Isolation, characterization and toxicological potential of Alternaria-mycotoxins (TeA, AOH ja AME) eri Alternaria-lajeissa Intian eri alueilta

Alternaria-lajien kerääminen ja eristäminen

Tartunnan saaneiden kasvien tartunnan saaneita osia, kuten lehtiä, hedelmiä ja varsia, kerättiin Intian eri alueilta ja tuotiin laboratorioon. Lehtinäytteet pintasteriloitiin 0,5-prosenttisella natriumhypokloriittiliuoksella, pestiin perusteellisesti steriilillä tislatulla vedellä (SDW) useita kertoja ja asetettiin perunadekstroosiagar (PDA) -viljelyalustalle Petri-maljoihin 3-4 päiväksi. Tartunnan saaneita lehtipaloja sisältäviä PDA-levyjä inkuboitiin 28 °C:ssa 12 tunnin valo-/pimeävalojaksolla 6-10 päivän ajan57. Bakteerikontaminaation välttämiseksi elatusaineeseen lisättiin streptomysiiniä. Konidioita tuotettiin yksisorisesti, jotta saatiin puhtaita pesäkkeitä, jotka asetettiin steriloidulle suodatinpaperille.

Patogeenisuustesti

Formae-erityisyyksien määrittämiseksi isolaateista tehtiin virulenssianalyysi tomaattilajikkeilla, jotka ovat alttiita Alternarialle. Patogeenisuutta testattiin yhteensä 60 Alternaria-isolaatilla. Tomaatin siemenet kuurattiin natriumhypokloriitissa, huuhdeltiin vesijohtovedellä ja kuivattiin sitten ilmakuivaksi. Kasvit kasvatettiin erikseen ruukuissa. Fysiologiset olosuhteet, kuten lämpötila ja ilmankosteus, pidettiin kasvien kasvua varten 28-32 °C:ssa ja 40-60 prosentin suhteellisessa ilmankosteudessa. Inokulaatioiden pitoisuus pidettiin optimaalisena (2 × 106 itiötä/ml), ja ne ruiskutettiin lehtialueelle. Kokeessa olevia kasveja pidettiin kastekammioissa 8 tuntia 25 °C:ssa. Näitä kasveja seurattiin säännöllisesti 2-3 päivän ajan tartunnan vakavuuden ja taudin kehittymisen osalta verrattuna vertailulehteen, jota ei ollut rokotettu. Oireet alkoivat näkyä 1 päivä itiöiden ruiskuttamisen jälkeen. Taudin vakavuutta arvioitiin 1 päivästä inokulaation jälkeen 6 päivään asti. Tiedot analysoitiin tilastollisesti käyttäen varianssianalyysiä (ANOVA) ja Duncanin testiä (P ≤ 0,05).

DNA:n uuttaminen ja patogeenin tunnistaminen

Patogeeni tunnistettiin aluksi morfologisten ominaisuuksien, kuten koon ja muodon, perusteella, ja konidioiden rakenteen perusteella, ja se vahvistettiin edelleen ITS-monistamalla käyttäen universaaleja alukkeita ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) ja ITS4 (5′-TCCTCTCCGCTTATTGATATATGC-3′), jotka monistivat ITS-alueet ja 5.8S-geenit, jotka koodaavat sienilajeja. DNA:n uutto suoritettiin Doylen ja Doylen58 ehdottaman menetelmän mukaisesti. Lyofilisoitua 0,5 g:n sienimattoa jauhettiin morttelissa 10 ml:lla CTAB-uuttopuskuria ja inkuboitiin sitten 65 °C:ssa vesihauteessa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen näyte sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen jäähdytettyä kloroformia/isoamyylialkoholia ja sekoitettiin varovasti, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin 10 000 rpm 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Näin saatu supernatantti sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen isopropanolia ja jätettiin 2 tunniksi 4 °C:een. Näyte sentrifugoitiin uudelleen 10 000 rpm 10 minuutin ajan 4 °C:n lämpötilassa. Tämän jälkeen pelletti huuhdeltiin 70-prosenttisella etanolilla ja kuivattiin ilmakuivattuna 4 tuntia alkoholijäämien poistamiseksi. Amplifiointi ITS rDNA -reaktio suoritettiin 25 μl:n reaktioseoksessa, joka sisälsi 2,5 μl 10X-reaktiopuskuria, 5 μl kutakin deoksiribonukleotiditrifosfaattia (dNTP) ja 1,0 μl kutakin ITS:n ja 5,8 S-alueen universaalia eteenpäin suuntautuvaa aluketta (ITS1) ja taaksepäin suuntautuvaa aluketta (ITS4), 0,3 μl Taq-DNA-polymeraasia, 10-100 ng DNA:ta ja 2,5 μl MgCl2:ta. PCR:n optimoitu lämpöprofiili oli alku denaturointi 95 °C:ssa 3 minuutin ajan, denaturointi 95 °C:ssa 30 sekunnin ajan, anneaatio 70 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja lopullinen pidennys 72 °C:ssa 1 minuutin ajan sekä 40 lisäsykliä. Monistuminen varmistettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä 0,5X TBE-puskurissa, joka ajettiin rinnakkain DNA:n molekyylipainomarkkerin kanssa ja visualisoitiin UV-transillaattorissa.

ITS-sekvenssianalyysi

Valittujen isolaattien saadut ITS rDNA-alueet leikattiin edelleen ja puhdistettiin QIAquick PCR-puhdistussarjalla (QIAGEN, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistetut tuotteet lähetettiin lopulta SciGenome Cochiniin, Keralaan, Intiaan, sekvensointia varten. Sekvenssejä verrattiin GenBankissa (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oleviin sekvensseihin NCBI BLASTin avulla. BLAST-analyysi suoritettiin täyspitkillä ITS-sekvensseillä kyselyinä, jotta saatiin selville suhteet julkaistuihin sekvensseihin. Korkein homologia ja kokonaispistemäärä kirjattiin ylös jatkoanalyysiä varten. Tässä tutkimuksessa saadut sekvenssit toimitettiin GenBankiin. Muista formae speciale -muodoista peräisin olevien Alternaria-kantojen ITS-sekvenssit ladattiin NCBI:n GenBank-tietokannasta, ja niitä käytettiin fylogeneettisissä analyyseissä vertailusekvensseinä. Kaikki DNA-sekvenssit linjattiin BioEdit-sekvenssikohdistusohjelmassa olevalla Clustal W -ohjelmalla59, 60. Tuloksena saatua multiple-alignment-tiedostoa käytettiin fylogeneettisiin analyyseihin, jotka tehtiin MEGA 5.0 -ohjelmalla Neighbor-Joining-menetelmällä, joka sallii 500 bootstrap-toistoa61.

Toksiinien uuttaminen Alternaria-lajeista

Myrkyllisten aineenvaihduntatuotteiden uuttaminen tehtiin Andersenin ym. menetelmän mukaisesti62 eräin muutoksin. Näiden kasvimyrkkyjen uuttaminen suoritettiin PDB-alustalla (Potato Dextrose Broth) käyttäen 20 päivän ikäisiä viljelmiä. Kunkin Alternaria-pesäkkeen keskeltä leikattiin kolme agartulppaa (3 mm), jotka inokuloitiin 200 ml:aan PDB-alustaa. Taudinaiheuttajan pesäkkeet leikattiin 5 mm:n korkkiporan avulla, minkä jälkeen pesäkkeet istutettiin PDB-alustaan. Kaksikymmentä päivää vanhat viljelmät suodatettiin suodatinpaperin läpi tyhjiösuodattimella. Viljelmien suodoksiin lisättiin yhtä suuri määrä metanolia, sekoitettiin kunnolla ja säilytettiin 4 °C:ssa 24 tuntia. Tämän jälkeen suodos saostettiin ja metanoli haihdutettiin kuivaksi pyörivässä tyhjiökonsentraattorissa (IKA® RV 10) 43 °C:ssa. Uutettuun suodokseen lisättiin sama määrä etyyliasetaattia ja sekoitettiin kunnolla erotussuppilossa. Näin saatiin kaksi faasia, joista toinen oli orgaaninen faasi ja toinen vesifaasi. Vesikerros erotettiin ja uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattiuute väkevöitiin 44 °C:ssa tyhjiöhaihduttimessa ja liuotettiin metanoliin.

Alternaria-fytotoksiinin puhdistus ja erottelu kolonnikromatografialla

Yhdisteiden puhdistus ja erottelu suoritettiin käyttäen Devi et al.63:n menetelmää pienin muutoksin. Kolonnikromatografia (CC) suoritettiin lasikolonnissa (700 mm × 30 mm) ja pysyväksi faasiksi valittiin silikageeli (100-120 silmäkoko Merk). Liikkuva faasi koostui puhtaasta liuottimesta tai eri liuottimista olosuhteiden vaatimuksesta riippuen. Pylväs täytettiin Alternaria-lajin isolaateista uutetulla raakakompleksilla. Myrkyllisten aineenvaihduntatuotteiden erottamiseen käytettiin liikkuvaa faasia, joka koostui kloroformi: metanoli (80:20 ja 95:05), bentseeni: asetoni: etikkahappo (60:35:05) -suhteesta, ja yhdisteiden erottamiseen käytettiin gradienttieluutiota. CC:stä eluoituneet eri fraktiot erotettiin toisistaan ohutkerroskromatografialla (TLC) ja vahvistettiin HPLC-analyysillä.

Fytotoksiinien ohutkerroskromatografian (TLC) analyysi

Ohutkerroskromatografiaa (TLC) käytettiin yksilöityjen Alternaria-lajien suurten ja pienten itiöiden tuottamien erilaisten kasvimyrkkyjen tunnistamiseen. TLC tehtiin Andersenin ym.64 menetelmää käyttäen. Menetelmässä 4,5 g silikageeliä G254 (sideaineena 13 % CaSO4 ½ H2O) lisättiin 25 ml:aan kaksoistislattua vettä ja sekoitettiin lasisauvalla, kunnes silikageelistä muodostui liete. Tämän jälkeen liete levitettiin varovasti lasilevylle ja asetettiin turvalliseen paikkaan ilmakuivumista varten. Eri kasvimyrkkyjen erottamiseen käytettiin eri liikkuvia faaseja suhteessa kloroformi: metanoli (80:20; v/v), bentseeni: asetoni: etikkahappo (60:35:5; v/v), kloroformi: metanoli (95:5; v/v), etyyliasetaatti: bentseeni (95:5; v/v). Nämä liuotinseokset asetettiin sitten eksikaattoreihin ja niiden annettiin olla 30 minuuttia, jotta niiden sisällä oleva ympäristö kyllästyisi. Ennen TLC:n suorittamista silikageelillä päällystetyt lasilevyt ladattiin asettamalla ne 60 °C:n uuniin 10 minuutiksi. Latauksen jälkeen 5 µl näytteitä tiputettiin eri kohtaan 2 cm:n etäisyydelle alustasta. Näytteiden tiputtamisen jälkeen TLC-levyt kuivattiin eksikaattorissa muutaman minuutin ajan. Tuloksena syntyneet läiskät kehitettiin altistamalla TLC-levyt 0,2-prosenttiselle etanoliselle ferrikloridille ja/tai visualisoimalla ne UV-valossa 365 nm:ssä. TLC-levyt kuivattiin sitten ilmakuivaksi yön yli, minkä jälkeen Rf-arvot laskettiin. Eri metaboliittien pilkut, joiden Rf-arvot todettiin samanlaisiksi kuin standardien Rf-arvot, raaputettiin pois, liuotettiin HPLC-luokan metanoliin ja käytettiin HPLC-analyysiin.

HPLC-UV-analyysi

Standardin valmistus

TeA (kat. N:o: T1952), AOH (kat. N:o: A4675) ja AME (kat. N:o: A4678) ostettiin yrityksestä: Biogenuix, (LKT laboratoriot Inc.), New Delhi, Intia), ja niitä käytettiin kiteytetyssä muodossa standardin valmistukseen. Toksiinien kantaliuos (1000 µg ml-1) ja erillinen työliuos (10 µg ml-1) valmistettiin HPLC-luokan metanoliin ja säilytettiin -20 °C:ssa myöhempää käyttöä varten. Näitä toksiineja käytettiin standardeina HPLC-kalibroinnissa ja muissa lisäkokeissa laimentamalla valmistettuja työliuoksia.

HPLC-UV-analyysiolosuhteet

HPLC-analyysiä varten näytteet erotettiin kromatografisesti käyttäen emäksistä deaktivoitua (250 mm pitkä × 4.6 mm, hiukkaskoko 5,0 µm) C18 Waters Spherisorb, ODS2-kolonnia (tuotenro: PSS831915, USA), joka oli yhdistetty suojapylvääseen, Waters-sarjan järjestelmään (Waters, Waters Corporation, Milford, USA), jossa oli UV-VIS-detektori (2998 PDA) ja Waters 600E -järjestelmäohjain. Integroinnin aallonpituudeksi asetettiin 2998 PDA -ilmaisimen aallonpituus 254 nm. Näytteet injektoitiin Waters 717plus -autosamplerin (Waters Corporation, Milford, USA) 10 μl:n silmukalla. Kolonni ja suojapylväs olivat termostaattiohjattuja 28 °C:ssa. Virtausnopeus oli 0,70 ml/min ja liikkuva faasi koostui 75-prosenttisesti HPLC-luokan metanolista (liuotin A), 25-prosenttisesti 0,1 M fosfaattipuskurin vesiliuoksesta (liuotin B), johon lisättiin 900 ml DW 1 litraa kohti ja jonka pH 5,8 ylläpidettiin fosforihapolla. Laite ajettiin lineaarisessa isokraattisessa tilassa, ja detektiota seurattiin 200-400 nm:n alueella. HPLC-menetelmän luotettavuus AME:n, TeA:n ja AOH:n analysoinnissa validoitiin havaitsemisrajan (LOD) ja määritysrajan (LOQ) avulla.

LC-MS/MS-analyysi

Alternaria-toksiinien (AME, AOH ja TeA) lisävarmennusta varten tehtiin kromatografia-tandem-massaspektrometrinen (LC-MS/MS)-menetelmä Tölgyesin ym.65 pienin muutoksin. Menetelmään kuuluu kiinteän ja nestemäisen aineen uuttaminen metanolilla ja sen jälkeinen derivointi TeA:n, AOH:n ja AME:n osalta. Tämän jälkeen näytteet puhdistettiin kiinteän faasin uutolla polymeeripohjaisilla patruunoilla, ja lopuksi toksiinit erotettiin LC-MS/MS:llä. LC-MS/MS-analyysiä varten näytteet valmistettiin vaiheittain.

Reagenssit, liuottimet ja standardin valmistelu

Kuivatut AME:n, AOH:n ja TeA:n analyyttiset kalibrantit ostettiin Biogenuixilta (LKT labatories, Inc., New Delhi, Intia). Standardit palautettiin 1,0 ml:aan metanolia, jotta saatiin 0,1 mg ml-1 kantaliuoksia. Kaikki kantaliuokset säilytettiin 4 °C:ssa. 2,4-dinitrofenyylihydratsiini (DNPH) ja undekanaali ostettiin Sigma-Aldrichilta. Derivointireagenssi (0,58-prosenttinen DNPH HCl-liuoksessa) valmistettiin Siegel et al.7:n kuvaamalla tavalla. Pysäytysreagenssina käytettiin 5-prosenttista (v/v) undekanaalia metanolissa. Derivoidut TeA-, AOH- ja AME-standardiliuokset (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml ja 2,71 μg/ml metanolia) valmistettiin sekoittamalla 1 ml 10 μg/ml metanolista TeA-, AOH- ja AME-liuosta ja 1 ml DNPH-liuosta. Seos jätettiin yön yli ja käsiteltiin kuten näytteen uuttoa ja SPE-puhdistusta koskevissa kohdissa on kuvattu. Lopullinen tilavuus säädettiin 10 ml:aan metanolilla. Näitä liuoksia käytettiin LC-MS/MS-olosuhteiden optimointiin analyysia varten. Yhteensä 50 mM ammoniumformiaattipuskuria valmistettiin veteen ja sen pH säädettiin muurahaishapolla arvoon 3,0. Metanoli ja asetonitriili olivat Sigma-Aldrichin LC-MS-laatua. Etyyliasetaatti, n-heksaani, dikloorimetaani, muurahaishappo ja ammoniumformiaatti olivat HPLC-laatua ja hankittu Merckiltä (Darmstadt, Saksa). Kinetex C-18 UPLC LG 500 -kolonni (3 × 100 mm, 2,6 μm), Strata SPE -patruunat (6 ml, 200 mg) ja regeneroidusta selluloosasta (RC) valmistetut ruiskusuodattimet (15 mm, 0,45 μm) hankittiin Phenomenexiltä (Utrecht, Alankomaat). Supelco Ascentis Express C-18, syaani (ES-CN) ja fenyyliheksyyli HPLC-kolonnat (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) ostettiin Sigma Aldrichilta. Menetelmän kehittämisessä käytetyt standardimyrkkynäytteet ostettiin Biogenuixilta (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Intia). Näytteet säilytettiin -20 °C:ssa, kunnes ne analysoitiin.

Näytteiden uuttaminen

Raaka-aineenvaihduntatuotteiden uuttamisnäytteet puhdistettiin pylväs-kromatografiamenetelmällä ja fraktio eluoitiin ja liuotettiin metanoliin. 50 ml näytettä kustakin fraktiosta sekoitettiin 50 ml:n polypropyleeniputkiin (PP), jotka suljettiin. Näytteitä sekoitettiin vorteksisekoituksella 5 sekunnin ajan ja ravisteltiin vaakatasossa CAT S50 -ravistimella 600 min-1 -nopeudella 45 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen putkia sentrifugoitiin 5 000 rpm 10 minuutin ajan 20 °C:ssa ja ylempi kerros kerättiin uuteen 50 ml:n PP-sentrifugiputkeen. Näytteeseen lisättiin 100 μl derivatisointireagenssia (0,596 % DNPH:ta 2 mol/lit HCl:ssä) ja sitä sekoitettiin vorteksilla 5 sekunnin ajan. Näytteen annettiin derivatisoitua 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen lisättiin 500 μl pysäytysreagenssia 5 % (v/v) undekanaalia metanoliin ja sekoitettiin vorteksilla 5 sekunnin ajan. Näytteen annettiin seistä 30 minuuttia, minkä jälkeen se laimennettiin PP-putkessa 35 ml:ksi 50 mM ammoniumformiaattipuskurilla (pH 4, säädetty muurahaishapolla). Näyte sentrifugoitiin 5 000 rpm 10 minuutin ajan 20 °C:ssa ja sille tehtiin kiinteäfaasiuuton puhdistus.

Kiinteäfaasiuuton (SPE) puhdistus

Strata-XL-kasetit (200 mg, 6 ml, 100 μm) ilmastettiin 6 ml:lla metanolia, jonka jälkeen annosteltiin 6 ml:aa vettä ja 6 ml:aa 50 mM formiaattipuskuria. Kasetteihin liitettiin 75 ml:n säiliöt ja näytteet ladattiin säiliöihin. Tämän jälkeen näytteet annosteltiin pisaroittain. Tämän jälkeen SPE-kolonnit pestiin 6 ml:lla metanoli-vesi (15/85, v/v) ja sen jälkeen 6 ml:lla n-heksaania. Patruunoita kuivattiin tyhjiössä 5 minuutin ajan ennen näytteiden eluointia lasiputkiin 5 ml:lla metanolia. Näytteet haihdutettiin kuiviksi 45 °C:ssa loivassa typpivirrassa ja liuotettiin uudelleen 250 μl:aan metanolia sekoittamalla 20 sekunnin ajan vorteksilla. Viimeisenä vaiheena näytteet suodatettiin regeneroitujen selluloosasuodattimien läpi HPLC-injektiopulloihin.

Laitteisto ja laitteet

Menetelmän kehittämisessä käytettiin Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm:n järjestelmää (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA -detektori, Waters Corporation, Milford, MA, USA), joka oli kytketty MassLynx triple quadrupole MS -detektoriin (Waters, Milford, MA, USA). Tiedonkeruu ja arviointi suoritettiin MassLynxin versiolla 4.0. Lopullinen menetelmä siirrettiin myös Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS-järjestelmään (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA), johon kuului Watersin acquity QSM -binaaripumppu (SN- L10QSM943A), Watersin acquity fin -autosampleri (SN-M10SDI443M), pylvästermostaatti ja TQD Quantum Ultra kolmoiskvadrupoli-MS-ilmaisin. Kolonnin tavoitelämpötila oli 30 °C ja näytteen tavoitelämpötila 10 °C. Tiedonkeruu ja arviointi suoritettiin Xcalibur-ohjelmistolla 2.0.7. SP1. Molemmat järjestelmät oli varustettu sähkösumutinrajapinnalla (ESI), jossa pelkkää negatiivista ionisaatiota käytettiin hankinnan aikana. Kuivaus- ja törmäyskaasuna käytettiin typpeä. Ionilähteen parametrit on esitetty tiivistetysti lisätaulukossa S2. Lisäksi menetelmän siirrettävyyttä tutkittiin LC-MS/MS-järjestelmällä, joka koostui Agilent 1100 HPLC:stä, joka oli kytketty AB Sciex 4000 triple quadrupole MS:ään (Framingham, MA, USA).

laiteolosuhteet

Alternaria-toksiinit erotettiin Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC-kolonnilla, joka oli varustettu 2,1 mm:n suuruisella C-18- esikolonnilla, käyttäen lineaarista gradienttieluutiota. Neljä liuotinta (liuottimet A, B, C ja D) sekoitettiin binääripumpulla. Liuotin A sisälsi asetonitriiliä (ACN) + vettä (5:95), liuotin B sisälsi ACN: 5 % isopropyylialkoholia (IPA), liuotin C sisälsi 100 % metanolia ja liuotin D sisälsi puhdasta ammoniumasetaattia. Virtausnopeus oli 0,5 ml/min. Liikkuvan faasin liuottimet olivat alkuaikana 0,0 % A, 30 % B, 30 % C ja 40 % D. Loppuaikana (5 min) liuottimet olivat 0,0 % A, 30 % B, 30 % B, 30 % C ja 40 % D. Gradienttiohjelmassa tarvittiin riittävä pesuvaihe kertyneiden lipofiilisten matriisiliuosten poistamiseksi. Kokonaisanalyysaika oli 5 minuuttia. Kolonnin termostaatti piti lämpötilan 30 °C:ssa ja injektiotilavuus oli 1,0 μl. Autosampleria käytettiin 20 °C:n lämpötilassa.

UPLC LG 500 nm:n järjestelmä kytkettiin MS/MS-detektoriin (Micromass Quattro Ultima PT) negatiivisessa tilassa toimivan sähkösumutinrajapinnan (ESI) kautta. Optimoidut ESI-asetukset olivat seuraavat: lähteen lämpötila 120 °C, desolvaatiolämpötila 350 °C, kuivauskaasun virtaus 650 L/Hr, kartiokaasun virtaus 30 L/Hr ja kapillaarijännite 3,50 kV. Kuivaus- ja törmäyskaasuna käytetään typpeä (2,67 × 10-6 bar). MS:ssä käytettiin MRM-tilaa (Multiply monitoring reaction) detektoinnin aikana, ja kullekin kohdetoksiinille skannattiin kaksi ionisiirtymää. MRM-tilaa sovellettiin MS/MS-detektorissa, ja kullekin kohdeyhdisteelle tallennettiin kaksi ionisiirtymää (kvantifioija ja kvalifioija). Valitut ionitransitiot optimoiduilla jännitteillä (kartio- tai putkilinssi), törmäysenergioilla (CE) ja viipymäajoilla on koottu taulukkoon (lisätaulukko S2).

Erilaisten Alternaria-mykotoksiinien toksikologisen potentiaalin arviointi (TeA, AOH ja AME)

Erilaisten mykotoksiinien aiheuttaman solukuoleman laajuuden mittaaminen määritettiin irrotettujen lehtien inokulaatiomenetelmällä. Tätä varten tuoreet lehtinäytteet irrotettiin kasvihuoneessa kasvatetuista kasveista ja pestiin kunnolla 3-4 minuuttia juoksevassa vesijohtovedessä, steriloitiin 1,0-prosenttisessa (0,01 g/ml) natriumhypokloriitissa noin 1 minuutin ajan, minkä jälkeen pinta pyyhittiin 70-prosenttisella etanolilla ja lopuksi huuhdeltiin aseptisesti huolellisesti steriilillä tislatulla vedellä. Lopuksi lehdet asetettiin kostutetulle suodatinpaperille ja pistettiin steriilillä neulalla alapintaan. Toksiinit liuotettiin steriiliin deionisoituun veteen pitoisuudella 100 μg/ml. Pisaroita (100 µl) kutakin kolmesta toksiinista ruiskutettiin haavoittuneisiin lehtiin hienolla neulalla (Dispovan, 1 ml). Kontrollinäyte säädettiin pistämällä steriiliä tislattua vettä. Käsiteltyjä lehtinäytteitä pidettiin kosteassa kammiossa (lämpötila 27 ± 0,5 °C ja suhteellinen kosteus 60 %) kasvihuoneolosuhteissa (14 tunnin valo- ja 10 tunnin pimeäjakso 27 °C:ssa). Näytteitä tarkkailtiin säännöllisesti (24 tunnin välein 6 päivän ajan), jotta saataisiin selville mahdolliset toksikologisten vaikutusten kannalta merkitykselliset muutokset, jotka kehittyivät ruiskutetuissa näytteissä verrattuna kontrollinäytteisiin. Koejärjestelyä ylläpidettiin kolmena toistona, ja myrkkyjen aiheuttaman solukuoleman aiheuttama lehtipinta-alan prosenttiosuus mitattiin (Systronic leaf area meter 211) ja laskettiin seuraavassa esitetyllä kaavalla.

Solukuoleman määrittäminen Evansin sinisen imeytymismäärityksellä

Solujen elinkelpoisuuden menetys (solukuolema) arvioitiin Evansin sinisen värjäysmenetelmällä (Baker ja Mock, 1994). Tomaatin lehtiä käsiteltiin samalla pitoisuudella (250 μg/ml) kaikkia kolmea toksiinia. Käsitellyt lehdet värjättiin 0,25 % (v/v) Evansin sinisen vesiliuoksella 15 minuutin ajan. Kun lehtiä oli pesty tislatulla vedellä 30 minuutin ajan, ne leikattiin pois ja liotettiin 500 µl:ssa N,N-dimetyyliformamidia 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Vapautuneen Evansin sinisen optinen tiheys mitattiin spektrofotometrisesti 600 nm:ssä.

Statistinen analyysi

Statistinen analyysi tehtiin käyttämällä IBM SPSS Statistics ver. 20 -ohjelmistolla varianssianalyysin avulla (yksisuuntainen ANOVA), jota seurasi Duncanin moniarvotesti P ≤ 0,05 merkitsevyystasolla. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD) vähintään kolmesta kunkin metaboliitin toistosta. Tilastolliset data-analyysit analysoitiin valituilla 48 Alternaria-lajin isolaateilla, jotka olivat luonteeltaan patogeenisiä.