Micropropagation of Anthurium spp.

2.1. Anthuriumin kudosviljely

Kudosviljelymenetelmillä on useita etuja tavanomaiseen lisäykseen verrattuna, kuten uudistumiseen vaikuttavien tekijöiden, kuten eksplanttityypin, ravinteiden ja kasvien kasvua säätelevien aineiden pitoisuuksien ja ympäristön olosuhteiden joustava säätö, kloonien tuottaminen halutussa tahdissa, tuotannon jatkuminen kausivaihteluiden aikana kudosviljelymenetelmien avulla lisäävät myös kasvien monistumisnopeutta.

Irtokasvityyppi

Kudosviljelymenetelmien menestys liittyy oikeanlaiseen valintaan eksplanteista. Verso- tai versokärjet ja solmuviljelmät ovat yleisimmin käytettyjä viljelmätyyppejä kasvien mikropropagoinnissa. Versonkärjistä ja solmuvarsisegmenteistä saadut versokasvit soveltuvat tehostettuun kainalohaaroitukseen. Anthuriumin mikropropagointia aksillarisilmuista, verson kärjestä, laminaarikasvustoista, solmusta, varresta ja mikropistokkaista on käytetty menestyksekkäästi. Näistä kasvinosista lehdet ovat Anthuriumin vitropropagoinnissa käytetyin eksplanttilähde.

Anthuriumin genotyypillä on tärkeä merkitys vitropropagoinnissa. Tutkimukset osoittivat, että eri genotyypit reagoivat eri tavoin samoihin viljelyolosuhteisiin. Tästä syystä on tarpeen luoda kullekin Anthurium-lajikkeelle sopiva menettely, joka voidaan mukauttaa kaupalliseen tuotantoon.

Kallogeneesin ja orgonogeneesin aikaansaamiseksi käytettävän eksplanttityypin valinta on tärkeää kasvien kannalta. Suorissa ja epäsuorissa orgonogeneesitutkimuksissa on tärkeää käyttää nuoria lehti-eksplantaatteja viljelyn onnistumisen kannalta. Martin et al. havaitsivat suuremman määrän versoja ruskeista nuorista lehti-eksplanteista kuin nuorista vihreistä lehti-eksplanteista. Myös Viégas et al. viittasivat uusien ruskeiden lehtien käytön tärkeyteen kallusinduktiossa. Bejoy et al. raportoivat, että vaaleanvihreistä lehdistä irrotetut kasvustot osoittivat parempaa kalluksen kehitystä kuin vaaleanruskeat lehdet. Atak ja Çelik käyttivät myös Anthurium andreanum -kasvin nuoria ruskeita ja vihreitä lehtiä arvioidakseen kallusmuodostusten tehokkuutta. He onnistuivat lyhentämään kalluksenmuodostukseen kuluvaa aikaa käyttämällä ruskeiden lehtien eksplantaatteja ja saivat aikaan kalluksenmuodostusprosentin 50 prosenttia suuremmaksi kuin vihreiden lehtien avulla.

Aseptisen kulttuurin luominen

Kakkosvaihe mikropropagoinnissa on kasvimateriaalin aseptisen kulttuurin luominen. Aseptiset viljelyjärjestelmät ovat tehokkaita bakteeri-, sieni- ja hyönteiskontaminaatioiden hävittämisessä. Taulukossa 1 esitetään eri Anthurium-kasvilähteille käytetyt sterilointiprotokollat. NaOCl on tärkein desinfiointiaine, jota käytetään Anthuriumin aseptisten viljelyolosuhteiden luomisessa. NaOCl:n pitoisuudet vaihtelevat 1-5 prosentin välillä. Kasvustojen inkubaatioajat natriumhypokloridissa vaihtelivat sen pitoisuuksien mukaan. Lisäksi on tarpeen käyttää ylimääräisiä desinfiointiliuoksia sieni- ja bakteerikontaminaatioiden hävittämiseksi. Benomyyliä, setriimiä, gentamysiiniä ja streptomysiinisulfaattia käytetään tehokkaasti tähän tarkoitukseen.

Viljelyalusta

Viljelyalusta vaikuttaa kasvien kudosviljelysovelluksissa lisääntymistehokkuuteen. Orgaanisia yhdisteitä, vitamiineja ja kasvien kasvua sääteleviä aineita käytetään terveen kasvun stimuloimiseksi. Kudosten kasvunopeuteen ja morfogeneettisiin vasteisiin vaikuttavat suuresti mukana olevien ravinteiden ominaisuudet.

Valmisteita on useita, kuten Chu , Gamborgin B5 , Murashige ja Skoog , Murashige ja Tucker sekä Nitsch ja Nitsch . Näitä väliaineita käytetään menestyksekkäästi erilaisten kasvien erilaisten eksplantaattien kudosviljelmien perustamiseen .

Kasvien kudosviljelytutkimuksissa on käytetty erilaisten makro- ja mikroravinteiden eri pitoisuuksiin perustuvien väliaineiden erilaisia yhdistelmiä tehokkaiden protokollien kehittämiseksi. Nopeat ja tehokkaat kudosviljelyprotokollat ovat tärkeitä Anthuriumin samoin kuin muidenkin kasvien mikropropagoinnissa.

Kasvien kudosviljelyn onnistuminen riippuu käytetyn väliaineen koostumuksesta. Erilaiset makroravinteiden, kuten typen, kaliumin, kalsiumin, fosforin, magnesiumin ja rikin, sekä mikroravinteiden, kuten raudan, nikkelin, kloorin, manganaasin, sinkin, boorin, kuparin ja molybdeenin, erilaiset yhdistelmät muuttavat elatusaineen luonnetta.

Kullakin kasvilajilla on oma elatusaineen koostumuksensa, tai sitä olisi parannettava parempien tulosten saavuttamiseksi. Muutoksia voidaan tehdä makro- ja mikroravintoaineisiin, sokeripitoisuuteen, kasvien kasvun säätelijöihin, vitamiineihin ja muihin typpilisäaineisiin.

MS-väliaineita, joihin on tehty joitakin muutoksia, on käytetty usein Anthuriumin kudosviljelyssä. Erot johtuvat siitä, että käytetään eri pitoisuuksia kasvien kasvun säätelijöitä yhdessä MS-orgaanisten aineiden kanssa, joita käytetään haluttujen kudosten saamiseksi .

Typpi on olennainen makroravinne kasvien elämässä. Se on tärkeä osa proteiineja ja nukleiinihappoja. Nitraatti on tärkein typen lähde. NO3- pelkistyy ammoniumiksi imeytymisen jälkeen. Kasvit pystyvät käyttämään typen pelkistynyttä muotoa aineenvaihdunnassaan. Nitraatin imeytyminen tapahtuu tehokkaasti happamassa pH:ssa. Nitraatin ottamisen jälkeen väliaineen happamuus kuitenkin vähenee. Kun ammoniumia otetaan, väliaine muuttuu happamaksi. Kasvinviljelyalustan pH on tärkeä, koska puskuroidussa kasvualustassa molempien ionien olemassaolo vaikuttaa tehokkaaseen typenottoon. Kasvualustan typen muodolla ja määrällä on merkittäviä vaikutuksia solujen kasvuun ja erilaistumiseen. Kasvualustan pH:n säätely ei ole ainoa syy molempien ionien käyttöön, vaan liialliset ammoniumionit ovat myrkyllisiä kasveille. Suuria NH4+-pitoisuuksia sisältävät väliaineet estävät myös klorofyllisynteesiä .

On tiedetty, että NO3- indusoi juurten kasvua ja NH4+ vähentää sitä. Morfogeneesiä ohjaa kuitenkin typen kokonaismäärä elatusaineessa, ja se tarvitsee sekä NO3- että NH4+ -yhdisteitä. Koska käytetään optimaalista NH4+: NO3-:lla on keskeinen rooli morfogeneesissä, joten NO3-:n ja NH4+:n välinen tasapaino vaihtelee eri kasveissa ja erilaisissa viljelmissä. Tämä tilanne merkitsee sitä, että tämä suhde olisi säädettävä erityisesti kutakin kasvilajia ja eri tarkoituksia varten. NO3- ja NH4+ -suhteen muuttaminen pienillä muutoksilla vaikuttaa erilaistumiseen ja kasvuun.

MS-mediaa käytetään usein Anthuriumin kudosviljelyyn, ja NO3-:n ja NH4+:n suhde on tässä väliaineessa 66:34. Tästä syystä Anthuriumin organogeneesissä käytetään yleensä muunnettua MS-alustaa. Tutkijat ovat tutkineet ammoniumnitraattipitoisuuden muutoksia Anthurium-medioissa. Hamidah et al. käyttivät puolivahvoja MS-makroelementtejä, joissa oli 2,5 mM ammoniumnitraattia in vitro -varastoviljelmiin. Kun taas Puchooa käytti 200 mg/l alennettua ammoniumnitraattipitoisuutta kallusviljelyssä, he nostivat määrän 720 mg/l:iin regenerointia varten. Dufour ja Guérin käyttivät erilaisia NO3- ja NH4-koostumuksia arvioidakseen kehitystuloksia. Heidän tulostensa mukaan suhde 0,37 osoitti parempaa kasvien kasvua ja kehitystä. Atak ja Çelik käyttivät versojen uudistamiseen mieluummin puolivahvoja MS-suoloja, joiden NH4NO3-pitoisuus oli alennettu 250 mg/l:aan. Winarto et al. paransivat protokollaa kallusinduktiota ja kasvien uudistamista varten, ja NWT-3-media sisältää 750 mg/l NH4NO3:a.

Viljelyolosuhteissa käyttämällä synteettisiä kemikaaleja, joilla on samankaltainen fysiologinen aktiivisuus kuin kasvihormoneilla, on valmiudet indusoida kasvien kasvua halutulla tavalla. Akksiini ja sytokiniinit ovat tärkeimmät kasvua ja morfogeneesiä säätelevät hormonit kasvien kudosviljelyssä. Niiden yhdistelmäkäyttö edistää kyvykkyyksien, solususpensioiden, juurten ja versojen kasvua, ja niillä on kyky säädellä morfogeneesiä. Luonnollisten lisäksi on olemassa synteettisiä auksiineja ja sytokininejä. Kasvien kasvua säätelevien aineiden, kuten 2,4-dikloorifenoksietikkahapon, naftaleenietikkahapon, bentsyyliaminopuriinin ja kinetiinin, eri yhdistelmiä ja pitoisuuksia käytettiin osoittamaan kalluksen muodostumista Anthurium-lajikkeiden erityyppisistä eksplantaateista. Alustavissa tutkimuksissa kokonaisen kasvin kudosviljelyn päävaiheita olivat kalluksen indusointi ja uudistaminen, jota seurasi versojen ja juurten uudistaminen. Koska Anthurium on tärkeä kaupallinen kasvi, nopean ja tehokkaamman kudosviljelyprotokollan kehittäminen ajan lyhentämiseksi on Anthuriumin kudosviljelyn päätavoite.

Taulukossa 2 on esitetty, että 2,4-D:n ja BA:n yhdistelmää kasvatusalustoissa käytetään usein kalluksen muodostumisen indusoimiseksi lehtien selitteistä Anthuriumin eri lajikkeissa. Eri tutkijat ovat arvioineet myös BAP:n ja 2-iP:n lisäämistä kallusmediumiin. Kallusalustassa käytetyt 2,4-D:n pitoisuudet vaihtelevat 0,08 mg/l ja 1 mg/l 2,4-D:n välillä. BA-pitoisuudet vaihtelevat välillä 0.1 mg/l ja 1 mg/l.

Mikropropagoitavat kasvit tarvitsevat kehittyneen juuriston, jotta ne kestävät ulkoisia ympäristöolosuhteita. Versojen juurtuminen tapahtuu in vitro. Siksi juurtumisen edistämiseksi tarvitaan sopivan auxiinityypin ja -määrän määrittäminen elatusaineeseen.

Aktiivihiiltä lisätään elatusaineeseen juurten kasvun edistämiseksi. Aktiivihiili koostuu hiilestä, ja sitä käytetään usein kasvien kudosviljelyssä imemään kaasuja ja liuenneita kiinteitä aineita. Se ei ole kasvun säätelijä, mutta sillä on kyky muuttaa elatusaineen koostumusta .

Aktiivihiilellä on useita edullisia käyttötapoja viljelytyypistä riippuen. Näitä ovat viljellyistä kudoksista erittyvien yhdisteiden adsorptio, fenolisten hapettumien väheneminen, elatusaineen pH:n muuttaminen morfogeneesin optimoimiseksi, ei-toivotun kalluskasvun estäminen, maaperäolosuhteiden simulointi, koska se kykenee edistämään juurten muodostumista, kyky käyttää sekundaaristen kasviperäisten kasviperäisten tuotteiden tuotannossa viljelyolosuhteissa .

Kasvihiilen käyttämisen tärkeimpänä vaikutuksena elatusaineeseen on kasvien kasvunsäätelijöiden ja muiden orgaanisten ravintolisäysaineitten konsentraatioiden tiukka pienentäminen. AC osoittaa suurempaa adsorptiokapasiteettia haavoittuneiden kudosten yleisesti tuottamille fenoleille, kasvihormoneille, kuten IAA:lle, NAA:lle, IBA:lle, BA:lle, kinetiinille, zeatiinille ja muille hormoneille . AC:n adsorptiokyky muuttuu puhtauden, pH:n ja tiheyden mukaan. Atakin ja Çelikin kasvattamat Anthurium-taimet juurrutettiin AC:tä sisältävään väliaineeseen, ja ne on esitetty kuvassa 1.