossref (DOI)

Tekijän yhteystiedot

Dr. rer. nat. Reinhard Depping

Universität zu Lübeck, Institut für Physiologie, Zentrum für Medizinische Struktur

und Zellbiologie, Ratzeburger Allee 160, D-23562 Lübeck (Saksa)

Tel. +49 451 5004712, Fax +49 451 5004171, E-Mail [email protected]

Artikkelin / julkaisun tiedot

Ensimmäisen sivun esikatselu

Originaalin tiivistelmä

Accepted: Elokuu 30, 2013
Julkaistu verkossa: Syyskuu 20, 2013
Julkaisun ilmestymispäivä: Marraskuu 2013

Tulostettujen sivujen määrä: 0
Taulukoiden lukumäärä: 0

ISSN: 1015-8987 (painettu)
eISSN: 1421-9778 (verkkojulkaisu)

Lisätietoa: https://www.karger.com/CPB

Open Access License / Drug Dosage / Disclaimer

Open Access License: Tämä on Open Access -artikkeli, joka on lisensoitu Creative Commons Attribution-NonCommercial 3.0 Unported -lisenssin (CC BY-NC) ehdoilla (www.karger.com/OA-license), joka koskee vain artikkelin verkkoversiota. Jakelu sallittu vain ei-kaupallisiin tarkoituksiin.
Lääkkeen annostus: Kirjoittajat ja kustantaja ovat pyrkineet kaikin tavoin varmistamaan, että tässä tekstissä esitetyt lääkevalinnat ja annostukset vastaavat julkaisuhetkellä voimassa olevia suosituksia ja käytäntöjä. Jatkuvan tutkimuksen, viranomaismääräysten muutosten sekä lääkehoitoon ja lääkevaikutuksiin liittyvän jatkuvan tiedonkulun vuoksi lukijaa kehotetaan kuitenkin tarkistamaan kunkin lääkkeen pakkausselosteesta mahdolliset muutokset käyttöaiheissa ja annostelussa sekä lisätyt varoitukset ja varotoimet. Tämä on erityisen tärkeää silloin, kun suositeltu lääke on uusi ja/tai harvoin käytetty lääke.
Vastuuvapauslauseke: Tämän julkaisun sisältämät lausunnot, mielipiteet ja tiedot ovat yksinomaan yksittäisten kirjoittajien ja kirjoittajina olleiden henkilöiden eivätkä kustantajien ja päätoimittajan (päätoimittajien) omia. Mainosten ja/tai tuoteviittausten esiintyminen julkaisussa ei ole takuu, suositus tai hyväksyntä mainostetuille tuotteille tai palveluille tai niiden tehokkuudelle, laadulle tai turvallisuudelle. Julkaisija ja päätoimittaja(t) eivät ole vastuussa mistään henkilö- tai omaisuusvahingoista, jotka johtuvat sisällössä tai mainoksissa viitatuista ideoista, menetelmistä, ohjeista tai tuotteista.