Kultaisiin nanohiukkasiin perustuva sivuvirtausliuska 6-monoasetyylimorfiinin havaitsemiseksi oraalinesteestä

Esittely

Opioidien väärinkäytön määrä on noussut jyrkästi viime vuosina, ja se on merkittävä sairastuvuus- ja kuolemansyy. YK:n huumausaine- ja rikostoimiston julkaiseman World Drug Report 2017 -raportin mukaan opiaattien ja reseptillä saatavien opioidien käyttö ei ehkä ole yhtä yleistä kuin kannabiksen, mutta opioidit ovat edelleen merkittäviä huumausaineita, joilla on potentiaalisia haittoja ja terveysvaikutuksia . Siksi opioidien helppo ja nopea havaitseminen on kiireellinen tarve.

Liiton heroiinin väärinkäyttö on yksi yleisimmistä opioidiriippuvuuden muodoista. Heroiini (diasetyylimorfiini, diamorfiini tai Diagesil®) on puolisynteettinen morfiinijohdannainen ja voimakas opioidianalgeetti . Heroiinin aineenvaihdunta on havainnollistettu kuvassa 1 . Heroiini hydrolysoituu nopeasti 6-monoasetyylimorfiiniksi (6-MAM) ja lopulta morfiiniksi. Koska heroiini hydrolysoituu nopeasti antamisen jälkeen, sen aineenvaihduntatuotteita käytetään yleensä käytön varmistamiseen. Lisäksi 6-MAM on ainoa spesifinen indikaattori viimeaikaisesta heroiinin väärinkäytöstä verrattuna morfiiniin, ja se on herättänyt suurta kiinnostusta tutkimusyhteisössä.

6-MAM:n osoittamiseksi on kuvattu useita menetelmiä, jotka voidaan jakaa seuraaviin luokkiin: (1) kromatografinen analyysi, mukaan lukien kaasukromatografia ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia ; (2) spektroskooppinen analyysi, kuten Ramen-spektroskopia, infrapunaspektroskopia, kemiluminesenssi jne.; (3) kapillaarielektroforeesi ; ja (4) immunomääritysmenetelmät (antigeeni-vasta-aine) . Monimutkaiset laitetekniikat aiheuttavat valtavia paineita lääkeaineiden perusseulontaan, koska tarvitaan kehittyneitä laitteita ja ammattitaitoisia käyttäjiä. Laboratorio on joskus suljettu tai kaukana. Edes poliisiasemilla ei ole tilaa näille monimutkaisille ja kalliille laitteille. Poliisin on kuitenkin välittömästi arvioitava, sisältääkö epäilty aine heroiinia vai ei, ja hänen on reagoitava nopeasti. Näin ollen tarvitaan kipeästi spesifisten, luotettavien ja yksinkertaisten menetelmien kehittämistä laittomien huumausaineiden havaitsemiseksi biologisista näytteistä .

Nopean havaitsemisen menetelmistä kolloidisiin kultaisiin nanohiukkasiin (AuNP) perustuvia lateraalivirtausliuskoja (LFS) on laajalti käytetty nopeaan seulontaan AuNP:iden koosta ja etäisyydestä riippuvan optisen ominaisuuden ansiosta, ja ensimmäisen raportin tekivät Mirkin ja työtoverit . Puolikvantitatiivisten lateraalivirtausmääritysten periaatteena on, että AuNP:iden punainen väri voidaan havaita paljaalla silmällä antigeeni-vasta-aineyhdistelmästä muutamassa minuutissa . Heroiinin väärinkäytön havaitsemiseen on saatavilla erilaisia kaupallisia testipaketteja, muun muassa NovaBios- ja Wondfo-yrityksiltä. Useimmat heroiinin seulontapakkaukset mittaavat kuitenkin vain morfiinia mutta eivät 6-MAM:ää, koska 6-MAM:n ja morfiinin erottaminen toisistaan on vaikeaa. Morfiini voi olla metaboloitunut muista huumeista tai sitä on voitu määrätä. 6-MAM on yksiselitteisesti jäljitettävissä heroiiniin.

Näytteitä on verestä, plasmasta, virtsasta, hiuksista, suunesteistä sekä hengityksestä, hiestä, rintamaidosta, hampaista jne . Yleisimmät näytteet, joita käytetään laittoman heroiinin testaamiseen, ovat veri, virtsa ja suunesteet. Näistä verikoe on tarkin ja luotettavin, mutta se on myös invasiivinen. Virtsatesti on kätevin ja laajimmin käytetty huumeiden väärinkäytön seulonnassa. Suunesteitä käytetään yhä useammin hoitopaikkatesteissä – ne on helppo kerätä julkisesti. Suunesteet ovat kuitenkin hyvin viskoosisia, ja niissä on alhaiset kohdepitoisuudet, joten useimmissa testeissä käytetään virtsaa 6-MAM-testaukseen. Kaikissa suun kautta otettavien nesteiden testien kehitystyössä on sama ongelma näytteenoton ja herkkyyden parantamisen suhteen. Aiempi tutkimus osoitti, että 6-MAMia havaitaan usein suunesteessä. Suunesteen 6-MAM:n LFS:n havaitsemisstandardi on 4 ng ml-1 . Tässä kehitimme lateraalivirtaustestin heroiinille suunestenäytteissä.

Etsimme AuNP:tä vasta-ainemerkkeinä lateraalivirtaustestissä 6-MAM:n nopeaa ja herkkää havaitsemista varten kolorimetrisen signaalin avulla. Syntetisoimme ensin 6-MAM:n ja konjugoimme sen sitten naudan seerumin albumiiniin (BSA), jotta se voitaisiin päällystää T-linjalle. Lisäksi suun nestenäytteiden käsittelyyn liittyvien vaikeuksien voittamiseksi valittiin nitroselluloosakalvojen (NC) tyypit, näytetyynyn liuoskaava ja sieniadsorbenttityyny, jotta voitiin etsiä parhaat olosuhteet suun nesteen LFS:lle. Lopuksi 6-MAM LFS validoitiin ja osoitettiin, että sillä on erinomainen herkkyys ja spesifisyys.

Kokeellinen

2.1. Materiaalit

6-MAM-vasta-aineet toimitti Bioventure (Shanghai). BSA ja polyvinyylipyrrolidoni (PVP) ostettiin Sigmasta (Barcelona, Espanja). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) ja STANDAPOL ES-1 (S7) ostettiin BASFiltä (Saksa). Tislattu vesi (ominaisvastus 18,2 MΩ cm-1) valmistettiin RephiLe PURIST UV Ultrapure water -järjestelmällä (Kiina). Reel-dispersiojärjestelmä oli peräisin Doyesgolta (Kiina). Vion IMS Q-Tof -massaspektrometri oli peräisin Watersilta (Yhdysvallat). Kaikki standardimateriaalit, kuten 6-MAM ja morfiini, saatiin kansallisilta elintarvike- ja lääkevalvontavirastoilta (Kiina). Mikroskooppi oli Motic AE2000 (Xiamen, Kiina). Kaikki muut kemialliset ja immunologiset reagenssit, joita ei ole eritelty tässä, olivat analyyttistä/reagenssilaatua olevia kaupallisia vakiotuotteita.

2.2. Tutkimuksen tulokset Sivuvirtausliuskojen osat

LFS-liuskoissa on muovinen taustalevy, sieniadsorbenttiliuska (sienityyny), näytetyyny, konjugoitu tyyny, NC-membraanit ja absorptiotyyny. Sieni-adsorbenttiliuska on suunniteltu erityisesti suunesteen keräämistä varten, ja se kuljettaa suunesteen nopeasti näytetyynyyn. Näytetyyny sisältää puskurijärjestelmän ja joitakin pinta-aktiivisia aineita. Vasta-aine-AuNP-konjugaatit ruiskutettiin konjugaattityynylle, jotta ne reagoivat näytteen kanssa ja irtoaisivat tyynytyynystä ja pääsisivät NC-kalvoon, joka on päällystetty 6-MAM-BSA:lla T-linjalla ja vuohen antikaniittivasta-aineilla C-linjalla. Imukykyinen tyyny on suodatinpaperi, joka sijaitsee liuskan päässä; se ylläpitää kapillaarivirtausta. LFS tarvitsee vain asettaa suuhun tai asettaa suunäytekuppiin. Kaaviokuva LFS:stä on esitetty kuvassa 2. 6-MAM:n havaitsemiseen tarkoitetun LFS:n kaaviokuva on esitetty kuvassa 3.

2.3. 6-monoasetyylimorfiinin ja naudan seerumin albumiinikonjugaatin synteesi

6-MAM valmistettiin aiemmin tutkimuksissa kuvatulla tavalla . Lyhyesti sanottuna morfiinia valmistettiin ensin heroiinin alkalihydrolyysillä. Tämän jälkeen 6-MAM-molekyyliin lisättiin N-hydroksisukinimidiryhmä (NHS) esteriryhmä sen konjugoimiseksi kantajaproteiineihin (kuva 4). Aktivoitu 6-MAM varmistettiin Waters® Vion IMS Q-Tof -massaspektrometrillä. Seuraavaksi synteesi suoritettiin kuvatulla tavalla (kuva 5) eräin muutoksin. Ensin 80 mg BSA:ta 6 ml:ssa 50 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH = 7,5) annettiin jäähtyä 0 °C:seen. Sitten lisättiin 20 mg aktivoitua 6-MAM:ää 1 ml:aan vedetöntä dimetyyliformamidia (DMF) pisaroittain 0 °C:ssa. Seos lämmitettiin huoneenlämpötilaan ja sekoitettiin yön yli. Saatu 6-MAM-BSA-konjugaatti dialysoitiin 50 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH = 7,5) vastaan kuudella puskurinvaihdolla (vähintään 6 h kukin 4 °C:ssa).

2.4. Kemiallinen reaktiopolku. Kulta-nanopartikkelien ja vasta-ainekonjugaattien valmistaminen

20 nm:n AuNP:t valmistettiin sitraattipelkistysmenetelmällä . Tässä 2 ml 1-prosenttista HAuCl4-liuosta lisättiin 100 ml:aan kiehuvaa vettä voimakkaasti sekoittaen ja sitten lisättiin välittömästi 2 ml 1-prosenttista natriumsitraattiliuosta. Kun liuos muuttui punaiseksi, sitä keitettiin vielä 15 minuuttia. Liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja säilytettiin 4 °C:ssa jatkokäyttöä varten.

Kun AuNPs-liuoksen pH-arvo oli säädetty 9,0:aan 0,1 M K2CO3:lla, 30 µg 6-MAM-vasta-aineita lisättiin 10 ml:aan AuNPs-liuosta ja inkuboitiin 30 min. Tämän jälkeen lisättiin 20 µl 100,0 g l-1 BSA:ta 15 minuutin ajan reaktiivisten kohtien estämiseksi. Liuosta sentrifugoitiin 3740 g:ssa 15 minuutin ajan, ja supernatanttia sentrifugoitiin uudelleen 12 100 g:ssa vielä 30 minuutin ajan. Kaikki kultasakat sekoitettiin ja mitattiin absorptiomaksimin määrittämiseksi UV-violettispektroskopian avulla. Sen jälkeen se säilytettiin 4 °C:ssa jatkokäyttöä varten.

Samaa menetelmää käytettiin AuNP:iden konjugoimiseksi kanin IgG-vasta-aineisiin. Konjugaattityynyä tehtäessä vasta-ainekonjugaatit laimennettiin absorbanssiin viisi puskurilla (0,05 M Tris-HCl, joka sisältää 10,0 g l-1 BSA:ta, 0,4 % Triton X-100:a, 5 % trehaloosia, 10 % sakkaroosia, pH 8,2). Lopuksi 500 µl sekoitettuja AuNP-vasta-ainekonjugaatteja ruiskutettiin 20 mm2 :n lasikuidulle ja kuivattiin 37 °C:ssa yön yli.

2.5. Päällystetyn nitroselluloosakalvon valmistaminen

Sivuvirtaustestiliuskan valmistamiseksi 6-MAM-BSA-antigeenit (0,6 mg ml-1) annosteltiin NC-kalvoille testiviivoiksi (T-viiva). Kontrolliviivat (C-viiva) päällystettiin vuohen anti-kanin polyklonaalisilla vasta-aineilla (0,15 mg ml-1). Päällystetyt NC-kalvot kuivattiin 37 °C:ssa yön yli. Arvioitiin yhdeksän kaupallista NC-kalvoa neljältä yritykseltä: Millipore (HF90, HF135 ja HF180), GE-Whatman (FF120HP ja AE100), Sartorius (CN95 ja CN150) ja Pall (Vivid90 ja Vivid170).

2.6. Herkkyys ja spesifisyys

Liuska on kilpailullinen määritys, ja molemmissa asemissa oli 6-MAM-liuskoja. Kun näyte sisältää 6-MAM:ää, se sitoutuu konjugoidulla tyynyllä olevaan nanokullalla leimattuun vasta-aineeseen. Ylimääräiset vasta-aineet jatkavat etenemistä kromatografista suuntaa pitkin kapillaaritoiminnan vuoksi ja sitoutuvat sitten 6-MAM-antigeeniin T-viivalla. T-viivan signaalin intensiteetti on suoraan yhteydessä näytteen 6-MAM-pitoisuuteen. Tummempi väri osoittaa alhaisempaa 6-MAM-pitoisuutta.

Negatiivinen suuneste kerättiin kuudelta henkilöltä ja siihen lisättiin 6-MAM:ia (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) herkkyysmääritystä varten. Kymmenen yleisesti väärinkäytettyä huumausainetta käytettiin LFS:n spesifisyyden tarkistamiseksi. Nämä huumeet olivat morfiini (MOP, 100 µg ml-1), kodeiini (COD, 100 µg ml-1), tetrahydrokannabinoli (THC, 10 µg ml-1), metyleenidioksimetamfetamiini (MDMA, 100 µg ml-1), ketamiini (KET, 100 µg ml-1), metyyliamfetamiini (MET, 100 µg ml-1), kokaiini (COC, 100 µg ml-1), metadoni (MTD, 100 µg ml-1), efedriini (EPH, 100 µg ml-1) ja pseudoefedriini (PEPH, 100 µg ml-1).

Tulokset ja keskustelu

3.1. 6-monoasetyylimorfiinin ja naudan seerumin albumiinikonjugaatin synteesi

NC-kalvot päällystetään yleensä ensin kantajaproteiinilla ennen vasta-aineen konjugointia. Linkkereitä käytetään rakenteellisen spesifisyyden säilyttämiseksi. Tässä tapauksessa 6-MAM-molekyyliin lisättiin ensin NHS-esteriryhmä kantajaproteiinin linkkeriksi. Tämä validoitiin Waters® Vion IMS Q-Tof -massaspektrometrillä. Löysimme aktivoidun 6-MAM:n ultrasuorituskykyisen nestekromatografian (UPLC) kromatogrammeista 8,8 minuutin kohdalla leveän piikin, jonka m/z oli 706,27645 (kuva 6) verrattuna ennustettuun m/z:aan 706,2758. Tämä osoittaa, että linkkeri oli onnistuneesti kiinnittynyt 6-MAM:iin. Tarkan synteesin merkitys on itsestään selvä, koska vain rakenne saadaan oikein määritettyä, ja tämä voi johtaa 6-MAM-vasta-aineiden paritukseen.

Emmekä käyttäneet gradienttidimetyylisulfoksididialyysiä, koska tuote on liukoinen ja edellinen konjugointiprotokolla on liian monimutkainen. BSA:lla oli useita piikkejä UPLC-kromatogrammissa (tietoja ei ole esitetty) eri analogien vuoksi. Tämä johti erilaisiin konjugointisuhteisiin. Tämän vuoksi UPLC-kromatogrammissa oli erilaisia piikkejä, jotka vastasivat eri konjugointisuhteita. Konjugaatiotulokset voitiin vahvistaa tehokkaammin antigeeni-vasta-aine-parin kuin konjugointisuhteen avulla.

3.2. Nitroselluloosakalvotyyppien valinta

NC-kalvot sitovat proteiineja sähköstaattisesti nitraattiesterin vahvan dipolin ja proteiinin peptidisidosten vahvan dipolin vuorovaikutusten kautta. Ominaisuudet, mukaan lukien kapillaarin virtausnopeus, signaalin intensiteetti ja tausta, arvioitiin, koska ne voivat vaikuttaa LFS:n lopulliseen suorituskykyyn. Lisäksi virtausnopeuteen kiinnitetään enemmän huomiota, koska se voi vaikuttaa proteiinin adsorptiokapasiteettiin ja jopa herkkyyteen. Kalvon virtausnopeus riippuu huokoisten rakenteiden aggregaattiominaisuuksista, kuten huokoskoko, huokoskokojakauma ja huokoisuus. Suurempi huokoskoko johtaa heikompaan proteiinien adsorptioon.

Vertailimme yhdeksää NC-kalvoa (taulukko 1). Jokainen testi toistettiin kolme kertaa ja keskimääräinen tulos kirjattiin ylös. LFS-tulokset mitattiin 3 minuutissa, ja paras näytteen virtausnopeus oli alle 20 s cm-1. Signaalin voimakkuus T-viivalla tarvittiin myös normaalilla tasolla. Syvempi taustaväri haittasi tarkkuutta. Millipore HF135 -kalvo oli paras valinta 6-MAM:lle näytteen virtausnopeuden, signaalin intensiteetin T-viivalla ja taustavärin kokonaisvaltaisen tarkastelun jälkeen.

3.3. Näytetyyny

Näytetyynyn käsittelyyn tarkoitettu liuos on erittäin tärkeä testin kannalta, koska se toimi reaktiopuskurijärjestelmänä, kun suun nestenäytteet rehydratoivat tyynyn. Liuos sisältää yleensä puskurijärjestelmän, jossa on sopiva ionivahvuus ja pH-arvo; jotkin estävät aineet ja pinta-aktiiviset aineet voivat nopeuttaa suunesteen virtausnopeutta kalvolla. Näytetyyny käsittelee suunesteen matriisivaikutusten monimutkaisuutta ja tekee siitä yhteensopivan NC-kalvon kanssa. Lisäksi puskurijärjestelmä varmistaa analyyttien vapautumisen ja vakauttaa virtausnopeuden, koska suuneste on liian viskoosia.

Harkittiin neljää eri kaavaa. Liuoskaavat on esitetty taulukossa 2. Tulokset osoittivat, että puskurijärjestelmä 4, jossa on pinta-aktiivinen aine STANDAPOL ES-1 (S7), antoi parhaan tuloksen näytteen virtausnopeudella 17 s cm-1, signaalin intensiteetti oli normaali ja tausta valkoinen. Pinta-aktiivinen aine S7 on vahva anioninen pinta-aktiivinen aine, joka tarjoaa vahvemman pesukyvyn kuin S17 ja S9.

3.4. Suunesteiden kerääminen

Suunesteiden kerääminen on vaikeampaa kuin virtsan kerääminen niiden suuren viskositeetin vuoksi. Suunesteen keräysvälineitä on monenlaisia: vanupuikkoja, sieniä, muoviputkia ja kuppeja. Joillakin menetelmillä suun nesteitä stimuloidaan etikan, suuvesien, pastillien jne. avulla. Tällainen stimulaatio voi kuitenkin muuttaa suunesteen analyyttien pitoisuuksia, ja se on monimutkaisempaa ja aikaa vievämpää. Keräsimme lopulta suunesteen suoraan suusta sieni-adsorbentilla (ESSENTRA, Iso-Britannia), joka on sopivan huokoskoon omaavien polymeerikuitujen seos.

Kahdenlaiset sieni-adsorbentit (K1 ja K2) suunniteltiin mittatilaustyönä, ja molempien sienityynyjen rakenteet on esitetty kuvassa 7. K2 oli paljon löysempi ja säännöllisempi suhteessa K1:een. Molempia arvioitiin testaamalla nesteenkäsittelyn suorituskykyä, mukaan lukien veden tiputtaminen sienityynylle, lopullisen LFS:n laittaminen negatiiviseen kaliumfosfaattipuskuriin (pH = 7,0) ja lopullisen LFS:n laittaminen suuhun. K2-sienen näytteen virtausnopeus oli kaksi kertaa nopeampi (keskimäärin 20 s cm-1) kuin K1-sienen näytteen virtausnopeus vedellä, PBS-puskurilla tai todellisilla suunesteillä. Tämä on erittäin tärkeä asia suunesteiden testauksessa. Yhteenvetona voidaan todeta, että K2-sieni valittiin sen erinomaisen suorituskyvyn vuoksi suun nestenäytteiden käsittelyssä.

3.5. Herkkyys ja spesifisyys

Pienet molekyylit havaitaan yleensä kilpailevan määrityksen avulla LFS:ssä. Tässä T-linjassa ei ole signaalia (punainen viiva). Tämä edustaa 6-MAM:n pitoisuutta näytteessä, joka on raja-arvon yläpuolella. Suunesteen testauksen herkkyyden pitäisi olla paljon suurempi kuin virtsatestin, koska huumeiden metaboliittien pitoisuus suunesteessä on alhainen. Tässä onnistuttiin tekemään 6-MAM:n kvalitatiivinen LFS, jonka herkkyys on 4 ng ml-1 , mikä täyttää suunesteen yleisiä havaitsemisrajoja koskevat vaatimukset. Tulokset on esitetty kuvassa 8. Lisäksi kuvassa 9 esitetään spesifisyys suhteessa yleisesti väärinkäytettyihin huumeisiin. 6-MAM:n LFS oli spesifinen 6-MAM:lle ilman ristireaktioita erityisesti morfiinin tai kodeiinin kanssa.

Johtopäätös

6-MAM on heroiinin spesifinen metaboliitti. Raportoimme tässä 6-MAM:n LFA:n erityisellä konjugaatilla, joka on yhdistetty spesifiseen vasta-aineeseen. Valmistimme konjugaatin, joka yhdisti 6-MAM:n kantajaproteiiniin C3-asemassa olevan NHS-esteriryhmän kautta (kuva 10). Tässä vasta-aine tunnisti 6-MAM:n asetyyliryhmän. Tämä on edellytys 6-MAM:n spesifisyydelle. Lopuksi teimme erittäin herkän LFS-testin, jossa ei esiintynyt ristireaktioita 10 yleisesti väärinkäytetyn lääkkeen, kuten morfiinin ja kodeiinin, kanssa. Määritimme oikeat NC-kalvot, näytetyynyn, huokoskoon ja sieniadsorbentin, jotta voimme tehdä testin, jossa käytetään suun nesteitä hoitopaikassa.

Yllämainittujen etujen ansiosta suun nestenäytteen 6-MAM-LFS:ää voitaisiin soveltaa sekä tutkimus- että teollisuuskäyttöön. Se voisi auttaa poliisia säästämään työvoimaa ja aikaa/kustannuksia alustavassa seulonnassa. Suunesteet ovat käteviä ja vähemmän invasiivisia, ja ne soveltuvat liikenteen seulontaan. Johtopäätöksenä voidaan todeta, että 6-MAM:iin tähtäävä suunesteen LFS heroiinin väärinkäyttöä varten on lupaava tuote huumaantuneen ajamisen torjumiseksi.

Etiikka

Heroininäytteiden tutkimuskäyttöä valvoi Kiinan yleisen turvallisuuden ministeriön kolmas tutkimuslaitos. Kaikki kirjoittajat ilmoittavat noudattavansa eettisiä normeja.

Tietojen saatavuus

Tiedot on talletettu Dryad Digital Repositoryyn: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Tekijöiden panos

L.Z. suunnitteli tämän tutkimuksen, ja X.H ja J.Z. auttoivat suorittamaan kuvien 4 ja 5 kokeet. F.C. ja Y.Z. suorittivat kuvassa 6 esitetyt tutkimukset. J.L. analysoi tiedot ja kirjoitti artikkelin. Kaikki kirjoittajat antoivat lopullisen hyväksyntänsä julkaisulle.

Kilpailevat intressit

Vakuutamme, ettei meillä ole kilpailevia intressejä.

Rahoitus

Tälle artikkelille ei ole saatu rahoitusta.

Vapautuslauseke

Tässä ilmaistut mielipiteet, havainnot ja johtopäätökset tai suositukset ovat kirjoittajien omia.

Alaviitteet

Tämän artikkelin on toimittanut Royal Society of Chemistry, mukaan lukien toimeksianto, vertaisarviointiprosessi ja toimitukselliset näkökohdat hyväksyntään asti.