Laivamadon symbiontista Teredinibacter turnerae peräisin olevan AA10-lyyttisen polysakkaridien oksygenaasin löytäminen, aktiivisuus ja karakterisointi

Expression ja entsymaattisen karakterisoinnin suorittaminen laivamadon symbiontista T. turnerae

Gammaproteobakteeri T. turnerae on ainoa laivamatojen kiduksissa esiintyvä endosymbiontti, joka on onnistuttu eristämään, viljelemään ja jonka genomi on kartoitettu. Automaattisen annotoinnin ja manuaalisten BLAST-hakujen avulla ennustetusta T. turnerae -proteomista tunnistimme yhden geenin (NCBI Reference Sequence: WP_019602454.1), joka koodaa AA10 LPMO:ta (jäljempänä TtAA10A). Ennustetussa proteiinisekvenssissä on N-terminaalinen signaalipeptidi, LPMO-domeeni ja seriinirikas linkkialue, jota seuraa hiilihydraatteja sitova CBM10-domeeni (Kuva 1a). AA10:ltä on löydetty CBM2-, CBM3-, CBM5-, CBM10-, CBM12-, CBM18- ja CBM73-domeeneja (Bernard Henrissat, henkilökohtainen tiedonanto), ja niiden tiedetään olevan aktiivisia selluloosassa tai kitiinissä. CBM10-domeenin uskotaan sitovan selluloosaa, joten se voi tarjota selluloosan tunnistuksen, joka ei todennäköisesti liity katalyyttiseen tapahtumaan. Vaikka se eroaa AA10-proteiineihin yleisesti liitetyistä CBM:istä , sen esiintyminen TtAA10A -geenin domeenirakenteessa antaa viitteitä siitä, että tämä proteiini saattaa olla aktiivinen ensisijaisesti glukoosipohjaisilla polysakkarideilla.

Kun geeniä oli yritetty ilmentää useaan otteeseen erilaisilla affiniteetti- ja liukoisuustunnisteilla sekä erilaisilla erittymissignaaleilla, analyyseihin tarvittava proteiini saatiin vihdoin tuotettua tuottamalla C-terminaalisesti streptoketjuun merkityn katalyyttisen domeenin C-terminaalisesti merkityn LPMO:n katalyyttisen domeenin (His25:stä glykoliin 228) tuottamisella E. coli -organismeissa (kuva 1b). Puhdistettu merkattu proteiini kuormitettiin ylimääräisellä kuparilla, suolanpoisto koko-ekskluusiokromatografialla, puhtaus analysoitiin SDS-PAGE:lla (kuva 1c) ja massaspektrometriaan perustuvalla proteiinin tunnistuksella (ei esitetty), ja sitä käytettiin myöhempiin kokeisiin.

Rekombinantti TtAA10A:lla (vain katalyyttiset domeenit 25-228) on oikein taitetun AA10:n tunnusmerkit. Puhdistetun, Cu-kuormitetun TtAA10A:n lämpösiirtymäanalyysi (Thermofluor) osoittaa sulamislämpötilaksi (Tm) 50,4 °C. Kuparin poistaminen 10 mM EDTA:lla laskee Tm:n 42,5 °C:een, mikä viittaa metallikofaktorin proteiinia stabiloivaan vaikutukseen, kuten aiemmassa kirjallisuudessa on raportoitu muiden LPMO:iden osalta (esim. kuva 1d). Huomasimme myös vaihtelua proteiinivalmisteissa, sillä jotkin valmisteet sisälsivät yhden (aktiivisen keskuksen) Cu-atomin, kun taas toiset sisälsivät kaksi Cu-atomia, jotka kuvataan jäljempänä.

Aktiivisuusmääritykset, sekä yhden että kahden Cu-keskuksen näytteillä, suoritettiin erilaisilla kaupallisilla polysakkaridisubstraateilla (Avicel, β-kitiini kalmarin kynästä, α-kitiini katkaravun kuoresta, sello-heksaoosi, maissitärkkelys, pachyman, pyökkipuun ksylaani, glukomannaani, ksyloglukaani, jäkälätärkkelys, galaktaani, galaktomannaani ja mannaani) pelkistävän kofaktorin, gallushapon, läsnä ollessa. Näytteet analysoitiin 24 tunnin kuluttua MALDI-TOF MS -menetelmällä, ja reaktiotuotteiden piikkimassoja verrattiin aiemmin julkaistuihin tietoihin, jolloin havaittiin sekalainen C1-C4-hapettumiskuvio, joka kohdistui yksinomaan selluloosaan ja oli riippuvainen elektroninluovuttajan läsnäolosta (kuvat 2a, b). Tuotteita ei havaittu yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa (lisätiedosto 1: kuva S1). MALDI-TOF MS-analyysi raa’asta uutteesta, joka saatiin aktiivisuusmäärityksistä, jotka suoritettiin Cu:lla ladatulla TtAA10A:lla 10 mM EDTA:n läsnäollessa, ei pystynyt havaitsemaan tuotteiden vapautumista (tietoja ei ole esitetty), mikä osoittaa, että kupari on odotetusti välttämätön aktiivisuuden kannalta.

Synergiakokeet suoritettiin rinnakkain inkuboimalla TtAA10A:ta ja kaupallisia glykosidihydrolaaseja (GH6 ja GH9) Avicelin ja galliinihapon läsnäollessa, ja tuloksena syntyneet mono- ja oligosakkaridit kvantifioitiin korkean suorituskyvyn anioninvaihtokromatografialla (High Performance Anion Exchange Chromatography, HPAEC). Vaikka reaktiot, jotka sisälsivät joko LPMO:ta tai GH:ta yksinään, vapauttivat vähäisiä määriä vapaita sokereita, yhteisinkubointireaktiot osoittivat voimakasta synergististä vaikutusta, jota elektroninluovuttajan läsnäolo lisäsi entisestään (kuva 2c, d, lisätiedosto 2: kuva S2). On syytä huomata, että molemmat kaupalliset GH:t (GH6 ja GH9), joita testattiin näissä kokeissa, kuuluvat perheisiin, jotka tunnistettiin laivamatojen ruoansulatuksen proteomissa runsaimmin esiintyviksi, mikä vahvistaa edellä mainittujen aktiivisuusmääritysten biologista merkitystä puun sulatuksen kannalta laivamatomiljöössä.

Elektroniparamagneettinen resonanssispektroskopia

Ensimmäiset todisteemme siitä, että jotkin proteiinipreparaatit sisälsivät kahta Cu-aluetta, saimme EPR-analyyseistä. Cu-kyllästetyn TtAA10A:n jäädytetyn liuoksen (165 K) X-kaistan CW-EPR-spektrissä (kuva 3) näkyi kaksi hyperfiinipiikkisarjaa spektrin rinnakkaisella alueella, mikä osoitti kahden erilaisen kuparikoordinaatiogeometrian läsnäolon, jotka johtuvat joko erilaisista koordinaatioympäristöistä yhden paikan sisällä (esim. ligandien protonoitumistilojen eroista) tai erillisestä toisesta kuparia sitovasta paikasta. Spektrin rinnakkaisen alueen tarkka simulaatio saatiinkin aikaan kahdella eri lajilla, joista kummallakin oli erilaiset spin-Hamiltonian-parametrit gz = 2,267 ja |Az| = 425 MHz (laji 1) ja gz = 2,314 ja |Az| = 465 MHz (laji 2) (taulukko 1), jolloin lajien 1 ja 2 välinen suhde oli noin 3:2. Lajin 2 gz-arvo on korkea verrattuna siihen, mitä voitaisiin odottaa tyypilliselle AA10 LPMO:n kuparikoordinaatiolle aktiivisessa keskuksessa (LPMO:iden spektroskopiaa on hiljattain tarkasteltu artikkelissa Ref. ), minkä perusteella määrittelemme lajin 1 olevan kupari, joka on sitoutunut kanoniseen histidiinihaarukan aktiiviseen keskukseen. Sen spin-Hamiltonian-arvot ovat tyypillisiä aksiaaliselle Cu-koordinaatiogeometrialle, joka sisältää sekoituksen N- ja O-luovuttavia ligandeja . (Huomattakoon, että laji 2 ei voi olla peräisin vapaasta kuparilajista liuoksessa, koska kaikki pienet molekyylilajit poistetaan proteiinivalmisteen aikana; näin ollen kaikki kuparisignaalit sähkömagneettisessa sähkömagneettisessa resonanssissa johtuvat proteiiniin sitoutuneesta kuparista.)

Mutta sen määrittämiseksi, johtuivatko nämä kaksi signaalia yhdestä kupariin sitoutuvasta paikasta, jolla on erilaiset koordinaatiogeometriat, vai kahdesta erillisestä kuparipaikasta, tehtiin X-kaistan CW-EPR-titrauskoe. Proteiini esikäsiteltiin EDTA:lla (10 × proteiinikonsentraatio) mahdollisen kuparin poistamiseksi ja sen jälkeen puskurivaihdettiin EDTA:n poistamiseksi. Tämä kuparivapaa proteiininäyte testattiin, eikä siinä odotetusti näkynyt kuparipohjaista signaalia. Lisäämällä 0,2 ekvivalenttia kuparia (proteiinikonsentraatioon verrattuna) näytteessä näkyi yksi signaali rinnakkaisella alueella, joka osoitettiin kupari(II)ionille histidiiniryhmän aktiivisessa keskuksessa (laji 1). Kuparin lisääminen edelleen lisäsi tätä histidiiniryhmän kuparisignaalia, ja samanaikaisesti kasvoi lajin 2 signaali, joka oli ilmeinen jo 0,4 ekvivalentin kuparin jälkeen (lisätiedosto 3: kuva S3). Nämä titrauskokeet suoritettiin kiinteässä pH:ssa, ja ne osoittavat, että kuparilla kyllästetyn TtAA10A:n EPR-spektrissä esiintyvät kaksi lajia edustavat kahta erilaista Cu-sitoutumiskohtaa, joilla on hieman erilainen kupariin sitoutumisaffiniteetti, jossa laji 1 on korkeamman affiniteetin kohde. Lisäksi TtAA10A-näytteen, jossa oli 0,4 ekvivalenttia Cu:ta, annettiin olla 4 °C:ssa 48 tuntia, ja sen EPR-spektri tutkittiin uudelleen. Tässä näytteessä ei havaittu eroa kuparilajien suhteessa, mikä osoittaa, että erilaiset sitoutumiskohteet eivät johtuneet suurista eroista kuparin sitoutumisen kinetiikassa.

Huomionarvoista on, että useista valmistamistamme valmisteista eristettiin TtAA10A-näyte, jonka EPR-spektrissä näkyi vain yksi kuparisignaali. Syyt tähän eroon eristetyn proteiinin kuparin stoikiometriassa eivät ole selvillä, koska nämä näytteet valmistettiin ilmeisesti käyttäen samoja olosuhteita kuin ne, joissa saatiin TtAA10A:ta, jolla oli kaksi erillistä Cu-signaalia X-kaistan EPR-spektrissä (laji 1 ja laji 2). Emme pystyneet havaitsemaan mitään eroja aktiivisuudessa näissä yksinään kuparilla miehitetyissä valmisteissa suhteessa aiempiin näytteisiin, mutta pystyimme hyödyntämään näitä näytteitä mittaamaan sekä X-kaistan että Q-kaistan CW-EPR-spektrejä TtAA10A:n aktiivisen keskuksen Cu:lle (kuva 4), kun vain histidiinirunko oli miehitetty, kuten aiempiin spektreihin vertaamalla voidaan arvioida. Tämän näytteen avulla voitiin siis suorittaa sekä X-kaistan että Q-kaistan spektrien samanaikainen sovitus, jonka avulla saatiin tarkemmat spin-Hamiltonian-parametrit kupari-ionille histidiinihaarakkeen aktiivisessa keskuksessa (laji 1). Nämä arvot esitetään taulukossa 2. PASC:n lisääminen TtAA10A:han ei aiheuttanut muutoksia EPR-spektreihin (tietoja ei ole esitetty).

TtAA10A:n 3D-rakenne

Saadaksemme lisää tietoa TtAA10A:n biokemiallisten ominaisuuksien molekyyliperustasta ja tutkiaksemme tätä mahdollisesti epätavallista kaksois-Cu-rakennetta määritimme rekombinantti-ekspressoidun proteiinin kiderakenteen 1,4 Å:n erottelukykyyn asti (lisätiedosto 4: taulukko S1). Kokonaisrakenne paljasti immunoglobuliinin kaltaisen ydinkerroksen, jota koristavat silmukat ja kierteinen nippu, kuten tämän perheen entsyymeille tyypillisesti havaitaan (kuva 5). DALI-palvelimen avulla tehdyt rakenteelliset vertailut paljastivat lähimmät rakenteelliset yhteneväisyydet Cellvibrio japonicus AA10A:n (PDB ID 5fjq) ja Serratia marcescens CBP21:n (PDB ID 2bem) kanssa, joiden RMSD-erot olivat 2,4 Å 180 ja 2,3 Å 180 ja 170 Cα-aseman kohdalla, mikä tarkoittaa vain 30 prosentin identiteettiä sekvenssitasolla. Kun otetaan huomioon TtAA10A:n korkea aktiivisuus selluloosassa, voi olla hieman yllättävää, että tämän entsyymin kaksi lähintä rakenteellista vastinetta ovat kitiiniä käyttäviä AA10-entsyymejä. Kolmanneksi lähin rakenteellinen vastine oli kuitenkin Streptomyces coelicolor -organismin AA10 (ScAA10, PDB ID 4oy7 ), joka on selluloosaspesifinen AA10 ja jonka RMSD on 2,5 Å 160 Cα-atomin osalta. TtAA10A:lla ja ScAA10:llä on vain 26 prosentin sekvenssi-identiteetti, vaikka ne ovat aktiivisia samalla substraatilla, mikä korostaa entisestään vaikeutta yhdistää LPMO:n substraattispesifisyys pelkkään sekvenssiin ja kokonaisrakenteeseen perustuen (AA9:n yhteydessä käsiteltiin tarkemmin artikkelissa Ref. ).

Kuten kaikkien tähän mennessä tutkittujen LPMO:iden kohdalla (niiden aktiivisuuden perusteella määriteltynä), TtAA10A:n aktiivisen paikan muodostaa ”histidiiniripustin”-motiivi, joka sijaitsee lähes litteän pinnan keskipisteessä (kuvio 5a, b). Tähän kohtaan mallinnettiin yksi kupari-ioni, jota His 1:n aminopääte ja sivuketju sekä His 107:n sivuketjun imidatsoli koordinoivat tyypillisessä T-muotoisessa geometriassa. Aksiaalisissa asemissa aktiivisen alueen kupari-ionin ympärillä TtAA10A:ssa on Phe 195 ja Gly 105. Näissä asemissa on usein fenyylialaniini/tyrosiini- ja alaniinisivuketju muissa AA10:ssä. Jälkimmäisen on arveltu luovan steerisen ympäristön, joka aiheuttaa kitiinispesifisissä AA10-yhdisteissä havaitun vääristyneen aktiivisen keskuksen koordinaatiogeometrian muodostumisen Cu(II)-hapetustilassaan. Tässä tapauksessa Ala:n korvaaminen Gly:llä sallii aktiivisen alueen kuparin omaksua hieman aksiaalisemman koordinaatiogeometrian, joka on lähempänä AA9- ja selluloosa-aktiivisille AA10-yhdisteille tyypillistä geometriaa ja joka on yhdenmukainen aiemmin kuvaamassamme EPR-analyysissä (kuva 4) esitettyjen lajin 1 spin-Hamiltonian parametrien kanssa. LPMO:n kiderakenteet kärsivät usein säteilyvaurion seurauksena tapahtuvasta valopelkistymisestä, jolloin aktiivisen keskuksen lepogeometriaa ei voida suoraan havaita kiderakenteista (esimerkkeinä mainittakoon ). TtAA10A:n kupari-ionia ympäröivän pallon analyysi paljastaa vain heikon tiheyden vesimolekyylille 2,6 Å:n etäisyydellä kuparista ja voimakkaamman tiheyden toiselle vesimolekyylille 3,2 Å:n etäisyydellä, joka on vetysidoksessa Glu 53:een. Nämä vesimolekyylit ovat liian kaukana kuparista, jotta niitä voitaisiin pitää suoraan koordinoivina. Näyttää siis siltä, että myös tämän entsyymin kupari on läpikäynyt valopelkistyksen Cu(I)-hapetustilaan.

Rakenteemme paljastaa EPR-spektreissä havaitun toisen kuparin sitoutumiskohdan sijainnin. Tämä paikka on 14,4 Å:n (Cu…Cu) etäisyydellä histidiinikonsolin kupari-ionista suuressa negatiivisesti varautuneessa laikussa proteiinin pinnalla (Kuva 5a, b; Additional file 5: Kuva S4). Tämä toinen kupari-ioni on suoraan koordinoituna His 165:n, Glu 5:n, Asp 101:n, vesimolekyylin ja His 207:n* kanssa, joka on peräisin viereisen molekyylin Strep-tagista kiteessä. Tämän vuorovaikutuksen havainnon vuoksi tarkistimme proteiinin oligomeerisen tilan liuoksessa käyttäen SEC-MALLS-menetelmää (Lisätiedosto 6: Kuva S5). Tämä vahvisti, että proteiini on monomeerinen, mikä viittaa siihen, että kupari-His207*-vuorovaikutus on kideartefakti (joskin sellainen, joka voi viitata mahdolliseen proteiini-proteiini-vuorovaikutukseen). EPR-tietoihin lisättynä rakenne kuitenkin viittaa siihen, että tämä toinen paikka on varattu liuoksessa, ja His 207* on todennäköisesti korvattu vesimolekyylillä. BlastP-hakujen avulla tunnistettujen 500 tärkeimmän TtAA10A:n ortologin moninkertainen sekvenssikohdistus osoittaa, että vaikka hapan jäännös positiossa 5 ei ole harvinainen AA10:ssä, jäännökset 101 ja 165 ovat suurelta osin konservoituneita vain Teredinibacterin kanssa läheisessä sukulaisuussuhteessa olevien bakteerien LPMO:issa.

On käyty paljon keskustelua mahdollisista positioista, joissa elektroninluovuttajat, sekä pienimolekyyliset että proteiinipitoiset, voivat sitoutua LPMO:iin katalyysin mahdollistamiseksi, kun entsyymi on sitoutunut kiinteän substraatin pintaan (ks. esim ). TtAA10A:n rakenteen tutkiminen mahdollisten varauksensiirtoreittien varalta EHPath-ohjelmalla osoittaa, että histidiini 1:n ja tyrosiini 3:n välillä (10 Å:n etäisyydellä toisistaan) on selkeä ja nopea reikähyppelyreitti, jonka keskimääräinen reikien viipymäaika on vain 20 ms. TtAA10A:n rakenteessa on kaksi reikähyppelyreittiä. Tyrosiini 3 on toisen Cu-kohdan vieressä (5,3 Å), mikä tarjoaa tehokkaan varauksensiirtoreitin kahden kuparikohdan välillä. Koska kahden kuparipaikan välillä on potentiaalinen varauksensiirtoreitti, tutkimme, onko toinen metallikohta (meidän tapauksessamme kupari, vaikka emme voineet syrjäyttää Cu:ta Fe-, Ni-, Zn- ja Mn-suoloilla) proteiinipitoisen redox-kumppanin sitoutumispaikka (toisen proteiinin sitoutumiseen tähän kohtaan viittaa Strep-tagin assosiaatio viereisen molekyylin kanssa kiteisessä hilassa), ja yritimme vetää proteiineja alaspäin T. turnerae-ennustetun sekretomin proteiineja, jotka voivat olla pysyvästi vuorovaikutuksessa TtAA10A:n kanssa, käyttämällä affiniteettikolonnia (StrepTrap HP), johon on immobilisoitu TtAA10A. Nämä kokeet (tietoja ei ole esitetty) eivät johtaneet minkään TtAA10A:n proteiinipohjaisen aktivaattorikandidaatin eristämiseen, mutta ei voida sulkea pois sitä mahdollisuutta, että aktivoiva entsyymi voisi sitoutua ohimenevästi tälle alueelle, jotta elektronin siirtyminen LPMO:lle ja siten katalyysin käynnistyminen olisi mahdollista. On kuitenkin huomattava, että rakenteen tarkentamisen aikana tunnistimme myös natriumin sitoutumiskohdan proteiinin pinnalla (lisätiedosto 7: kuva S6). Avoimeksi jää, johtuvatko nämä ylimääräiset sitoutumiskohdat siitä, että proteiinin varauksen on oltava suurempi, jotta se olisi vakaa suolapitoisessa ympäristössä, jossa T. turnerae asuu. Nämä TtAA10A:n pintaominaisuudet voivat kuitenkin kiinnostaa entsyymi-insinöörejä, jos LPMO:t halutaan stabiloida tai mukauttaa erityisolosuhteisiin, jotta niitä voidaan käyttää teollisissa bioreaktoreissa.