Integrative genomic analyses of APOBEC-mutational signature, expression and germline deletion of APOBEC3 genes, and immunogenicity in multiple cancer types

Distinct patterns of the APOBEC3 genes, liittyvät APOBEC-mutaatiosignatuuriin useissa eri syöpätyypeissä

Seurauksena aiempaan APOBEC-mutaatiosignatuurin analyysiin mittasimme mutaatiot käyttäen niiden deaminaasi C:n mutaatioiden lukumäärää, jotka sijaitsivat TCW-trinukleotidimotiivin sisällä T- tai G-mutaatioiden muuttuessa T- tai G-mutaatioiksi kutakin näytettä kohti 10 syöpätyypissä (ks. menetelmät). Teimme univariaattisia analyysejä arvioidaksemme APOBEC-mutaatioiden allekirjoituksen assosiaatioita APOBEC3A:n ja APOBEC3B:n yleisten geeniekspressiotasojen kanssa. Havaitsimme, että APOBEC3A:n ilmentymistaso oli positiivisesti yhteydessä APOBEC-mutaatiosignatuuriin yhteensä kuudessa syöpätyypissä – virtsarakkosyövässä, rintasyövässä, kohdunkaulan syövässä, keuhkojen adenokarsinoomassa, pään ja kaulan alueen syövässä sekä kilpirauhassyövässä. Muissa syöpätyypeissä ei havaittu merkitseviä assosiaatioita, vaikkakin samansuuntaisia assosiaatioita havaittiin (lisätiedosto 1: taulukko S1). Mielenkiintoista oli, että havaitsimme APOBEC3B:n ilmentymistason olevan positiivisesti yhteydessä APOBEC-mutaatiosignatuuriin kaikissa syöpätyypeissä, lukuun ottamatta keuhkojen levyepiteelikarsinoomaa (lisätiedosto 1: taulukko S1). APOBEC3A:n assosiaatioihin verrattuna APOBEC3B oli erityisesti yhteydessä APOBEC-mutaatioiden allekirjoitukseen maha-, haima- ja munuaissyövissä, P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3 ja P = 1,1 × 10- 4, vastaavasti (lisätiedosto 1: taulukko S1). Nämä havainnot olivat linjassa aiempien tutkimusten kanssa. Lisäksi arvioimme myös APOBEC-mutaatiosignatuurin assosiaatioita muiden APOBEC3-geenien geeniekspression kanssa: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G ja APOBEC3H. Tuloksemme osoittivat, että näiden geenien ilmentymät liittyivät APOBEC-mutaatioiden allekirjoitukseen ja vaihtelivat eri syöpätyypeissä (lisätiedosto 1: taulukko S2). Esimerkiksi APOBEC3C:n ilmentyminen liittyi lisääntyneeseen APOBEC-mutaatiosignatuuriin kohdunkaulan ja pään ja kaulan syövissä, kun taas sen ilmentyminen liittyi vähentyneeseen APOBEC-mutaatiosignatuuriin mahasyövässä. Tuloksemme osoittivat myös, että APOBEC3D:n, APOBEC3F:n ja APOBEC3G:n ilmentyminen liittyi lisääntyneeseen APOBEC-mutaatioiden allekirjoitukseen, kun taas APOBEC3G:n assosioinnin tulos oli linjassa aikaisempien havaintojen kanssa . Mielenkiintoista oli, että havaitsimme, että APOBEC3H:n ilmentyminen liittyi lisääntyneeseen APOBEC-mutaatio-allekirjoitukseen kohdunkaulan syövässä, mutta sitä ei havaittu rintasyövässä.

ApobEC3A:n ja APOBEC3B:n isomuotojen erilaiset mallit, jotka liittyivät APOBEC-mutaatio-allekirjoitukseen useissa eri syöpätyypeissä

Arvioimme edelleen APOBEC-mutaatio-allekirjoitusten ja APOBEC3A:lla ja APOBEC3B:llä transkriboitujen isomuotoisten muunnosmuotojen ilmentymistasojen yhdistyksiä. Analysoitiin yhteensä kuusi isoformia, mukaan lukien APOBEC3A:sta transkriboidut uc003awn ja uc011aob, APOBEC3B:stä transkriboidut uc003awo, uc003awp ja uc003awq sekä toinen isoformi, uc011aoc, joka on peräisin fuusiotapahtumasta, joka liittyy alueeseen, joka kattaa APOBEC3A:n viimeisen intronin APOBEC3B:n viimeiseen eksoniin (kuvat 1a, b). Vahvistimme, että isomuodot uc003awn ja uc003awo transkriboituvat ensisijaisesti APOBEC3A:sta ja APOBEC3B:stä (lisätiedosto 1: kuva S1) . Odotetusti sekä uc003awn- ja uc003awo-ekspressiotasojen että APOBEC-mutaatiosignatuurin assosiaatiosuunta oli yhdenmukainen kaikkien syöpätyyppien yleisten geeniekspressiotasojen havaintojen kanssa (Kuva 1c, d; Lisätiedosto 1: Taulukko S3). Yllättäen uc011aoc:n (APOBEC3A/B) ilmentymistaso oli positiivisesti yhteydessä APOBEC-mutaatiosignatuuriin vain rintasyövässä (P = 5,0 × 10- 10) (kuva 1e; lisätiedosto 1: taulukko S3). Muilla isomuodoilla ei kuitenkaan havaittu assosiaatioita missään syöpätyypissä, lukuun ottamatta uc011aob:n (APOBEC3A) heikkoa assosiaatioita pään ja kaulan alueen syövän kanssa (P = 0,02; lisätiedosto 1: taulukko S3).

Käytettäessä moninkertaisia regressioanalyysejä, jotka sisälsivät kaikki APOBEC3A:n ja APOBEC3B:n isomuodot, havaitsimme, että uc003awn (APOBEC3A) ja uc003awo (APOBEC3B) ilmentymistasot liittyivät itsenäisesti ja yleisesti arvioituun APOBEC-mutaatiosignatuuriin useissa syöpätyypeissä: (marginaalinen yhteys uc003awnin osalta), rinnan, kohdunkaulan, keuhkojen adenokarsinooman sekä pään ja kaulan alueella (taulukko 1). Samoin uc011awnin (APOBEC3A) osalta havaittiin lisäassosiaatio kilpirauhassyövässä, kun taas uc003awo:n (APOBEC3B) osalta havaittiin assosiaatioita maha-, haima- ja munuaissyövässä. Yhdenmukaisesti yksimuuttuja-analyysin kanssa rintasyövässä havaittiin silmiinpistävä assosiaatio uc011aoc:n (APOBEC3A/B) ja APOBEC-mutaatiosignatuurin välillä (P = 5,3 × 10- 11), ja lisäassosiaatio havaittiin myös keuhkojen adenokarsinoomassa (P = 0,01) (taulukko 1). Nämä havainnot viittaavat siihen, että uc011aoc:lla on kudosspesifinen rooli, joka vaikuttaa APOBEC-mutaatiosignatuuriin ensisijaisesti rintasyövässä, kun taas uc003awn:lla ja uc003awo:lla on ubiikki, mutta erillinen rooli koko ihmissyövän spektrissä. Erityisesti lisäanalyysimme osoitti positiivisen ekspressiokorrelaation uc011aoc-isoformin ja APOBEC3A:n välillä suuressa osassa syöpätyyppejä, erityisesti rintasyövässä (lisätiedosto 1: taulukko S4).

Lisäksi suoritimme rintasyövän kliinisten alatyyppien mukaan stratifioidun assosiaatioanalyysin. Havaitsimme, että uc003awnin (APOBEC3A) ja uc011aocin (APOBEC3A/B) isomuotojen assosiaatio APOBEC-mutaatiosignatuuriin vaihteli eri kliinisissä alatyypeissä, ja merkittävin assosiaatio havaittiin LumA-alatyypissä (Additional file 1: Table S5).

Sukulinjan APOBEC3A/B-deletio vaikuttaa APOBEC3A- ja APOBEC3B-geenien isomuotojen ilmentymistasoihin

Tutkittaessa, miten sukulinjan APOBEC3A/B-deletio vaikuttaa APOBEC3A:n ja APOBEC3B:n isomuotojen ilmentymiseen, tunnistimme ensin 30 näytettä, joissa ennustettiin olevan homotsygoottinen deleetio, 239 näytettä, joissa ennustettiin olevan heterotsygoottinen deleetio, ja 2287 näytettä, joissa ei ennustettu olevan deleetio (Additional file 1: Taulukko S6, ks. menetelmät). Seuraavaksi arvioimme sukusolujen APOBEC3A/B-deleetioiden ja kunkin isomuodon ilmentymistasojen välisiä yhteyksiä käyttämällä yksimuuttuja-analyysiä (ks. menetelmät). Odotetusti havaitsimme, että itulinjan APOBEC3A/B-deleetio liittyi merkitsevästi isomuodon uc003awo (APOBEC3B) alentuneisiin ekspressiotasoihin kaikissa syöpätyypeissä P < 0,05:llä, paitsi haimasyövässä, jossa P = 0,14. Merkittäviä assosiaatioita uc003awn (APOBEC3A) alentuneisiin ilmentymistasoihin havaittiin myös kolmessa syöpätyypissä – virtsarakon, rinnan ja kilpirauhasen syövässä (kuva 2; taulukko 2). Sitä vastoin tuloksemme osoittivat, että APOBEC3A/B:n sukusolujen deleetio liittyi merkitsevästi uc011aoc:n (APOBEC3A/B) lisääntyneeseen ilmentymistasoon kaikissa syöpätyypeissä, lukuun ottamatta maha-, haima- ja munuaissyöpää. Näiden osalta ei ollut tilastollista merkitsevyyttä, mutta niillä oli samat assosiaatiosuunnat (kuva 2; taulukko 2). Erityisesti pään ja kaulan syöpä osoitti merkittävimmän assosiaation, P = 3,8 × 10- 65, ja rinta- ja virtsarakon syövät osoittivat merkittävän assosiaation, P = 3,0 × 10- 8, ja P = 2,9 × 10- 7. Lisäksi teimme saman analyysin väestöryhmittäin, ja näissä syöpätyypeissä havaittiin samanlainen suuntaus (tietoja ei ole esitetty). Tuloksemme viittaavat siihen, että lähes kaikissa tutkituissa syöpätyypeissä APOBEC3A/B:n sukusolujen deleetio liittyi merkitsevästi uc003awnin ja uc003awo:n alentuneeseen ilmentymistasoon, mutta uc011aocin ilmentymistaso oli kohonnut.

Ilulinjan APOBEC3A/B- deletoituminen vaikuttaa APOBEC-mutational signature, neoantigeenikuormiin ja suhteellisiin immuunisolujen koostumuksiin erityisesti rintasyövässä

Edellinen tutkimus osoitti, että itulinjan APOBEC3A/B-deleetio liittyy lisääntyneeseen APOBEC-mutaatiosignatuuriin rintasyövässä, kun taas samankaltainen kuvio, mutta ilman tilastollista merkitsevyyttä, havaittiin monissa muissa syöpätyypeissä, kuten virtsarakon . Käyttämällä yksimuuttuja-analyysiä APOBEC3A/B:n sukulinjan deleetioinnin kokonaisvaikutusten arvioimiseksi APOBEC-mutaatioiden merkitykseen havaitsimme, että deleetio liittyi merkitsevästi lisääntyneeseen APOBEC-mutaatioiden merkitykseen vain rintasyövässä (P = 5,6 × 10- 3; taulukko 3; kuva 3a). Useimmissa muissa syöpätyypeissä havaittiin kuitenkin päinvastainen suuntaus, vaikka useimmat assosiaatiot eivät olleetkaan tilastollisesti merkitseviä (taulukko 3). Erityisesti virtsarakon syövässä havaittiin, että APOBEC3A/B:n sukusolujen deleetio liittyi merkitsevästi vähentyneeseen APOBEC-mutaatiosignatuuriin (P = 1,7 × 10- 3; taulukko 3). Selvittääksemme tarkemmin, johtuuko itulinjan APOBEC3A/B-deleetion vaikutus APOBEC-mutaatiosignatuuriin sen vaikutuksesta geeniekspressioon, arvioimme edelleen APOBEC-mutaatiosignatuurin ja deletion välisiä assosiaatioita mukauttamalla isomuotojen ilmentymistä (ks. menetelmät). Vastaavasti tuloksistamme kävi ilmi, että APOBEC3A/B:n sukusolujen deleetio liittyi merkitsevästi lisääntyneeseen APOBEC-mutaatiosignatuuriin vain rintasyövässä (P = 2,8 × 10- 6; taulukko 3; kuva 3b). Havaittiin suurempi vaikutuksen koko (Beta = – 0,620) deleetio mukautetulla isomuodon ilmentymällä verrattuna alkuperäiseen havaintoon kokonaisvaikutuksesta (Beta = – 0,281; taulukko 3). Arvioidaksemme, voiko ituradan deleetio vaikuttaa osaltaan APOBEC-mutaatiosignatuurin osuuteen, analysoimme myös APOBEC-mutaatiosignatuurin osuuden suhteessa mutaatioiden kokonaismäärään kunkin näytteen osalta (ks. Menetelmät). Yhdenmukaisesti APOBEC-mutaatiosignatuurin alkuperäisen havainnon kanssa havaitsimme, että ituradan deleetio liittyi merkitsevästi APOBEC-mutaatiosignatuurin lisääntyneeseen osuuteen vain rintasyövässä (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 ja Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 kokonaisvaikutuksen ja vaikutusten osalta, kun geeniekspressio on mukautettu; ks. taulukko 3). Nämä tulokset osoittavat, että ituradan APOBEC3A/B-deleetio, joka johtaa lisääntyneeseen APOBEC-mutaatiosignatuuriin, johtuu todennäköisesti siitä, että se on deletion transkriboiman uc011aoc:n erillinen funktio, lukuun ottamatta sen vaikutusta uc011aoc:n lisääntyneeseen ilmentymiseen. On raportoitu, että APOBEC3H-haplotyyppi I (APOBEC3H-I) voi vaikuttaa merkittävästi APOBEC-mutaatioiden allekirjoitukseen näytteissä, jotka kantavat itulinjan APOBEC3A/B-deleetioita rintasyövässä . Analysoimme edelleen APOBEC3H-I-haplotyyppiä yhteensä 76 näytteestä, joiden ennustettiin kantavan itulinjan APOBEC3A/B-deleetioita (ks. menetelmät). Tuloksemme osoittivat, että APOBEC-mutaatiosignatuuri ei korreloinut merkittävästi APOBEC3H-I-haplotyypin kanssa riippumatta näytteistä, joiden ennustettiin kantavan homotsygoottisia tai heterotsygoottisia itulinjan APOBEC3A/B-deleetioita (tietoja ei ole esitetty). Havaintomme ovat kuitenkin linjassa aikaisemman havainnon kanssa, jonka mukaan deletioinnin tuottamalla APOBEC3A/B-proteiinilla on korkeampi ilmentymistaso kuin APOBEC3A-proteiinilla in vitro -toiminnallisista määrityksistä tehdyn tutkimuksen perusteella .

Tutkittaessa tarkemmin erillistä funktiota ja potentiaalisia reittejä, joihin isomuodon uc011aoc ekspressio (transkriboituu APOBEC3A/B-deletion perusteella) saattaa osallistua, analysoimme geenejä, jotka ilmentyivät yhdessä uc011aoc-isoformin kanssa näytteissä, joiden ennustettiin kantavan ituradan APOBEC3A/B-deletioita (ks. menetelmät). Rikastumisanalyysi kanonisissa signaalireiteissä IPA:n avulla paljasti, että nämä yhdessä ilmentyvät geenit rikastuivat merkittävästi eri kanonisissa reiteissä, jotka vaihtelivat eri syöpätyypeissä. Erityisesti havaitsimme, että eniten rikastuneita polkuja olivat HIPPO-signalointi virtsarakon osalta, PTEN-signalointi rintojen osalta, iNOS- ja interferonisignalointi keuhkojen adenokarsinooman osalta, asyyli-CoA-hydrolyysi mahalaukun osalta ja DNA:n kaksoissäikeiden katkeamisten korjaus ja rasvahappojen α-oksidaatio haiman osalta, EIF2-signalointi kilpirauhasen osalta ja GPCR:n välityksellä tapahtuva integraatio munuaisten osalta (P < 0,01 kaikkien kohdalla; Lisätiedosto 1: Taulukko S7). Lisäksi solukuoleman ja eloonjäämisen toiminnallinen rikastuminen havaittiin yleisesti useissa syöpätyypeissä, kuten virtsarakon, rinnan, kohdunkaulan, keuhkojen adenokarsinoomassa ja keuhkokarsinoomassa (P < 0,05 kaikille).

Arvioimme edelleen sukusolujen APOBEC3A/B-deleetioiden ja uusantigeenikuormituksen välistä yhteyttä. Yhdenmukaisesti APOBEC-mutaatiosignatuuria koskevan havainnon kanssa tuloksemme osoittivat, että itulinjan APOBEC3A/B-deleetio liittyi merkitsevästi lisääntyneisiin neoantigeenikuormiin vain rintasyövässä (P = 6,5 × 10- 3; Kuva 3c), kun taas monissa muissa syöpätyypeissä havaittiin päinvastainen suuntaus (Lisätiedosto 1: Taulukko S8). Vastaavasti havaitsimme, että sukusolujen deleetio liittyi marginaalisesti T-solujen (CD8+) koostumuksen suhteelliseen runsauteen TIL:issä, mutta vain rintasyövässä (P = 0,08; kuva 3d). Merkittävä yhteys havaittiin, kun kampasimme näytteet, joissa oli sekä homotsygoottisia että heterotsygoottisia deletioita, ja vertasimme niitä näytteisiin, joissa ei ollut deletioita (Wilcoxonin signed-rank-testi, P < 0,05). Muiden immuunisolujen osalta ei kuitenkaan havaittu yhteyttä. Tuloksemme osoittivat, että itulinjan APOBEC3A/B-deleetioilla on kudosspesifinen rooli vaikutettaessa APOBEC-mutaatioiden allekirjoitukseen ja immunogeenisuuteen rintasyövässä, mikä todennäköisesti vahvistaa aiemmissa genominlaajuisissa assosiointitutkimuksissa tehtyjä havaintoja mahdollisista mekanismeista, jotka liittyvät niiden yhteyteen lisääntyneeseen rintasyöpäriskiin.

APOBEC-mutaatiosignatuurin merkittävä osuus neoantigeeneihin

Tutkittaessa, missä määrin APOBEC-mutaatiosignatuuri vaikuttaa neoantigeeneihin, analysoimme ennustetut neoantigeenikuormitukset jokaisesta näytteestä, jotka oli kerätty aiemmasta tutkimuksesta (ks. Menetelmät). Yksimuuttuja-analyysin avulla arvioimme APOBEC-mutaatiosignatuurin ja neoantigeenikuormien välisiä yhteyksiä kunkin syöpätyypin osalta. Odotetusti APOBEC-mutaatiosignatuurilla oli positiivinen yhteys neoantigeenikuormiin kaikissa syöpätyypeissä (P < 1,0 × 10- 4 kaikissa vertailuissa), kun taas suurimmat merkitsevät assosiaatiot havaittiin rinta- ja virtsarakkotyypeissä, joissa P = 5,1 × 10- 125 ja P = 1,5 × 10- 90 (lisätiedosto 1: taulukko S9). Vastaavasti ennustettujen uusantigeenikuormitusten ja APOBEC-mutaatiosignatuurin osuuden välillä havaittiin yleinen positiivinen assosiaatio, lukuun ottamatta mahasyöpää (kuva 4; lisätiedosto 1: taulukko S10). Erityisesti merkittäviä assosiaatioita havaittiin useissa syöpätyypeissä, kuten virtsarakon, rinnan, kohdunkaulan, keuhkojen adenokarsinooman, pään ja kaulan alueen sekä kilpirauhasen syövässä. Erityisesti rinta- ja virtsarakkosyöpä osoittivat parhaat assosiaatiot, P = 8,9 × 10- 29 ja P = 2,8 × 10- 27 (lisätiedosto 1: taulukko S10). Tuloksemme viittaavat siihen, että APOBEC-mutaatiosignatuurilla on merkittävä rooli neoantigeenien biogeneesin edistämisessä ihmisen syövässä.

Yhteydet TIL:ien immuunisolukoostumusten suhteellisen runsauden ja neoantigeenikuorman sekä APOBEC-mutaatiosignatuurin välillä

Tutkittaessa neoantigeenikuorman ja TIL:ien välistä yhteyttä, käytimme geeniekspressiotietoja kasvainkudoksissa mitataksemme kunkin immuunisolutyypin, mukaan lukien B-solujen naiivi, B-solujen muisti, T-solujen CD8- ja T-solujen CD4-muisti-aktivoitujen solukoostumusten suhteellista runsautta TIL:issä (ks. Menetelmät). Yksimuuttuja-analyysin avulla arvioimme neoantigeenikuorman ja immuunisolukoostumusten suhteellisen runsauden välistä yhteyttä kunkin syöpätyypin osalta. Havaitsimme, että neoantigeenikuormituksen ja sekä T-solujen CD8+- että CD4+-muistiaktivoitujen tyyppien välillä oli positiivinen assosiaatiosuuntaus kaikissa syöpätyypeissä kilpirauhasta ja munuaista lukuun ottamatta (binomitesti P = 0,11 ja P = 0,02 T-solujen CD8+- ja CD4+-muistiaktivoitujen tyyppien osalta vastaavasti). Vastakkainen kuvio havaittiin sekä B-solujen naiivien että muistityyppien osalta kaikissa syöpätyypeissä, lukuun ottamatta keuhkojen adenokarsinoomaa (binomitesti P = 0,02 ja P = 2,2 × 10- 16 B-solujen naiivien ja muistityyppien osalta). Tuloksemme osoittivat erityisesti, että neoantigeenikuormilla oli yhteys sekä T-solujen CD8+- ja CD4+-muistiaktivoitujen että B-solujen naivien ja muistityyppisten tyyppien suhteelliseen runsauteen virtsarakon syövässä. Rintasyövässä oli yhteys sekä B-solujen naivien että muistisolutyyppien osalta ja T-solujen CD4-muistiaktivoitujen solutyyppien osalta keuhkojen adenokarsinoomassa, pään ja kaulan alueen syövässä sekä haimasyövässä (lisätiedosto 1: taulukko S11). Koska APOBEC-mutaatiosignatuuri vaikutti merkittävästi uusantigeeneihin, arvioimme lisäksi TIL:ien immuunisolukoostumusten suhteellisten runsauksien ja APOBEC-mutaatiosignatuurin välistä yhteyttä. Yhdenmukaisesti naeoantigeenikuormituksen assosiaatioanalyysistä tehdyn havainnon kanssa havaittiin samanlainen kuvio myös APOBEC-mutaatiosignatuurin osalta (lisätiedosto 1: taulukko S12). Tuloksemme viittaavat siihen, että APOBEC-mutaatiosignatuurilla on vaikutusta syövän immunogeenisiin kykyihin, kuten tiettyjen immuunisolujen houkuttelemiseen TIL:iin, mahdollisesti lisääntyneen neoantigeenikuorman välittämänä.