L-arabinoosin fermentoinnin parantaminen muuttamalla aineenvaihduntatietä ja kuljetusta Saccharomyces cerevisiae -bakteerissa

Abstract

L-arabinoosin hyödyntämisreitti luotiin Saccharomyces cerevisiae -bakteerissa ilmentämällä Lactobacillus plantarum -bakteerista peräisin olevia koodonioptimoituja araA-, araB- ja araD-geenejä. TAL1-, TKL1-, RPE1-, RKI1- ja GAL2-geenien yliekspressoinnin ja adaptiivisen evoluution jälkeen rekombinanttikannan L-arabinoosin hyödyntämisestä tuli tehokasta. Tuloksena syntyneen kannan maksimaalinen spesifinen kasvunopeus oli 0,075 h-1, maksimaalinen spesifinen L-arabinoosin kulutus 0,61 g h-1 g-1 kuivasolupainoa ja lupaava etanolin tuotto 0,43 g g-1 L-arabinoosikäymisestä.

1. Johdanto

Fossiilisista polttoaineista riippuvuuden vähentämiseksi bioetanolin maailmanlaajuista tuotantoa lisättiin ~45 miljoonasta litrasta vuonna 2005 ~113 miljardiin litraan vuonna 2012 . Tulevaisuudessa polttoaineetanolin laajamittainen tuotanto perustuu todennäköisesti runsaisiin lignoselluloosamateriaaleihin sokerin ja viljan sijasta, jotka ovat ihmisten ja eläinten ravintoa . Kustannustehokas polttoaine-etanolin tuotanto lignoselluloosamateriaaleista edellyttää raaka-aineiden täysimääräistä hyödyntämistä. Yksi bioetanolin tuotannon tavoitteista on antaa fermentoivalle mikro-organismille kyky muuntaa kaikki lignoselluloosamateriaalien sisältämät sokerit. Lignoselluloosamateriaaleista voidaan ottaa talteen noin 3-15 prosenttia L-arabinoosia. Siksi on tarpeen rakentaa L-arabinoosia fermentoiva mikro-organismi tämän sokerin hyödyntämisen lisäämiseksi .

Sienissä ja bakteereissa on kahdenlaisia L-arabinoosin aineenvaihduntateitä. Aldoosireduktaasi (AR), L-arabitoli-4-dehydrogenaasi (LAD), L-ksyluloosareduktaasi (LXR) ja D-ksylitolidehydrogenaasi (XDH) muodostavat sienien L-arabinoosin aineenvaihduntareitin. AR:n ja LXR:n katalysoima reaktio on kytketty NADPH:n hapettumiseen NADP+:ksi, ja LAD ja XDH käyttävät NAD+:a kofaktorina. Tuotettu ksyluloosa fosforyloituu ja siirtyy pentoosifosfaattireitille (PPP). Bakteerien L-arabinoosimetaboliareitti on kofaktori-riippumaton, ja se koostuu L-arabinoosi-isomeraasista (AraA), L-ribulokinaasista (AraB) ja L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeeraasista (AraD). Tuotettu D-ksyluloosa-5-fosfaatti kulkeutuu PPP:hen. Molemmat L-arabinoosin aineenvaihduntareitit vakiintuivat Saccharomyces cerevisiae -bakteerissa, joka on perinteinen etanolia tuottava mikro-organismi, jolla on erinomainen sokereita fermentoiva kapasiteetti ja sietokyky ankarassa ympäristössä, mutta se ei pysty fermentoimaan L-arabinoosia . Ei ole yllättävää, että rekombinantti-S. cerevisiae -kannassa, joka sisältää sienen L-arabinoosin aineenvaihduntareitin, esiintyy redox-tasapainottomuutta. Sivutuotteen L-arabitolin saanto oli jopa 0,48 g g-1 pentoosisokeria, joka kulutettiin D-ksyloosin ja L-arabinoosin kofermentaatiossa, vaikka kanta, joka ilmentää NADH:ta mieluummin AR:ää ja LXR:ää redox-epätasapainon pienentämiseksi .

Vertailtuna sienien L-arabinoosin aineenvaihduntareittiin bakteereitti on yksinkertaisempi ja kofaktorista riippumaton. Koska bakteerien L-arabinoosin metaboliareittiin osallistuvien entsyymien tehokkaat aktiivisuusmääritykset puuttuvat, tämän reitin optimointi S. cerevisiaessa ei kuitenkaan ollut suoraviivaista. Escherichia colin araA-, araB- ja araD-geenejä ilmentävä S. cerevisiae -kanta ei pystynyt hyödyntämään L-arabinoosia. Kuitenkin sen jälkeen, kun E. colin L-arabinoosi-isomeraasigeeni oli korvattu Bacillus subtiliksesta kloonatulla araA:lla, kanta pystyi kasvamaan ja tuottamaan etanolia L-arabinoosilla useiden sopeutumiskierrosten jälkeen. Lisäksi L-arabinoosin hyödyntämistä parannettiin entisestään muuttamalla bakteerien araA-, araB- ja araD-geenien koodonien käyttö hiivan haluamiksi koodoneiksi . Lactobacillus plantarumin L-arabinoosia metaboloivat geenit vastasivat S. cerevisiaen koodoninkäyttöä paremmin kuin aiemmin raportoidut geenit. Wisselink et al. toivat L. plantarumin araA:n ja araD:n useita kopioita ja L. plantarumin araB:n yhden kopion S. cerevisiaeen. Epäoksidatiivisen PPP:n entsyymejä koodaavien geenien yliekspressoinnin ja laajan adaptiivisen evoluution jälkeen tuloksena syntyneellä kannalla oli korkea etanolin tuotto, jopa 0,43 g g-1, anaerobisessa kasvussa L-arabinoosilla ja suuri arabinoosin kulutusnopeus (0,70 g h-1 g-1 solujen kuivapainoa (DCW)). Kehittyneemmän kannan metabolomi-, transkriptomi- ja aineenvaihduntavirta-analyysi osoitti, että galaktoosin kuljettajan, transketolaasin ja transaldolaasin isoentsyymien korkeammat ekspressiotasot hyödyttävät S. cerevisiaen kasvua L-arabinoosilla .

Tässä työssä L. plantarumin ainutlaatuiset koodonioptimoidut araA-, araB- ja araD-geenit ekspressoitiin erilaisilla tasoilla S. cerevisiae -kannassa CEN.PK102-3A. Seuraavaksi PPP:hen osallistuvia geenejä TAL1, TKL1, RPE1 ja RKI1 yliekspressoitiin tässä rekombinanttikannassa. Tuloksena syntynyt kanta valittiin peräkkäin L-arabinoosilla aerobisissa olosuhteissa ja happirajoitetuissa olosuhteissa. Saatiin kanta, jonka L-arabinoosin hyödyntämiskyky oli merkittävästi parantunut. Kehittyneiden kantojen ja sen kannan, joka yliekspressoi myös kuljettajageeni GAL2:ta, L-arabinoosin aineenvaihduntakapasiteettia tutkittiin. L-arabinoosan aineenvaihdunnan tehokkuuteen vaikuttavia tekijöitä käsitellään.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät. Elatusaineet ja viljelyolosuhteet

Hiivan viljelyyn käytettiin hiivasynteettistä täydellistä elatusainetta (SC), joka sisälsi 1,7 g L-1 hiivan typpipohjaa (YNB, Sangon, Kiina) ja 5 g L-1 ammoniumsulfaattia (Sangon, Kiina) sekä lisähiililähteinä glukoosia (Sangon, Kiina) tai L-arabinoosia (Sinopharm, Kiina). Täydellistä lisäaineseosta, 0,77 g L-1 CSM-URA tai 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), lisättiin tarvittavien plasmidien ylläpitämiseksi tarvittaessa auxotrofisella valinnalla. KanMX4-markkerilla varustettuja kantoja varten väliaineeseen lisättiin 200 g ml-1 antibioottia G418-sulfaattia (Promega, Madison, WI, USA). Kaikkia hiivoja kasvatettiin 30 °C:ssa.

2.2. Koodonin sopeutumisindeksin analyysi

Koodonin sopeutumisindeksiä (CAI, Codon Adaptation Index) käytetään havainnollistamaan koodonin käytön preferenssiä tietyissä lajeissa . CAI-analyysissä käytettiin CODONW-ohjelmaa (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw).

2.3. Plasmidin ja kannan rakentaminen

E. coli DH5:tä käytettiin subkloonaukseen. Tässä tutkimuksessa käytetyt S. cerevisiae -kannat ja plasmidit on lueteltu taulukossa 1. Tässä tutkimuksessa käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa 2.

Yksilölliset koodonioptimoidut araA-, araB- ja araD-geenit, jotka koodaavat L-arabinoosi-isomeraasia (GenBank: CCC80517.1), L-ribulokinaasia (GenBank: CCC80519.1) ja L-ribuloosa-5-fosfaatti-4-epimeraasia (GenBank: CCC80518.1) L. Plantarum syntetisoitiin keinotekoisesti ja ligatoitiin HXT7-promoottorin ja PGK1-terminaattorisekvenssien väliin plasmidissa pHX, joka rakennettiin korvaamalla plasmidin YEp24-PGKp PGK1p HXT7p:llä, joka sisälsi restriktioentsyymien Kpn I ja Sma I paikat. HXT7p-araD-PGK1t-fragmentti monistettiin PCR:llä, jossa oli restriktioentsyymien Hind III ja Bln I terminaalikohdat, ja sitten se lisättiin YIp5:n Hind III- ja Nhe I -kohtiin, jolloin saatiin plasmidi YIp5-araD. HXT7p-araA-PGK1t-fragmentti, joka sisältää terminaaliset Bgl II- ja Sal I -kohdat, lisättiin YIp5-araD:n BamH I- ja Sal I -kohtiin, jolloin saatiin plasmidi YIp5-araAD. HXT7p-araB-PGK1t-fragmentti, jossa on Eag I- ja Stu I -paikat, lisättiin YIp5-araAD:n Eag I- ja Stu I -paikkoihin, jolloin saatiin plasmidi YIp5-ara (kuva 1(a)). TEF1-promoottorifragmentti (jossa on Hind III:n ja Sal I:n terminaalipaikat) ja PGK1-terminaattorifragmentti (jossa on BamH I:n ja Hind III:n terminaalipaikat) kloonattiin plasmidista pJFE3 ja pYMIKP. Nämä kaksi fragmenttia ligatoitiin ja lisättiin plasmidiin pYX242, jotta saatiin rakennettua vektori pYX242-WS, jossa on kaksi aluetta, joita voidaan käyttää geenien ilmentämiseen. Tämän jälkeen geeni araA lisättiin tämän vektorin Sal I- ja Sac I-kohtien väliin TEF1-promoottorin ja PloyA-terminaattorin ohjaamana sen ilmentämiseksi, ja tuloksena saatu plasmidi nimettiin pYX2422-TEF1araA:ksi (kuva 1(b)). Plasmidi pYX2422-HXT7araA (kuva 1 b) rakennettiin käyttämällä HXT7p:n fragmenttia plasmidin pYX2422-TEF1araA:n TEF1p-fragmentin syrjäyttämiseksi; liitokset olivat BamH I- ja Sal I-tunnistusjaksoja. Geeni GAL2 kloonattiin CEN.PK102-3A:n kromosomaalisesta DNA:sta ja lisättiin sitten plasmidin pJFE3 Xba I- ja Sal I-kohtiin, jolloin saatiin plasmidi pJFE3-GAL2. Plasmidin pJFE3-GAL2 Nde I- ja Apa I-kohtien välinen URA3-fragmentti korvattiin pUG6:sta kloonatulla KanMX4-geenillä, jolloin saatiin plasmidi pJFE318-GAL2 (kuva 1 c).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 1

Plasmidien fysikaaliset kartat (a) YIp5-ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA ja (c) pJFE318-GAL2.

Hiivan transformaatio suoritettiin litiumasetaattitransformaatiomenetelmällä . Plasmidi YIp5-ara linearisoitiin Stu I -kohdassa ja muunnettiin sitten CEN.PK102-3A:han. Transformantit, joissa araA-, araB- ja araD-geenit oli integroitu kromosomaaliseen URA3-geeniin, valittiin CSM-URA:ta sisältävässä SC-mediumissa, ja sen jälkeen, kun se oli varmistettu sekvensoinnilla, haluttu transformantti nimettiin BSW1A1:ksi. BSW1A1:een transformoitiin plasmidit pYX242, pYX2422-HXT7araA ja pYX2422-TEF1araA, jolloin saatiin BSW1AY, BSW1A7 ja BSW1AT. Linearisoitu pJPPP3, joka sisältää geenien TAL1, TKL1, RPE1 ja RKI1 ekspressiokehykset, integroitiin BSW1AT:n kromosomiin GRE3-geenin lokuksen kohdalle, jolloin saatiin kanta BSW2AP. Kanta BSW2AP sopeutettiin 20 g L-1 L-arabinoosilla aerobisissa olosuhteissa ja sitten happirajoitetuissa olosuhteissa. Kun stationaarivaihe oli saavutettu, uusi erä aloitettiin siirtämällä viljely tuoreeseen väliaineeseen, jonka alkuperäinen biomassa oli 0,15 g DCW L-1. Kun kannan kaksinkertaistumisaika vakiintui, sopeutuneista mutanteista valittiin mutantti BSW3AP sen erinomaisen L-arabinoosikasvun perusteella. Tämän jälkeen plasmidi pJFE318-GAL2 transformoitiin kantaan BSW3AP, jolloin saatiin kanta BSW3AG.

2.4. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Soluja kasvatettiin SC-väliaineessa, joka sisälsi 20 g L-1 glukoosia, ja ne kerättiin, kun viljelmien OD600 saavutti arvon 1. Kokonais-RNA uutettiin TRIzol-reagenssilla (Sangon, Kiina). cDNA:n ensimmäinen säie käänteistranskriboitiin 1 g:sta kokonais-RNA:ta käyttäen PrimeScript RT -reagenssipakkauksia, joissa oli gDNA Eraser (Takara, Japani). Laimennettuja cDNA-tuotteita käytettiin reaaliaikaiseen kvantitatiiviseen PCR:ään käyttäen SYBR Green Real-time PCR Master Mix -seosta (TOYOBO, Japani) ja LightCycle PCR System -järjestelmää (Roche Molecular Biochemicals, Saksa). Aktiinia koodaavaa ACT1-geeniä käytettiin vertailugeeninä normalisoinnissa. Reaaliaikaisen PCR:n tiedot laskettiin menetelmän mukaisesti. PCR:n alukkeet lueteltiin taulukossa 2.

2.5. Fermentaatio

Yksittäistä pesäkettä viljeltiin yön yli SC-väliaineessa, joka sisälsi 20 g L-1 glukoosia. Näyte yön yli kestävästä viljelmästä laimennettiin alkuvaiheen OD600-arvoon 0,5 SC-mediassa, joka sisälsi 10 g L-1 glukoosia ja 10 g L-1 L-arabinoosia. Solut kerättiin 10 tunnin viljelyn jälkeen ja käytettiin fermentointiin. Kaikki ravistelupullokäymiset suoritettiin 30 °C:ssa, 200 r min-1, 200 ml:n ravistelupulloissa, jotka sisälsivät 40 ml elatusainetta. Happirajoitetut olosuhteet ylläpidettiin käyttämällä kumitulppaa. Panosfermentoinnit anaerobisissa olosuhteissa suoritettiin 1,4 litran fermentoreissa (Infors AG, Sveitsi), joiden työtilavuus oli 900 ml. Anaerobisia olosuhteita ylläpidettiin sparraamalla typellä (0,1 L min-1); sekoitusnopeus oli 500 r min-1. pH pidettiin 5,0:ssa pumppaamalla automaattisesti 1 mol L-1 NaOH ja 1 mol L-1 H3PO4 . Alkuperäinen biomassa oli 0,2 g DCW L-1. Hiililähteenä SC plus CSM-LEU-URA-alustassa oli 20 g L-1 L-arabinoosia; BSW3AG-kannan fermentoinnissa annettiin 200 g mL-1 G418:ta. Kehittyneiden kantojen ja kehittymättömien kantojen solujen kuivapaino laskettiin kaavalla kuivapaino (mg ml-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 ja kuivapaino (mg ml-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149.

2.6. Käymistuotteiden analysointi

Sokerien ja metaboliittien pitoisuuksien määrittämiseen käytettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japani), joka oli varustettu taitekerroinilmaisimella RID-10A (Shimadzu, Japani). Aminex HPX-87P -ioninvaihtokolonnia (Bio-Rad, Yhdysvallat) käytettiin L-arabinoosin, arabitolin ja etanolin analysoimiseen 80 °C:n lämpötilassa liikkuvan faasin ollessa vettä virtausnopeudella 0,6 ml min-1. Aminex HPX-87H -ioninvaihtokolonnia (Bio-Rad, Hercules, USA) käytettiin glyserolin ja asetaatin analysointiin 45 °C:ssa käyttäen liikkuvana faasina 5 mmol L-1 H2SO4:ää .

3. Tulokset

3.1. Ioninvaihtokolonni. L-arabinoosipolkuun osallistuvien koodonioptimoitujen geenien ilmentyminen S. cerevisiae -bakteerissa

L-arabinoosi-isomeraasin (GenBank-tunnus CCC80517.1), L-ribulokinaasin (GenBank-tunnus CCC80519.1) ja L-ribuloosi-5-fosfaatti-4-epimeeraasin (GenBank accession no. CCC80518.1), jotka on kirjattu National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) -tietokantaan, L. plantarumin araA-, araB- ja araD-geenit syntetisoitiin keinotekoisesti käyttäen S. cerevisiae:n ensisijaisia koodoneja. Koodonioptimoitujen araA:n, araB:n ja araD:n CAI:t olivat vastaavasti 0,599, 0,580 ja 0,646, jotka olivat korkeammat kuin natiivien sekvenssien CAI:t (0,324, 0,223 ja 0,243).

Koodonioptimoitujen araA:n, araB:n ja araD:n ekspressiokasetit integroitiin CEN.PK102-3A-kannan kromosomiin, jolloin saatiin kanta BSW1A1. BSW1A1 ei kuitenkaan kyennyt kasvamaan L-arabinoosilla, vaikka näiden geenien transkriptoituneet mRNA:t olivat kaikki havaittavissa. Tämän jälkeen BSW1A1:een lisättiin lisää araA-kopioita, joita kannettiin episomaalisella plasmidilla pYX242 ja jotka ilmentyivät HXT7- ja TEF1-promoottorien valvonnassa. Näin saatujen kantojen BSW1A7 ja BSW1AT araA:n transkriptiotasot olivat -kertaisia ja -kertaisia suuremmat kuin referenssikannassa BSW1AY, joka kantaa vain integroitua, ekspressoitua araA:ta. BSW1A7- ja BSW1AT-kantoja inkuboitiin aerobisesti L-arabinoosilla, ja BSW1AT-kannan kasvu havaittiin ~150 tunnin kuluttua, kun taas BSW1A7-kanta ei pystynyt kasvamaan, vaikka sitä kasvatettiin pidempään.

3.2. L-arabinoosin hyväksikäytön parantaminen S. cerevisiae -bakteerissa tekniikan ja evoluution avulla

TAL1-, TKL1-, RPE1- ja RKI1-geenit, jotka osallistuvat nonoksidatiiviseen pentoosifosfaattireittiin, yliekspressoitiin yksittäisessä pesäkkeessä, joka oli eristetty 150 h kestäneestä BSW1AT-viljelystä integroimalla linearisoitunut plasmidi pJPPP3 kromosomiin. Tuloksena syntynyt kanta, BSW2AP, kehittyi L-arabinoosilla. Yhdeksän siirron jälkeen aerobisissa olosuhteissa ja 12 siirron jälkeen happirajoitetuissa olosuhteissa viljelmän kaksinkertaistumisaika lyheni 22 h:sta 4,5 h:iin. Mutantteja seulottiin L-arabinoosilevyillä, ja suuri pesäke valittiin ja nimettiin BSW3AP:ksi.

Kantojen BSW1AT, BSW2AP ja BSW3AP geenien transkriptiotasot määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä (kuva 2). BSW2AP:n araA:n ilmentymistaso oli 2-kertainen BSW1AT:hen verrattuna, kun taas araB:n ja araD:n ilmentymistasot BSW2AP:ssa olivat alhaisemmat. Nämä muutokset saattavat johtua mutaatioista, joita tapahtui BSW1AT:n viljelyn aikana L-arabinoosilla. Kehittyneessä kannassa BSW3AP kaikki kolme geeniä ilmentyivät korkealla tasolla. BSW3AP-kannan araA-, araB- ja araD-ekspressiotasot olivat 4,1-kertaiset, 1,6-kertaiset ja 2,5-kertaiset kantaan BSW1AT verrattuna.

Kuva 2

Kantojen BSW2AP ja BSW3AP araA:n (mustat pylväät), araB:n (harmaat pylväät) ja araD:n (tyhjät pylväät) ilmentyminen verrattuna kantaan BSW1AT. Näiden geenien mRNA-tasojen kertaiset muutokset on normalisoitu ACT1:n ilmentymiseen. Testattuja kantoja kasvatettiin 20 g L-1 glukoosilla. Annetut arvot on saatu kolmesta riippumattomasta mittauksesta.

Kantojen BSW1AT, BSW2AP ja BSW3AP L-arabinoosin hyväksikäyttöä verrattiin ravistelupulloissa happirajoitetuissa olosuhteissa (kuva 3); alkuperäinen OD600 oli 0,5. BSW1AT-kannalla ei havaittu kasvua 120 tunnin kuluessa. Kanta BSW2AP kasvoi L-arabinoosilla suurimmalla spesifisellä kasvunopeudella () 0,011 h-1; 4,4 g L-1 L-arabinoosia kulutettiin ja 1,2 g L-1 etanolia tuotettiin 120 tunnin fermentoinnin aikana. Sitä vastoin kehittyneen kannan BSW3AP nopeus kasvoi 0,23 h-1:een. Kun käymistä oli kestänyt 120 tuntia, 18,6 g L-1 L-arabinoosia oli kulutettu, ja suurin ominaiskulutusnopeus oli 0,7 g h-1 g-1 DCW; etanolia oli tuotettu 6,9 g L-1 ja etanolin tuotto oli 0,43 g g-1; vain 0,13 g L-1 L-arabitolia oli kertynyt.

(a)

(b)

(a)

(b)

(a)

(a)
(b)
(c)
(d)

Kuvio 3

L:n-arabinoosikantojen käyminen ravistelupulloissa. BSW1AT:n (▲), BSW2AP:n (■) ja BSW3AP:n () kasvukyky (a), L-arabinoosin kulutus (b), arabitolin muodostuminen (c) ja etanolin muodostuminen (d). Kantoja viljeltiin 40 ml:ssa SC-väliaineessa, jossa oli 20 g L-1 L-arabinoosia 30 °C:ssa, 200 r min-1 ja OD600:n alkuarvo oli 0,5. Tiedot ovat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoja.

3.3. Kokeiden tulokset. GAL2:n yliekspressio paransi kehittyneen kannan L-arabinoosan anaerobista fermentointia

Galaktoosipermeaasigeeni GAL2 yliekspressoitiin BSW3AP:ssä, jolloin saatiin kanta BSW3AG. Kanta BSW3AP:n ja BSW3AG:n anaerobisen L-arabinoosifermentaation ominaisuuksia tutkittiin (kuva 4 ja taulukko 3) bioreaktoreissa. Kanta BSW3AP kasvoi L-arabinoosilla suurimmalla ominaiskasvunopeudella 0,067 h-1. L-arabinoosin suurin ominaiskulutusnopeus oli 0,49 g h-1 g-1 DCW. Etanolia tuotettiin suurimmalla ominaisnopeudella 0,20 g h-1 g-1 DCW, ja sen tuotto oli 0,42 g g-1. GAL2:n yliekspressio paransi merkittävästi L-arabinoosin fermentointikapasiteettia. BSW3AG:n suurin spesifinen kasvunopeus oli 0,075 h-1 , mikä oli 12 % nopeampi kuin BSW3AP:n. BSW3AG:n L-arabinoosin ominaiskulutusnopeus oli 0,61 g h-1 g-1 DCW, mikä oli 24 % nopeampi kuin BSW3AP:n. Etanolin tuotantonopeus oli 0,27 g h-1 g-1 DCW, ja etanolin tuotto oli 0,43 g g-1. Lisäksi sekä BSW3AP että BSW3AG tuottivat pieniä määriä glyserolia (1,4 g L-1 molemmilla kannoilla) ja lähes havaitsemattomia määriä arabitolia ja asetaattia.

Kanta μ max (h-1) Maksimi spesifinen L-arabinoosin kulutusnopeus (g h-1 g-1 DCW) Etanolin tuotantonopeus (g h-1 g-1 DCW) Etanolin tuotto (g g-1 L-arabinoosin kulutus) BSW3AP 0.067 0.49 0.20 0.42 BSW3AG 0.075 0.61 0.27 0.43

Taulukko 3

Maksimit spesifiset kasvunopeudet (), maksimit spesifinen L-arabinoosin kulutusnopeus, etanolin tuotantonopeus ja etanolin tuotto BSW3AP:lla ja BSW3AG:lla 20 g L-1 L-arabinoosilla.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 4

BSW3AP:n (a) ja BSW3AG:n (b) anaerobinen panosfermentaatio 20 g L-1 arabinoosilla. Tasot (■), arabinoosi (◆), etanoli (▲), glyseroli () ja asetaatti (×). Fermentointi suoritettiin 1,4 L fermentoreissa, joiden työtilavuus oli 900 ml. Anaerobisia olosuhteita ylläpidettiin sparraamalla typpeä (0,1 L min-1); sekoitusnopeus oli 500 r min-1. pH pidettiin 5,0:ssa pumppaamalla automaattisesti 1 mol L-1 NaOH ja 1 mol L-1 H3PO4. Alkuperäinen biomassa oli 0,2 g DCW L-1. Hiililähteenä SC plus CSM-LEU-URA-alustassa käytettiin 20 g L-1 L-arabinoosia, ja BSW3AG-kannan fermentoinnissa annettiin 200 g ml-1 G418:aa. Tiedot ovat kaksoismääritysten keskiarvoja.

4. Pohdinta

Sokerien täydellinen muuntaminen on tärkeää tehokkaalle ja kustannustehokkaalle polttoaine-etanolin tuotannolle lignoselluloosamateriaalista. Pienetkin parannukset substraatin hyödyntämisessä voivat vähentää merkittävästi koko prosessin kustannuksia . L-arabinoosi on lignoselluloosamateriaalien tärkeä komponentti. L. plantarumin L-arabinoosireitin ilmentäminen on osoittautunut tehokkaaksi L-arabinoosia hyödyntävän S. cerevisiaen rakentamisessa . Koska kodonioptimoidut geenit saattavat johtaa proteiinien lisääntyneeseen ilmentymiseen, tässä työssä L. plantarumin alkuperäiset araA-, araB- ja araD-geenit muokattiin vastaamaan S. cerevisiaen kodonikäyttöä, minkä jälkeen ne integroitiin CEN.PK102-3A-kannan kromosomiin. Tämä rekombinanttikanta ei kuitenkaan kyennyt kasvamaan L-arabinoosilla. Tämän jälkeen rekombinanttikantaan lisättiin lisää araA-geenin kopioita HXT7- ja TEF1-promoottorien ohjaamana. Kun näitä kahta tuloksena syntynyttä kantaa viljeltiin L-arabinoosilla, kasvua havaittiin vain TEF1-promoottorin valvonnassa araA:ta ilmentävän kannan viljelmissä, joissa araA:n transkriptiotaso oli 1,4-kertainen verrattuna HXT7-promoottorin valvonnassa araA:ta ilmentävään kantaan. Oletamme, että kasvua L-arabinoosilla voi tapahtua vain silloin, kun araA:n transkriptiotaso on tiettyä tasoa korkeampi. Sitä vastoin tähän rekombinanttikantaan tuotiin vain yksi kopio araB:stä ja araD:stä, ja näiden geenien transkriptiotasot olivat alhaisemmat kuin emokannassa. Nämä ilmiöt viittasivat siihen, että araB:llä ja araD:llä ei ollut niin suurta merkitystä L-arabinoosilla kasvamisen kannalta, koska vain yksi kopio näistä geeneistä mahdollisti sen, että rekombinanttikanta kasvoi L-arabinoosilla.

Adaptiivinen evoluutio osoittautui tehokkaaksi menetelmäksi parantaa kantojen metabolista tehokkuutta . Tässä tutkimuksessa evolvoitunut kanta BSW3AP osoittaa merkittävästi parempaa L-arabinoosia metaboloivaa kapasiteettia. Kaikkien kolmen geenin (araA, araB ja araD) lisääntynyt transkriptio saattaa osaltaan vaikuttaa parannukseen. Verrattuna araA:han ja araD:hen araB:n ilmentymistaso oli alhaisempi. Becker ja Boles raportoivat, että L-arabinoosimutaatio vähensi araB:n ilmentämää L-ribulokinaasiaktiivisuutta. Suhteellisesti alhaisempi araB:n ilmentyminen estää ATP:n ylikulutuksen, mikä edistäisi kannan kasvua L-arabinoosilla.

L-arabinoosi on uusi hiililähde S. cerevisiaelle. L-arabinoosin hyväksikäyttö S. cerevisiaessa riippuu pääasiassa heksoosikuljettaja Gal2p:n epäspesifisestä kuljetuksesta. Myös Hxt9p ja Hxt10p voivat kuljettaa L-arabinoosia, mutta tehokkuus on hyvin alhainen . On raportoitu, että GAL2:n yliekspressointi parantaa L-arabinoosin hyödyntämistä . Tässä tutkimuksessa GAL2:n yliekspressointi lisäsi huomattavasti kehittyneen kantamme BSW3AP:n kasvunopeutta ja L-arabinoosin kulutusnopeutta. Tämä tulos viittasi siihen, että teoreettinen L-arabinoosin aineenvaihduntavirta oli suurempi kuin BSW3AP:ssa havaitsimme. BSW3AP:n L-arabinoosin käyttöä rajoitti sen imeytymisnopeus. Kun GAL2:ta yliekspressoitiin, enemmän Gal2p:tä plasmakalvossa johti lisääntyneeseen L-arabinoosin ottoon ja edisti sitten L-arabinoosin hyödyntämistä. Tuloksemme vahvistivat edelleen kuljettajien merkitystä L-arabinoosin hyödyntämisessä; Gal2p:n affiniteetti L-arabinoosiin on kuitenkin alhainen, ja glukoosi esti kilpailukykyisesti sen sitoutumisen L-arabinoosiin . L-arabinoosispesifisen kuljettajan tehokkuuden parantaminen on vielä kesken.

5. Johtopäätökset

Monivaiheisen geenitekniikan ja adaptiivisen evoluution avulla saimme kannan BSW3AG, joka kasvaa L-arabinoosilla a:n ollessa 0,075 h-1. Suurin spesifinen L-arabinoosin kulutusnopeus on 0,27 g h-1 g-1 DCW, ja suurin etanolin tuotto on 0,43 g g-1 kulutettua L-arabinoosia, mikä on 84,3 % teoreettisesta määrästä. Korkea araA-ekspression taso on erityisen tärkeä tehokkaan L-arabinoosireitin luomisessa S. cerevisiae -bakteeriin, ja kehittyneiden kantojen L-arabinoosin imeytymiskyvyn parantamiseksi tarvitaan tehokkaampia kuljettajia.

Interressiristiriita

Tekijät ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Tätä työtä ovat tukeneet National Key Basic Research Program (2011CB707405), Kiinan kansallinen korkean teknologian tutkimus- ja kehitysohjelma Grant (2012AA022106), Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (30970091, 31070096 ja 31270151) ja Kiinan kansainvälinen S&T yhteistyöohjelma (2010DFA32560). Kirjoittajat kiittävät tohtori Peter Kötteriä Frankfurtin Johann Wolfgang Goethe-yliopistosta kannasta CEN.PK102-3A.

.