Miniature bioreactors: current practices and future opportunities
Introduction
Molekyylibiologian ja geneettisen manipulointiteknologian tulo viimeisen neljännesvuosisadan aikana on vaikuttanut dramaattisesti lääke- ja terveydenhoitoalan teollisuuteen, ja suuri osa tämän teknologian lukuisista sovelluksista perustuu kyvylle luoda solulinjoja ihmisten terapeuttiseen käyttöön. Näiden geneettisesti muunnettujen organismien kehittämisen lisäksi on edelleen tarpeen parantaa villin tyypin tuottavuutta, nopeuttaa uusien mikrobien seulontaa ja jatkaa niihin liittyvien tehtävien, kuten kasvualustan parantamisen ja prosessien optimoinnin, edistämistä. Perinteisesti soluviljelyprosessin kehittäminen on edellyttänyt suurten solulinjojen seulontaa ravistelupulloviljelmissä, minkä jälkeen menestyksekkäitä ehdokkaita on testattu penkkibioreaktoreissa ennen pilottimittakaavan tutkimuksia. Tarve suorittaa valtava määrä kehitysviljelyjä on johtanut siihen, että on kehitetty ja otettu yhä laajemmin käyttöön pienen mittakaavan bioreaktorijärjestelmiä, jotka tarjoavat miniatyrisoidun HT-ratkaisun prosessikehitykseen.
Tärkeimmät solutyypit, joita käytetään terapeuttisten tuotteiden tuottamiseen, ovat bakteeri- ja nisäkässolut, joilla kummallakin on ainutlaatuisia hyötyjä ja rajoituksia, jotka vaikuttavat prosessikehitykseen käytettävän bioreaktorin tyyppiin. Bakteerisolut ovat yleensä kestäviä eivätkä ne ole alttiita leikkausvaurioille, mikä tarkoittaa, että voidaan käyttää voimakkaasti leikkaavia säteittäisiä juoksupyöräjärjestelmiä (esim. Rushton-turbiinit) ja suuria sekoitusnopeuksia. Tämä antaa tällaisille bioreaktoreille suuren aineensiirtokyvyn, mikä mahdollistaa nopeasti metaboloituvien, suuren solutiheyden omaavien mikrobisoluviljelmien tukemisen ja lisää tällaisista bioprosesseista saatavan tuotteen määrää. Vaikka nisäkässoluilla ei ole suojaavaa soluseinää, joten ne ovat tyypillisesti leikkausherkempiä ja vaativat hellävaraisempaa käsittelyä kuin bakteerisolut, useimpia kaupallisesti käytettyjä solulinjoja voidaan kasvattaa sekoitussäiliöbioreaktoreissa, vaikkakin suunnittelumuutoksin. Esimerkiksi Rushton-turbiinien sijasta voidaan käyttää matalan leikkausleikkauksen omaavia, merityyppisiä aksiaalisia juoksupyöriä, jotka kierrättävät soluja ja ravinteita varovasti ilman ohjauslevyjä; ja soluviljelyaineisiin voidaan lisätä leikkausleikkaukselta suojaavia aineita, kuten seerumia tai Pluronic F-68:aa.
Terapeuttisen lääkekehityksen lisäksi MBR-laitteita voidaan käyttää kasvualustan kehittämiseen, kantojen parantamiseen aineenvaihduntatekniikan tai suunnatun evoluution avulla ja niin sanottuun luonnontuotteiden bioetsintään – kaikki nämä ovat prosesseja, jotka aiheuttavat suuren bioreaktoritaakan, jota voidaan lieventää käyttämällä HT-minilaitteita. Erityisesti MBR-laitteilla voidaan vähentää bioprosessien kehittämisessä tarvittavien lukuisten soluviljelyjen työmäärää ja materiaalikustannuksia, mikä lisää saavutettavissa olevaa rinnakkaisuutta ja läpimenoa, ja siksi ne kiinnostavat yhä enemmän. On tärkeää, että kun tällaisia laitteita käytetään prosessien kehittämiseen, niiden on luotettava siihen, että ne jäljittelevät tarkasti laboratorio- ja pilottimittakaavan bioreaktoreita, jotta pienoismittakaavassa optimoidun kasvukinetiikan ja tuotteiden ilmentymisen voidaan odottaa skaalautuvan kvantitatiivisesti.
Vaikka MBR:t ovat epäilemättä kykenevämpiä HT-toimintaan kuin tavanomaiset laboratoriomittakaavan bioreaktorit, ne ovat tällä hetkellä tyypillisesti vähemmän instrumentoituja ja niissä on myös rajalliset mahdollisuudet off-line-näytteenottoon, koska käytetyt tilavuudet ovat pieniä (n. 0,1 ml:sta n. 100 ml:aan); tämä tarkoittaa, että tällä hetkellä joudutaan tekemään kompromissi bioreaktorista saatavan tiedon laadun ja määrän, joka on saatavissa online- ja off-line-mittausten avulla, ja kokeellisen läpimenon välille. Koska mikään laite ei ole vielä ratkaissut kaikkia miniatyrisoinnin haasteita eli jäljitellyt tarkasti suuren mittakaavan prosessiolosuhteita ja säilyttänyt silti perinteisten bioreaktoreiden täyttä toiminnallisuutta, kirjoittajien tarkoituksena on tarkastella nykyistä kehitystä ja osoittaa, mihin suuntaan teknologia todennäköisesti kehittyy tulevaisuudessa, jotta nykyisiä HT-hyötyjä voidaan laajentaa ja pienoiskoossa ja laboratoriomittakaavassa toimivien bioreaktorialustojen välillä tällä hetkellä vallitsevaa tiedonsaantikuilua pienentää. Tässä katsauksessa on ryhmitelty erilaiset MBR-laitteet niiden sekoitusmenetelmän (ravistelu-, sekoitus- tai kaasusumutusmenetelmä) perusteella sen mukaan, minkä tyyppistä tavanomaista bioreaktoria ne joko jäljittelevät tai mistä ne on johdettu; taulukossa 1 on yhteenveto rinnakkaiseen toimintaan kykenevien prototyyppien ja kaupallistettujen pienoissolujen viljelylaitteiden tärkeimmistä eritelmistä ja ominaisuuksista. 2006 ). Kuvasta käy ilmi, että bioreaktoreiden mittakaavan kasvaessa saadaan yleensä enemmän prosessitietoa parempien seuranta- ja ohjausjärjestelmien ansiosta.
Tärytetyt miniatyyribioreaktorijärjestelmät
Tärytettyjä järjestelmiä on käytetty bioprosessoinnissa ensimmäisistä yrityksistä kasvattaa antibiootteja tuottavia mikrobiviljelmiä 1940-luvulla. Niitä käytetään edelleen laajalti teollisuudessa ja akateemisessa maailmassa välineenä lääkkeiden löytämisessä, elatusaineiden, kantojen ja tuotteiden optimoinnissa sekä prosessien kehittämisessä. Niissä on monia erilaisia malleja ja tilavuuksia, jotka vaihtelevat satojen millilitrojen ravistelupulloista aina muutaman mikrolitran mikrotiitterilevyihin (MTP).
Ravistelupullot
Viidenkymmenen viime vuoden ajan tutkijat ovat käyttäneet soluviljelyä ravistelupulloissa prosessien kehittämiseksi pienessä mittakaavassa, tilavuuksien vaihdellessa n. 10 millilitrasta 500 millilitraan . Ravistelupulloja on monenlaisia, ne voidaan valmistaa lasista tai muovista, ja joissakin on ilmavuutta ja sekoittumista helpottavia ohjauslevyjä. Niitä voidaan sekoittaa joko orbitaalisella tai lineaarisella ravistuksella, ja ne voidaan sijoittaa lämpötilakontrolloidussa kaapissa. Ravistelupulloviljelyyn vaikuttavia tekijöitä ovat astian koko, täyttötilavuus, rakennemateriaali, ohjauslevyjen geometria, ravistelutiheys ja astian sulkemiseen käytettävän tulpan tyyppi. Büchs väittää, että ravistelupulloja on arvioitu käytettävän yli 90 prosentissa kaikista viljelykokeista teollisuudessa ja korkeakouluissa, ja niissä kasvatetaan monenlaisia mikro-organismeja, kuten bakteereja, sieniä ja hiivoja, sekä nisäkässoluja. On helppo ymmärtää, miksi niitä käytetään niin laajalti: ne ovat edullinen ja tehokas tapa suorittaa toistettavasti monentyyppisiä teollisesti merkityksellisiä soluviljelmiä prosessien kehittämistä varten. Lisäksi niitä on helppo käyttää, ja ne ovat pitkälti suojattuja mekaanisilta komplikaatioilta. Suurimman osan niiden pitkästä käyttöajasta tekniikkaa on muutettu vain vähän, eikä viljelmiä ole seurattu verkossa eikä niitä ole lisätty ja näytteitä otettu manuaalisesti. Vasta viime aikoina on otettu käyttöön mittalaitteilla varustettuja ravistelupulloja, jotka on suunniteltu mittaamaan ja mahdollisesti valvomaan pH- ja DOT-tasoja verkossa . pH ja liuennut happi voidaan mitata käyttämällä ruteniumoksidiväriainetta, joka fluoresoi määrällisesti vetyionien tai hapen läsnä ollessa, kun sitä stimuloidaan LED-lampulla. Tämä väriaine voidaan joko sisällyttää laastariin ja kiinnittää pullon sisälle tai päällystää kuituoptiikkaan kytketyn anturin kärkeen ja upottaa kiinnostavaan viljelyyn. Muita parametreja, joita voidaan nyt mitata verkossa, ovat hapen siirtymisnopeus (OTR) ja hiilidioksidin kehittymisnopeus (CER) – ja näistä voidaan johtaa hengityskerroin (RQ). Tällaisten parametrien online-seuranta mahdollistaisi kehittyneempien soluviljelystrategioiden toteuttamisen, kuten substraatin syöttämisen solujen aineenvaihdunnan aiheuttamien viljelyliemen pH:n muutosten perusteella. Lisäksi Akgün et al. ovat hiljattain kehittäneet uudenlaisen ravistelupullojärjestelmän, joka kykenee jatkuvaan toimintaan ja lisää siten mahdollisuuksia rinnakkaiseen bioprosessien kehittämiseen ravisteltujen järjestelmien avulla.
Ravistelupullojen suurimpana rajoituksena on kuitenkin se, että ne ovat riippuvaisia pintailmastuksesta, mikä johtaa vähäisempään hapen siirtymiseen verrattuna sekoitussäiliöreaktoreihin (STR). Wittmann et al. raportoivat kokonaistilavuuskertoimen (kLa) arvoja jopa 150 h-1 ravistelupulloissa. Kato ja Tanaka ovat kehittäneet uudenlaisen laatikonmuotoisen ravistelupullon, jonka kLa-arvot ovat 151 h-1 (600 ml, 200 rpm) – 277 h-1 (100 ml, 200 rpm), ja nämä arvot ovat riittävän korkeita useimpiin soluviljelyihin ilman, että mikrobien kasvu estyy. Nämä tutkijat lisäsivät prototyyppipullojensa yläkulmiin kaasua läpäiseviä kalvoja, jotka mahdollistivat tehokkaamman kaasuvirtauksen astiaan ravistelun aikana, mikä poisti tavanomaisissa ravistelupulloissa havaitun ongelman, joka liittyy ilman lisäämiseen järjestelmään steriilillä tavalla. Viljelytarkoituksiin, joissa hapentarve on suuri, ohjauslevyjen käyttöönotto voi lisätä OTR:ää pienemmillä ravistelutiheyksillä; suuret nopeudet voivat kuitenkin johtaa liialliseen roiskumiseen, joka voi aiheuttaa pullon yläosassa olevan kaasua läpäisevän tulpan (joka on usein tehty puuvillasta) tukkeutumisen nesteen kyllästymisen vuoksi. Tällaisen tukkeutumisen on osoitettu vähentävän huomattavasti järjestelmän hapensiirtokykyä, mikä voi aiheuttaa ongelmia, jos kasvatetaan nopeasti reagoivaa aerobia. Hapenpuute voisi hidastaa kasvunopeutta, muuttaa tuotannon muodostumisnopeutta ja/tai synnyttää ei-toivottuja myrkyllisiä sivutuotteita, esim. asetaatin muodostumista Escherichia coli -bakteerissa.
Mikrotiitterilevyt
MTP-levyt (joita kutsutaan myös mikrokuoppalevyiksi) otettiin käyttöön ensimmäisen kerran vuonna 1951 alustana diagnostisille testeille, ja niitä käytetään edelleen laajalti biotieteissä . Niillä voidaan tehdä diagnostisia testejä, kuten entsyymisidonnaisia immunosorbenttimäärityksiä, joissa hyödynnetään mahdollisuutta suorittaa useita samanlaisia reaktioita rinnakkain ja hyvin pienessä mittakaavassa. Juuri tämä etu on johtanut siihen, että MTP:tä käytetään miniatyyrikokoisina ravisteltuina bioreaktoreina prosessikehityksen seulontavaiheessa solulinjojen arviointia varten. Levyt valmistetaan yleensä muovista, mutta on olemassa myös lasi- ja metalliversioita. Sekoittaminen voidaan toteuttaa pipetillä tai magneettisesti liikutetuilla sekoituspalkeilla, mutta ylivoimaisesti yleisin menetelmä on kuitenkin koko levyn ravistaminen orbitaalisesti lämmitetyllä lohkolla, jolla voidaan säätää viljelyn lämpötilaa. MTP-levyjen kuoppien lukumäärä on tyypillisesti 6, 12, 24, 96 ja 384, ja nykyään on saatavilla jopa 1536 ja 3456 kuoppaa ultrakorkean läpimenon seulontaan (UHTS). Kuopat voivat olla joko suorakulmaisia tai sylinterin muotoisia, ja neliön muotoiset kuopat edistävät sekoittumista ja hapen siirtymistä jäljittelemällä ohjauslevyjen toimintaa. Neliöpohjaiset levyt toimivat samalla tavalla rajoittamalla nesteen pyörteilyä kuopan sisällä ja lisäämällä siten järjestelmän turbulenssia. Koska pinta-ala kasvaa, koska nesteen hajoaminen kunkin mikrokuopan sivuilla on suurempaa, ja koska hapen liikkeellepanovoima kasvaa paremman sekoittumisen vuoksi, OTR on verrannollinen ravistelun amplitudiin ja taajuuteen, joten näiden parametrien kasvattaminen voi olla hyödyllistä. Lisäksi Hermann et al. ovat raportoineet OTR:n olevan kääntäen verrannollinen täyttötilavuuteen, erityisesti suuremmilla ravistustaajuuksilla. On kuitenkin olemassa piste, jonka jälkeen kaikki sekoituksen lisääminen johtaa prosessinesteen vuotamiseen (ellei kaivoa ole suljettu, mikä aiheuttaa omat ongelmansa, koska hapen siirtyminen kaivoon vähenee). Kuten ravistelupulloissa, myös MTP:ssä suhteellisen alhainen hapensiirtokapasiteetti (kLa-arvot jopa 200 h-1 96 kuoppalevyissä) johtuu siitä, että ne ovat ravisteltavia järjestelmiä ja massansiirto perustuu pintailmastukseen. Sitä vastoin Kensey et al. raportoivat sulfiittihapetusmenetelmää käyttäen kLa-arvoiksi jopa 1600 h-1 48-kuoppaisessa, vakiogeometriassa olevassa MTP:ssä, jossa on 3 mm:n orbitaalinen heitto 1400 rpm:n kierrosnopeudella ja jonka täyttötilavuus on 300 μl, mikä on verrattavissa tavanomaisiin STR-levyihin. Käyttämällä laskettua suhteellisuusvakiota tämä työryhmä pystyi suhteuttamaan kemiallisella menetelmällä saadun hapensiirtokapasiteetin biologisiin väliaineisiin.
KLa:n määrittämiseksi pienessä mittakaavassa on olemassa myös menetelmiä, jotka tuottavat suoraan vertailukelpoisia tietoja prosessiolosuhteissa saatujen arvojen kanssa. Esimerkiksi Duetz et al. ja Doig et al. arvioivat kLa:n massatasapainon avulla happirajoitusolosuhteissa Pseudomonas putidan lineaarisesta kasvusta MTP:ssä ja Bacillus subtiliksen lineaarisesta kasvusta prototyyppisessä minikuplakolonnireaktorissa (MBCR). Lisäksi dynaaminen kaasunpoistomenetelmä on usein parempi kuin sulfiittihapetusmenetelmä kLa-arvojen määrittämiseksi, koska se suoritetaan yleensä vedessä. Näin ollen tämä järjestelmä on koalesoiva, ja vaikka se ei ole identtinen biologisen väliaineen kanssa, se edustaa paremmin solujen viljelyolosuhteita kuin natriumsulfiittimenetelmän täysin koalesoimattomat olosuhteet. Tätä tekniikkaa on kuitenkin vaikea käyttää moniviljelylaitoksissa, koska ravistelu on usein lopetettava ennen DOT-mittausta tarkkojen lukemien saamiseksi, mikä muuttaa aineensiirtoympäristöä kriittisellä hetkellä. Vakiintuneiden menetelmien käyttöön liittyvien ongelmien vuoksi olemme hiljattain kehittäneet uuden menetelmän, joka perustuu katekolin bio-oksidaatioon katekoli-2,3-dioksygenaasientsyymin avulla. Tällä menetelmällä saatiin samankaltaisia kLa-arvoja kuin dynaamisella kaasunpoistomenetelmällä, ja koska menetelmä on nopea eikä vaadi oletuksia kinetiikasta, uskomme, että se soveltuu hyvin kLa-arvojen määrittämiseen MTP:ssä ja muissa pienissä laitteissa.
MTP:t kärsivät jossain määrin juuri siitä ominaisuudesta, joka tekee niistä houkuttelevia korkean läpivirtaustehon laitteina – pienistä tilavuuksista – koska haihduttaminen voi poistaa merkittävän osan kaivossa olevasta nesteestä . Levyjen päälle voidaan asettaa hengittäviä kalvoja haihtumisen rajoittamiseksi, mutta tällöin hapensiirtokyky heikkenee. Zimmermann et al. raportoivat kalvosta, jolla saavutettiin kohtalainen vedenpidätyskyky ja hapensiirto; kLa-arvot pienenivät kuitenkin viisinkertaisiksi, mikä pahensi entisestään ravistetuille järjestelmille ominaisen alhaisen hapensiirtokyvyn ongelmaa. Vaikka haihtuminen on potentiaalinen ongelma kaikissa MBR-järjestelmissä, MTP-järjestelmät näyttävät olevan alttiimpia sille, koska niissä käytetään yleensä pienimpiä prosessitilavuuksia. MTP:t, joissa on 3456 kuoppaa, tarjoavat suurimman läpimenon kaikista saatavilla olevista miniatyyrisistä soluviljelylaitteista, ja niiden on osoitettu ylläpitävän kiinalaisen hamsterin munasarjasolujen (CHO-solujen) kasvua määrällisesti, vaikka näin pieni prosessitilavuus (1-2,2 μl) tarkoittaa, että tämä laite ei luultavasti pysty jäljittelemään mekanismeja, joilla suuremmat ravistetut astiat toimivat; esimerkiksi pintajännitysvaikutukset ulottuisivat koko kuoppaan, mikä rajoittaisi sekoituskykyä vakavasti. Lisäksi väliaineen poistaminen off-line-näytteenottoa varten ei olisi mahdollista.
Vaikka MTP:tä käytetään laajalti löytötutkimuksessa, ne ovat kärsineet mittalaitteiden puutteesta samalla tavalla kuin ravistelupullot, mikä on rajoittanut kerättävän tiedon määrää. Viime aikoina on kuitenkin kehitetty tekniikoita pH:n ja DOT:n mittaamiseksi tällaisissa järjestelmissä. Esimerkiksi Lye ja kollegat ovat tutkineet pH:n säätelyn vaikutusta biomassan tuottoon ja filamenttisen bakteerin kasvukinetiikkaan MTP:ssä. Huolimatta joistakin MTP:n luontaisista rajoituksista soluviljelyä suoritettaessa on edistytty näiden astioiden sekoituksen, massansiirron ja instrumentoinnin karakterisoinnissa, mikä tarkoittaa, että näiden laitteiden ainutlaatuiset edut automaatiopotentiaalin ja luontaisen HT-ominaisuuden osalta johtavat niiden kasvavaan käyttöön alkuvaiheen MBR-järjestelminä.
Kierukkaputket
Nisäkässolujen pienen mittakaavan soluviljelyprosessin alkuvaiheen prosessikehitys on perinteisesti suoritettu T-pulloissa ja pienen mittakaavan bioreaktoreissa (usein kierukkapulloissa, joiden tilavuus on yleensä 500 ml) . Vaikka laitteet olivat aluksi pitkälti määrittelemättömiä, on tehty työtä spinner-pullojen teknisen ympäristön luonnehtimiseksi, mikä on helpottanut niiden käyttöä mittakaavan pienentämisastioina . On kuitenkin edelleen tosiasia, että niiden suhteellisen suuri tilavuus tekee niistä kannattamattomia HT-teknologiana, mikä tarkoittaa, että on olemassa todellinen tarve miniatyyribioreaktoreille, joita voidaan käyttää yhdessä nisäkässolujen kanssa rinnakkaisiin soluviljelyihin. Äskettäin on kehitetty spin tubes -putkia, joita on käytetty pienimuotoisen prosessin kehittämisen välineenä nisäkässolujen viljelyssä. De Jesus et al. kuvailivat ensimmäisenä spin tubes -menetelmän, joka näyttää tarjoavan useita etuja spinnerpulloihin verrattuna, kuten pienemmän prosessitilavuuden. Sittemmin ExcellGene SA (Valais, Sveitsi) on kaupallistanut niitä nimellä TubeSpin Satellites. Nämä kasvatusastiat koostuvat muunnetuista 50 ml:n sentrifugointiputkista, jotka on asennettu inkubaattoriin sijoitettuun pyörivään orbitaaliseen ravistimeen. Viljelytilavuudet ovat 5-35 ml reaktoria kohti, ja off-line-analyysi suoritetaan käyttämällä kokonaisia putkia uhrautuvasti. Tässä järjestelmässä ei ole tarvittavaa välineistöä täysin karakterisoitujen nisäkässoluviljelmien suorittamiseen, mutta se on kuitenkin hyödyllinen väline elatusaineiden optimointiin ja tuottavuuden parantamiseen, ja se antaa soluviljelmien kehitykselle korkean läpimenonäkökulman, sillä järjestelmän kehittäjät ovat ilmoittaneet pystyvänsä käsittelemään 1 000 erilaista viljelmää viikossa. Suhteellisen suuri tilavuus ja alhaiset haihtumisnopeudet tässä laitteessa ovat eduksi, kun käsitellään hitaasti kasvavia nisäkässoluja, joiden viljelmät voivat kestää useita päiviä, mutta on kuitenkin huomautettava, että tässä järjestelmässä ei ole tehty sekoittumisen ja aineensiirron teknistä karakterisointia, ja siksi spin tubes -putkia käytetään suurelta osin seulontasovelluksiin.
Miniatyyriset sekoitetut bioreaktorijärjestelmät
Miniatyyriset sekoitetut bioreaktorit (MSBR), jotka perustuvat tavanomaisiin STR-järjestelmiin, on kehitetty vaihtoehtona ravistetuille MBR-järjestelmille varhaisen vaiheen prosessikehitystä ja solujen karakterisointia varten. Tyypillisesti nämä laitteet on mallinnettu läheisesti laboratoriomittakaavan bioreaktoreihin, ja näin ollen ne mahdollistavat paremmat mahdollisuudet seurantaan ja valvontaan kuin muut miniatyyribioreaktorialustat. Niiden prosessitilavuus on yleensä MTP:iden ja ravistelupullojen välimaastossa, ja niiden rakennemateriaalit vaihtelevat suuresti: käytetään Perspexiä, Pyrexiä, polymetyylimetakrylaattia (PMMA) ja ruostumatonta terästä. Kuvassa 2 on esitetty 18 ml:n työtilavuuden prototyyppimme MSBR, joka on valmistettu ruostumattomasta teräksestä ja Pyrexistä ja joka on varustettu optisilla antureilla pH:n ja DOT:n online-mittausta varten. Tätä astiaa on luonnehdittu sen sekoitustehokkuuden ja hapensiirtokyvyn kannalta. Sen on osoitettu kykenevän jäljittelemään tavanomaisia STR-astioita soluviljelyissä, joiden reologia, leikkausherkkyys ja hapentarve vaihtelevat (esim. erytromysiiniä tuottava Saccharopolyspora erythraea -bakteeri ja plasmidi-DNA:ta ja vasta-ainefragmenttia tuottava E. coli -bakteeri). Laitteella pystyttiin menestyksekkäästi kasvattamaan erilaisia organismeja, koska sen kLa-arvot olivat suhteellisen korkeat (480 h-1 7000 rpm:n kierrosnopeudella käyttäen dynaamista kaasunpoistomenetelmää) ja sekoitusaika oli lyhyt (4,8 sekuntia 7000 rpm:n kierrosnopeudella, mikä on yli kaksi kertaa nopeampi kuin 7 l:n astia, joka perustuu yhtä suureen spesifiseen tehontuottoon). Korkeat hapensiirtonopeudet tukivat nopeasti hengittävien organismien (E. coli) kasvua, kun taas tehokkaan sekoituksen ansiosta astia pystyi säilyttämään homogeeniset olosuhteet viskoosien käymisliemien käsittelyssä, joita esiintyy usein filamenttisten organismien kasvatuksessa. Sekoitusnopeutta voitiin myös säätää hyvin tarkasti, mikä auttoi estämään liiallisesta voimantuotosta johtuvia vaurioita leikkausherkille sienieläimille. Lisäksi astian kaasutettu tehonkulutus mitattiin, minkä ansiosta juoksupyörän teholuku voitiin laskea laajalla käyttöolosuhteiden vaihteluvälillä, minkä ansiosta soluviljelyt voidaan luotettavasti skaalata alaspäin yhtä suuren ominaistehon perusteella. Vaikka tämä MSBR on prototyyppi, olisi mahdollista moninkertaistaa tällainen laite suuremman läpimenon saavuttamiseksi.
Tekninen havainnollistus 18 ml:n työtilavuudeltaan pienoiskokoisesta sekoitetun bioreaktorin (MSBR) prototyypistä .
Tarjoamalla sekoitusta ja ilmastamalla astiaa aktiivisesti, kirjallisuudessa on raportoitu muiden MSBR-reaktoreiden osalta massansiirtonopeuksia, jotka ovat lähellä tavanomaista, laboratoriomittakaavan STR:ää. Esimerkiksi Lamping et al. raportoivat kLa-arvoja 360 h-1 1 VVM:n ja 3000 rpm:n kierrosnopeudella käyttäen dynaamista kaasunpoistomenetelmää kuvassa 2 esitetyn kaltaisessa MSBR-prototyypissä. Lisäksi sama ryhmä onnistui mallintamaan hapen siirtymisen prototyypin miniatyyribioreaktorissa käyttämällä CFD-analyysiä (Computational Fluid Dynamics), joka perustui nopeuskentän, kuplakoon, kaasun pidättymisen ja MBR:n sisäisen energian häviämisnopeuden asiaankuuluviin insinööriteknisiin parametreihin.
Puskeiler et al. raportoivat hiljattain, että kLa:n kLa:n arvot ovat olleet jopa yli 700 h-1 (12 ml:n tilavuudessa) ja 1600 h-1 (8 ml:n tilavuudessa) MSBR:llä, jota sekoitettiin kierrosluvulla 2300 rpm. Tässä järjestelmässä käytetään uutta kaasua indusoivaa juoksupyörää, jonka ansiosta hapensiirtokyky on erittäin suuri. Kyseisessä tutkimuksessa kLa:n mittaamiseen käytettiin dynaamista kaasunpoistomenetelmää, vaikkakin käytettiin muita kuin koalesoivia olosuhteita, mikä vaikeuttaa suoraa vertailua soluviljelyaineista tai koalesoivista nesteistä saatuihin arvoihin. Samassa artikkelissa kuvattiin järjestelmän kykyä ylläpitää solujen syöttöeräkasvatusta, mikä havainnollistaa miniatyyribioreaktoriteknologian mahdollisuuksia tukea tällaisia teollisesti tärkeitä strategioita. Lisäksi osoitettiin online-seurannan ja -ohjauksen toteutettavuus. Kyseisessä raportissa kuvattu laite, joka on suunniteltu yhdessä H+P Labortechnik AG:n (Oberschleissheim, Saksa) kanssa, on integroitu yksikkö (”Bioreaktorilohko”), joka kykenee tukemaan jopa 48 soluviljelyä samanaikaisesti. Integroitu nesteenkäsittelyjärjestelmä mahdollisti pH:n mittaamisen linjalla tunnin välein annostelemalla 20 μl:n näytteitä kaupallisesti saatavilla oleviin MTP:iin, jotka sisälsivät kiinnitettyjä pH-laastareita. Kahdeksan minuuttia myöhemmin sama nestenäytteenottojärjestelmä säätää pH:n 4 M NaOH:lla. Automaattisen nestekäsittelyn käyttö pH:n säätöön on siisti ratkaisu, mutta kirjoittajat myönsivät, että se voi olla epäkäytännöllinen, jos sitä käytetään herkkien organismien kanssa, jotka vaativat herkempää pH:n säätöä. Raportissa todetaan kuitenkin, että teollisuuden yhteistyökumppaneiden kanssa kehitetään parhaillaan parannettua seurantajärjestelmää, joka mahdollistaa tiheämmän seurannan, mikä voi lisätä tehokkaasti seurattavien samanaikaisten käymisprosessien määrää. DOT mitattiin järjestelmässä optisilla antureilla varustetun anturilohkon prototyypin avulla, vaikkakin vain 8 reaktoria 48:sta kasvatusastiasta valvottiin samanaikaisesti. Tällainen laite voidaan myös integroida tavanomaisiin robottilaitteisiin nesteenkäsittelytehtävien, kuten inokulaation, ruokinnan ja näytteenoton suorittamiseksi.
Toisesta lähestymistavasta poiketen Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, USA) on kehittänyt Cellstation® -nimisen usean astian MSBR-rakenteen. Tässä MBR:ssä käytetään optista teknologiaa, joka mahdollistaa jopa 12 rinnakkaisen viljelyn on-line-seurannan paikan päällä pH:n, DOT:n ja optisen tiheyden (OD) osalta, ja sekoituksesta huolehtii kaksoismela-tyyppinen juoksupyörä. Kunkin astian työtilavuus on enintään 35 ml, ja se on kiinnitetty karuselliin, joka pyörii, jolloin kaikista astioista voidaan ottaa näytteitä ja seurata niitä peräkkäin. Optinen anturijärjestelmä on validoitu osoittamalla pH- ja DO-anturien yhdenmukaisuus 70 tunnin ajan nisäkässoluviljelyprosessissa. Lisäksi Raon tutkimusryhmä Marylandin yliopistossa, jolla on läheiset yhteydet yritykseen, on hiljattain julkaissut tietoja kahdesta prototyypistä 24 kuoppaa käsittävästä MSBR-järjestelmästä, jotka parantavat edelleen tämän tekniikan läpimenoa.
Rinnakkain näiden MSBR-kehitysten kanssa Dasgip AG (Jülich, Saksa) on tuonut markkinoille Fedbatch-Pro®-soluviljelysarjaan kuuluvan Stirrer-Pro Flask -säiliön, jossa on jopa 16 viljelyastiaa (työtilavuus 200-275 ml) ja joka tarjoaa sekoitukseen perustuvan hapensiirtokapasiteetin ja syöttöeräominaisuuden. pH:ta ja DOT:ia voidaan valvoa vakiomuotoisilla steriloitavissa olevilla näytteenottimilla, ja niitä voidaan säätää itsenäisesti kunkin astian osalta automaattisella happo-/emäsnesteen lisäyksellä ja ilmavirtauksen nopeuden tai sekoituksen vaihtelulla. Substraatin lisäys voidaan yhdistää joko DOT- tai pH-käynnistyspisteisiin, mikä mahdollistaa täysin automatisoidun fed-batch-ominaisuuden. Mekaanisen sekoittamisen (10-1000 kierrosta minuutissa) ja kaasun suihkuttamisen yhdistelmä osoittaa, että tämä järjestelmä kykenee tukemaan nopeasti kasvavia bakteeriviljelmiä, joiden solutiheys on suuri, ja siksi se olisi hyödyllinen tällaisten bioprosessien kehittämisessä. Käytetty työtilavuus on kuitenkin suhteellisen suuri verrattuna useimpiin muihin käsiteltyihin järjestelmiin, ja asennusta vaikeuttaa suuri määrä putkia ja johtoja lisäyksiä ja mittauksia varten. Tästä järjestelmästä on kehitetty myös muunnelma, jossa on jopa 16 pH-antureilla varustettua ravistelupulloa, jotka mahdollistavat jaksottaisen syötön ja rinnakkaisen pH:n säädön.
Laboratoriomittakaavan rinnakkaiskäyttöön kykenevien STR-järjestelmien, kuten Infors AG:n (Bottmingen, Sveitsi) kehittämän Sixfors®-järjestelmän, rinnakkaiskäyttöön kykenevien STR-järjestelmien, kuten Infors AG:n (Bottmingen, Sveitsi) kehittämän Sixfors®-järjestelmän, rinnakkaiskäyttöön kykenevien STR-järjestelmien rinnalle pienemmäksi vaihtoehdoksi Lontoon yliopistokorkeakoulun (University College London) tutkijat ovat kehittäneet yhdessä HEL Groupin BioXplore-bioreaktoriliiketoiminnan kanssa (Barnet, IsoBritannia) ja luonnehtineet 4-6 kammioista muodostuvan MBR-järjestelmää, jossa on täysin integroitu automaattinen ja automatisoitu pH:n ja pH:n valvonta. Vaikka kunkin astian maksimitilavuus on 100 ml, mikä on MSBR-teknologian yläpäässä, itsenäisen ohjelmiston kehittäminen tällaisten bioreaktoreiden valvomiseksi on askel kohti sitä, että MBR-reaktoreilla on sama valvonta- ja automaatioaste kuin tavanomaisilla bioreaktoreilla.
Miniatyyriset kuplapylväsreaktorit
Miniatyyriset kuplapylväsreaktorit
Kuplapylväsreaktoreissa käytetään kaasun sparrausta sekoittumisen ja hapen massansiirron edistämiseen solujen viljelyssä sekoittumisen ja hapen massansiirron sijaan. Vaihtoehtona sekoitetuille tai ravistetuille laitteille olemme kehittäneet miniatyyrikuplapylväsreaktorin (MBCR), joka perustuu MTP:hen, jossa huokoiset kalvot (fritsit) toimivat koko pohjana jokaiselle yksittäiselle kaivolle. Ilma läpäisee fritin ja virtaa ylöspäin jokaisen kaivon läpi, mikä tuottaa happea kullekin kasvavalle kulttuurille. Edellyttäen, että kukin fritti valmistetaan korkeiden eritelmien mukaisesti ja että sen huokoisuus on sama, virtausnopeus kuhunkin pylvääseen on sama ja se voidaan laskea. Näin estetään se, että ilman virtausnopeuden vaihtelu vaikuttaa keinotekoisesti tuloksiin.
Doig et al. kuvaavat yksityiskohtaisesti sellaisen 12-kuoppaisen MBCR:n prototyypin rakentamista ja karakterisointia, joka kykenee tukemaan Bacillus subtilis -viljelmien aerobista viljelyä siten, että kunkin pylvään työtilavuus on 2 ml. KLA-arvojen raportoitiin nousevan jopa 220 h-1:een käyttämällä dynaamista kaasunpoistomenetelmää kaasun pinnankorkeusnopeudella, joka on 0,02 ms-1. Yksi tämäntyyppisen laitteen eduista on se, että toisin kuin MTP:ssä, ilmastus tapahtuu suoran spargauksen avulla. Tämä lisää järjestelmän hapen aineensiirtokykyä verrattuna monipuolisten ilmastusjärjestelmien järjestelmään, koska sparraus lisää kaasun ja nesteen aineensiirtoon käytettävissä olevaa pinta-alaa verrattuna pelkkään pintailmastukseen. Vaikka jotkin tässä katsauksessa esitetyt MTP:n kLa-arvot ovat huomattavasti suurempia kuin mitatut MBCR-arvot, on huomattava, että monet MTP-arvot on saatu melko keinotekoisissa olosuhteissa, jotka on suunniteltu maksimoimaan hapensiirto, kun taas edellä esitetyt MBCR:n kLa-arvot olisivat toistettavissa soluviljelyolosuhteissa.
Hapen siirtoon käytettävissä olevan suuren pinta-alan lisäksi MBCR-kolonnissa ei ole sekoitusta, mikä tarkoittaa, että tehontuottoa ja siten hapen siirtoa on helpompi mallintaa kuin STR-kolonneissa, koska huomioon otettavia parametreja on vähemmän, ja kaasun pintanopeus ja kuplakokojakauma ovat keskeisiä parametreja kuplakolonnien skaalauksen lisäämisessä tai vähentämisessä. Lisäksi laite on paikallaan eikä sitä ravisteta, mikä helpottaa instrumentointia, sillä useimpien MTP-järjestelmien sekoittaminen on lopetettava, ennen kuin mittaus voidaan suorittaa levylukulaitteella. Mekaaninen yksinkertaisuus yhdistettynä potentiaalisesti suureen hapensiirtoon ja näytteenoton helppouteen tekee MBCR:stä sopivan rinnakkaiseen soluviljelyyn. Tarkoituksena voi olla muun muassa väliaineen tai kannan parantaminen ja varhaisen vaiheen prosessikehitys. MBCR-laitteita voitaisiin käyttää myös jäljittelemään ja ennustamaan suuren mittakaavan reaktoreiden suorituskykyä. Tältä osin olemme hiljattain osoittaneet, että hapen siirtonopeus ja tilavuusvirrankulutus (P/V) korreloivat hyvin pienikokoisissa (2 ml) ja laboratoriomittakaavan (100 ml) kuplakolonneissa, joissa käytetään kaasudiffuusoreita, joiden huokoskoko on sama, mikä mahdollistaa kLa:n ennustamisen P/V:n funktiona. Samassa työssä osoitimme myös vertailukelpoisen soluviljelytehon MBCR:n avulla suhteessa laboratoriomittakaavan STR:ään, joka perustuu samoihin kLa-arvoihin. Nämä tulokset osoittavat MBCR:n potentiaalin skaalautuvana laitteena. Tätä MBCR-laitteen prototyyppiä ei ollut instrumentoitu, vaikka myöhemmässä työssä olemme varustaneet laitteen optisilla fluoresenssilaastareilla ja käyttäneet sitä DOT:n mittaamiseen soluviljelyn aikana. Lämpötilaa voitiin säätää kytkemällä laite vesihauteeseen ja kierrättämällä lämpötilaa säätelevää vettä pylväiden välisen suljetun tilan läpi (ks. kuva 3). Vastaavanlaisia MBCR-laitteita ovat aiemmin kehittäneet muutkin ; nämä astiat käyttävät kuitenkin n. 200 ml:n tilavuuksia ja ovat siten kaksi kertaluokkaa suurempia kuin Doigin ym. kuvaama laite, mikä rajoittaa saavutettavissa olevaa rinnakkaistoiminnan astetta.
Kuvio 3
Kuvio UCL:ssä suunnitellun ja kehitetyn minikupla-kolumppureaktorin (miniature bubble column reactor eli MBCR)-prototyyppi.
Muut miniatyyrilaitteet
Hyödyntämällä integroidun anturilevyn konseptia MicroReactor Technologies (Mountain View, CA, USA) on kehittänyt hybridisoluviljelyjärjestelmän, joka perustuu ravistettuun, läpivirtauskuvioiseen 24-kuoppalevyiseen MTP-laitteeseen, jonka kuoppien konfiguraatio sallii tasaisen lämmönsiirron levyn läpi. Kunkin kuopan ehdotettu työtilavuus vaihtelee 3-5 ml:n välillä, ja ilmaa johdetaan nestemäiseen faasiin suihkuttamalla sitä kunkin kuopan pohjassa sijaitsevien sinttereiden kautta, mikä parantaa hapensiirtokykyä verrattuna vastaavalla tavalla suunniteltuihin ravistettuihin järjestelmiin. Tämä hiljattain kaupallistettu viljelylaite (jonka lisenssin Euroopassa on myöntänyt alankomaalainen Applikon Biotechnology AB) on varustettu kuituoptisilla antureilla, joiden avulla DOT- ja pH-arvoja voidaan seurata verkossa kaikissa kuopissa samanaikaisesti. Laite mahdollistaa myös lämpötilan, DOT:n, pH:n (kaasun suihkuttamisen avulla) ja ilmavirran nopeuden riippumattoman hallinnan kaikissa 24 kuopassa. Laitteella ratkaistaan yksi MTP-pohjaisten HT-laitteiden perusongelmista – nimittäin se, miten mittalaitteet sovitetaan kaikkiin levyyn sisältyviin kuoppiin – kiinnittämällä kaikki anturilaastarit kunkin kuopan pohjaan ja sijoittamalla sitten koko levy ravistelevalle inkubaattorialustalle, jossa on integroitu mittalaitepiiri, jolloin jokaista kuoppaa voidaan valvoa itsenäisesti. Tärkein käyttökohde on todennäköisesti prosessikehityksen alkuvaiheessa (esim. kannan valinta ja väliaineen optimointi). Julkisesti saatavilla ei ole vielä tietoja sekoittumisen ja hapensiirron teknisestä karakterisoinnista eikä viljelytehokkuuden vertailusta laboratoriomittakaavan bioreaktoritietoihin.
Viime aikoina on tehty kehitystyötä, jonka tavoitteena on pienentää MBR:n mittakaavaa alle millilitran prosessitilavuuteen. Vaikka nämä miniatyyrijärjestelmät tarjoavat suurimmat mahdollisuudet HT-sovelluksiin, on olemassa käytännön raja sille, kuinka pieniksi viljelytilavuudet voivat muuttua. Laitteissa, jotka käyttävät liian pieniä prosessitilavuuksia, voi olla mahdotonta suorittaa viljelyjä riittävällä seurannalla ja näytteenotolla. Vaikka OD-, DOT- ja pH-arvoja voidaan seurata verkossa, muita kriittisiä parametreja, kuten substraattikonsentraatiota ja tuotteen saantoa, ei useinkaan voida seurata; tämä ongelma voidaan kuitenkin ehkä kiertää tietyissä prosesseissa sisällyttämällä tuotteeseen merkkiaineita, kuten vihreää fluoresoivaa proteiinia. Haihtuminen voi muodostua merkittäväksi ongelmaksi näin pienissä viljelytilavuuksissa, jos työskennellään pitkien bakteeri- ja nisäkässoluviljelyprosessien parissa; erittäin pienen prosessitilavuuden vuoksi olisi myös teknisesti haastavaa valvoa pH:ta tarkasti nestettä lisäämällä. Toiminta-asteikko on kuitenkin radikaali edistysaskel MBR:ien suunnittelussa ja lisää merkittävästi niiden potentiaalista käyttöä HT-rinnakkaissoluviljelyssä.
Tältä osin Jensenin tutkimusryhmä MIT:ssä on kehittänyt alle millilitran MBR-prototyypin, jota on muokattu ja laajennettu moninkertaiseksi järjestelmäksi, joka kykenee suorittamaan kahdeksan instrumentoitua mikrosoluviljelyä, joiden työtilavuus on 150 μl . PMMA:sta ja poly(dimetyylisiloksaanista) (PDMS) valmistetut kasvatuskaivot on kiinnitetty tavanomaisia mikrovalmistusmenetelmiä käyttäen alumiinialustalle, joka sisältää kaikki anturielementit, ja hapen siirto mahdollistetaan diffuusiolla kaasun läpäisevän kalvon ja magneettisekoittimien kautta, jotka pystyvät ohjaamaan agitaatiota erikseen kullekin reaktorille. DOT-, pH- ja OD-arvoja voidaan seurata verkossa optisilla antureilla. Ryhmä raportoi, että laite voi ylläpitää E. coli -batch-viljelyä, mutta DOT laski 0 %:iin 2-3 tunnin kuluttua, mikä johtui mahdollisesti happirajoituksesta. Tämä on todennäköistä, kun otetaan huomioon, että tässä MBR:ssä mitattu suurin kLa-arvo oli vain 75 h-1 . Kirjoittajat osoittivat kuitenkin, että kasvukäyttäytyminen oli verrattavissa useilla suuremmilla soluviljelylaitteilla saatuihin tuloksiin. Sama tutkimusryhmä teki myös yksityiskohtaisen DNA-mikrosirujen geeniekspressioanalyysin E. coli -bakteerista, jota kasvatettiin 50 μl:n MBR:ssä . Tämä työ on todellinen edistysaskel MBR:n kehityksessä, sillä se ei ainoastaan todista periaatteen toimivuutta, vaan mahdollistaa myös geeniekspression erittäin rinnakkaisen analyysin, ja sitä voidaan käyttää parantamaan ymmärrystä solujen fysiologiasta viljelyn aikana käyttämällä järjestelmätason lähestymistapaa. Maharbiz et al. raportoivat mikrokuoppareaktoreita ja piimikrovalmistustekniikkaa yhdistävän array-pohjaisen laitteen kehittämisestä, joka pystyy tukemaan E. coli -bakteerin viljelyä kahdeksassa 250 μl:n kuopassa samanaikaisesti. Samoin kuin MIT-reaktorissa (kuvattu edellä) kuopat sijaitsivat pohjalevyn päällä, joka sisälsi antureita pH- ja OD-mittauksia varten (DOT-arvoa ei mitattu, mutta kirjoittajat toteavat, että se olisi toteutettavissa). Happea tuotettiin sähkökemiallisesti kussakin viljelyssä, ja sekoituksesta huolehti ruostumattomasta teräksestä valmistettu helmi, joka sekoitti viljelyä, hajotti happea ja hajotti pintavaahdon. Tämä tutkimusryhmä ei kuitenkaan toimittanut vertailukelpoisia bench-scale-tietoja, joiden perusteella olisi voitu määrittää, olisiko tällaisen laitteen skaalaus mahdollista.
Toisen kaupallisen järjestelmän HT-toimintoa varten on kehittänyt Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, Yhdysvallat). Tämä soluviljelylaite (nimeltään SimCell®) pystyy toimimaan ja ohjaamaan itsenäisesti jopa 1500 viljelmää, mikä mahdollistaa täydellisten faktoriaalisten koesuunnittelumenetelmien käytön prosessin optimoinnissa. Tämä ”reactor-on-a-chip”-laite perustuu mikrofluidiseen rakenteeseen, jossa on kaasun läpäisevä kalvo, joka mahdollistaa hapen siirtymisen ja sekoittumisen pyörittämällä mikrobioreaktorisiruja ympäristösäädellyissä inkubaattoreissa, joissa käytetään kostutettua ilmaa haihtumisen minimoimiseksi. Järjestelmä voidaan pitkälle automatisoida, ja siihen on integroitu robotti, jolla levyt siirretään inkubaattorista anturiasemaan pH:n, DOT:n ja solutiheyden mittaamista varten, sekä fluidiikka-asema, jossa voidaan lisätä väliaineita syöttöeräkäyttöä varten ja happoa/emästä pH:n säätöä varten. Kunkin reaktorin tilavuudet vaihtelevat noin 300 μl:stä noin 700 μl:iin sovelluksesta riippuen (mikrobi- tai nisäkässolut), ja kutakin reaktoria voidaan käyttää panos-, syöttö- tai perfuusiotilassa. Laitteen on osoitettu tukevan E. coli- ja hiivaviljelyä, ja sen kasvukinetiikka on vertailukelpoinen tavanomaisilla STR-laitteilla saatuihin kasvukinetiikoihin. Yritys on myös kuvannut CHO-solujen kasvua ilman happirajoitusta suurella solutiheydellä ja käyttänyt CFD-simulaatioita (Computational Fluid Dynamics) osoittaakseen, miten suuren mittakaavan pitched-blade-bioreaktoreissa nähty fyysinen ympäristö on luotu uudelleen. CFD:llä on mallinnettu järjestelmän kLa:ta, ja sen arvoksi on arvioitu 60-500 h-1, mikä on samankaltainen arvo kuin ravistelupulloissa ja suboptimaalisissa STR-analysaattoreissa havaitut arvot.
MBR:t mittakaavan pienentämisen välineenä
On huomattava, että kaikkia miniatyyrisoluviljelyjärjestelmiä ei ole suunniteltu olemassa olevien bioprosessien skaalauttamiseen/mittakaavan pienentämiseen; tässä katsauksessa on mainittu, miten tällaisia laitteita voidaan käyttää moniin sovelluksiin, kuten alkuvaiheen rekombinantti-/villityyppisten organismien arviointiin, kannan parantamiseen ja kasvualustan kehittämiseen. Prosessin kehittämisen myöhemmissä vaiheissa, esimerkiksi toiminnan ja viljelyolosuhteiden optimoinnissa käytettävien pienoissysteemien olisi kuitenkin oltava skaalattavissa. Tästä syystä on elintärkeää tutkia, voidaanko vakiintuneita ”nyrkkisääntöjä”, joita teollisuudessa käytetään usein penkkiprosesseista tuotantoastioihin skaalaamiseen, hyödyntää MBR-järjestelmien skaalaamisessa. Näihin hyväksi havaittuihin menetelmiin kuuluvat kaasutetun tehon tilavuusyksikköä kohti, sekoittimen kärkinopeuden, vakio-DOT:n, hapen aineensiirtokapasiteetin (kLa) tai sekoitusaikojen perusteella tapahtuva skaalaus. Yhtä kaikille sopivaa lähestymistapaa ei kuitenkaan ole olemassa, joten on korostettava, että mitään yksittäistä vastaavuusperustetta ei voida soveltaa yleisesti kaikkiin MBR-järjestelmiin. Yksikään tässä katsauksessa esitetyistä järjestelmistä ei pystyisi hyödyntämään kaikkia edellä kuvattuja vakiintuneita skaalaus- ja pienentämismenetelmiä. Esimerkiksi tasaista DOT-arvoa on vaikea saavuttaa ravistetuissa järjestelmissä verrattuna tavanomaisiin STR-järjestelmiin, koska mekaanisen sekoittamisen (ja MTP-pohjaisten järjestelmien tapauksessa sparrauksen) puuttuminen tarkoittaa, että kriittisen tason ylittävien DOT-pitoisuuksien hallitseminen näissä laitteissa on teknisesti hyvin haastavaa. Tämä erityispiirre ei sinänsä ole ongelma niin kauan kuin viljeltävät solut ovat riittävän hitaasti kasvavia (joko luonnostaan tai käyttämällä heikkoa kasvualustaa ja/tai toimimalla lämpötilassa, joka ei edistä maksimaalista kasvunopeutta), mutta se rajoittaa tällaisten järjestelmien käyttöä monissa korkean solutiheyden prosesseissa, joissa käytetään nopeasti kasvavia mikro-organismeja, joilla on suuri hapentarve.
Tietyn bioprosessin soluominaisuuksia ja prosessiolosuhteita tarkastelemalla voidaan saada viitteitä siitä, mitä skaalauskriteeriä olisi käytettävä tietyssä bioprosessissa (ja näin ollen myös siitä, mikä miniatyrisointialusta on suositeltavin kyseisessä prosessissa). Nopeasti kasvavalle organismille, kuten E. coli tai Bacillus subtilis, rajoittavaksi tekijäksi muodostuu yleensä hapen siirtyminen, kun taas leikkausstressi ei todennäköisesti ole merkittävä ongelma; siksi tällaisen soluviljelyn pienentäminen voitaisiin suunnitella samansuuruisen spesifisen tehontuonnin tai samansuuruisen kLa:n perusteella. Yhtä suuren kLa:n valinnan edellytyksenä on kuitenkin se, että miniatyyribioreaktoriin syötettävä teho voidaan arvioida tarkasti. UCL:ssä 10 ml:n MBR-reaktorilla tehty työ vahvistaa Bujalskin ja muiden aikaisemman työn, jossa osoitettiin, että juoksupyörän tehon määrä pienenee astian halkaisijan myötä. Siksi on tärkeää, ettei MBR:ssä käytetä tavanomaisen mittakaavan juoksupyörän teholukuja tehon arvioinnissa, koska tämä voi johtaa nopeasti reagoivien mikrobien happirajoituksiin, kun järjestelmään siirretty teho yliarvioidaan.
Erityinen haaste on filamenttisten organismien kasvattaminen niiden monimutkaisen morfologian vuoksi. Tällaisia organismeja sisältävillä käymisliemillä on suhteellisen korkea viskositeetti, ja ne vaativat ylimääräistä tehonsyöttöä riittävän sekoittumisen ja aineensiirron ylläpitämiseksi. Lisäksi filamenttiset organismit ovat paljon suurempia kuin yksisoluiset bakteerit, ja ne voivat olla herkempiä leikkausvaurioille. Esimerkiksi Heydarian et al. raportoivat, että erytromysiiniä tuottavan Saccharopolyspora erythraea -bakteerin keskimääräinen hyfaalien pituus ylitti Kolmogorovin turbulenssin mikroskaalan tavallisessa 7 litran bioreaktorissa laajalla käyttöolosuhteiden alueella . S. erythraea -bakteerin tapauksessa on osoitettu, että erytromysiinituotteen muodostuminen voi häiriintyä, jos myseeliä leikataan liikaa, jolloin hyfojen pituus on liian lyhyt . Tästä syystä voi olla suositeltavaa valita kärkinopeus mittakaavan pienentämisen perustaksi, kun käytetään filamenttisia organismeja. Vaikka filamenttiviljelmien pelletinmuodostusta sääteleviä mekanismeja ei tunneta hyvin, Vecht et al. ovat raportoineet korrelaatiosta pienenevän OTR:n ja keskimääräisen pelletin koon pienenemisen välillä Streptomyces tendae -bakteerissa. He päättelivät, että pelletin muodostuminen kyseisessä organismissa johtuu pääasiassa DOT:n ohjaamista hydrofobisista vuorovaikutuksista. Kun otetaan huomioon haitallinen vaikutus, joka pelletin muodostumisella voi olla sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden tuotantoon monissa säikeisorganismeissa – koska hapen imeytyminen pelletin keskelle estyy pelletin halkaisijan kasvaessa – on selvää, että kun säikeisorganismien soluviljelyprosesseja pienennetään, MBR-järjestelmissä on säilytettävä liuenneen hapen pitoisuudet, jotka vallitsivat suuressa mittakaavassa tapahtuvassa prosessissa, johon pienentäminen perustuu, jotta tuotetuotos säilyy. Yhtäläistä kLa:ta on vaikea käyttää mittakaavan pienentämisessä, koska se lasketaan yleensä mallijärjestelmissä, jotka muistuttavat vain vähän todellisia käymisliemiä. Lisäksi kLa:han vaikuttavat viljelyliemen koalesenssin ja reologian muutokset viljelyprosessin aikana – muutokset, joita on hyvin vaikea mitata ja ottaa huomioon. Bioreaktorin pienentämisen perustan valinnassa on keskeistä, ettei soluja altisteta suuremmille rasituksille kuin mitä suuressa mittakaavassa esiintyy.
Tässä katsauksessa käsitellyistä miniatyyrilaitteista on selvää, että jotkut pyrkivät geometrialtaan jäljittelemään suuren mittakaavan bioreaktoreita. Esimerkiksi useimmat MSBR:t ja MBCR:t ovat suurten bioreaktoreiden geometrisia kopioita. Geometrisen samankaltaisuuden säilyttämisestä on etua tehokkaan mittakaavavertailun kannalta, koska se mahdollistaa joidenkin keskeisten oletusten pysymisen voimassa; esimerkiksi saman kuvasuhteen säilyttäminen auttaa ennustamaan hydrostaattista painetta ja siten hapen liukoisuutta eri toiminta-asteikoissa. Tästä on etua tällaisille laitteille, koska niiden hapen siirto- ja sekoitusmekanismit sekä tehontarpeen laskentamekanismit voivat perustua samoihin periaatteisiin, jotka on vahvistettu suuressa mittakaavassa. Nestedynamiikka on samankaltaista, vaikka on tärkeää huomata, että joillakin nestedynamiikkaa kuvaavilla dimensiottomilla luvuilla, esimerkiksi Reynoldsin luvulla sekoitetuissa astioissa, ei näytä olevan yhtä suurta vaikutusta näin pienissä mittakaavoissa. Pohjimmiltaan kysymys on siitä, kuinka tehokkaita mekaanisesti erotellut reaktorit voivat olla, kun ne ovat niin pieniä, että niiden virtausominaisuudet sekä aineensiirto- ja sekoitusmekanismit ovat erilaiset kuin suurissa bioreaktoreissa, joita ne pyrkivät jäljittelemään. MTP:t ovat erityisen haavoittuvaisia tässä suhteessa, koska mekaanisen sekoituksen puute tarkoittaa, että pintajännitysvaikutukset ovat tärkeämpiä kuin monipuolisten biologisten reaktoreiden osalta, joissa juoksupyörät voivat vähentää tätä vaikutusta ja auttaa ylläpitämään tehokasta nesteen sekoittumista. Lisäksi on olemassa vaara, että käytettäessä äärimmäisiä olosuhteita monisäiliökaivoissa (ravistelutiheyden ja täyttömäärän suhteen) kaikki prosessineste muodostaa ohuen kalvon kaivon sisäpinnalle, mikä rajoittaa sekoittumista huomattavasti ja pahentaa pintajännityksen haitallista vaikutusta. Jos olosuhteet ovat erilaiset pienessä ja suuressa mittakaavassa sekoittumisen ja kaasun ja nesteen välisen aineensiirron osalta, se voi johtaa ongelmiin, esimerkiksi tuotantoon soveltumattomien kloonien valintaan tai eroihin tuotteen laadussa erityisesti rekombinanttiproteiinien osalta. Toisaalta Michelettin ja muiden tekemä työ osoittaa, että mittakaavan siirto ravistetuista järjestelmistä sekoitettaviin järjestelmiin on mahdollista, jos mittakaavan nostokriteerit valitaan huolellisesti. Käyttämällä äskettäin käyttöön otettua korrelaatiota kLa:n ennustamiseksi MTP:ssä he pystyivät onnistuneesti kasvattamaan E. coli-entsyymiä yli-ilmentävästä transketolaasientsyymistä mikrosyvennysjärjestelmästä (tilavuus 1 ml) 1,4 l:n STR-järjestelmään vakion kLa:n perusteella. Sama ryhmä antaa myös alustavia tietoja nisäkässoluviljelyprosessin tyydyttävästä skaalauttamisesta käyttäen vakioenergian keskimääräistä häviämisnopeutta.
MBR:ien automatisointi
MBR:ien automatisointi on avain HT-valmiuksien laajentamiseen. Useissa viime aikoina kehitetyissä miniatyyrijärjestelmissä käytetään lähtökohtana muunnettua MTP:tä (esim. Applikon MicroReactor®). Nämä järjestelmät näyttävät tällä hetkellä lupaavilta, koska ne on helppo integroida olemassa oleviin robottiautomaatiojärjestelmiin. MTP:t, joihin tällaiset järjestelmät on suunniteltu, perustuvat vakiojalanjälkeen, ne ovat mekaanisesti yksinkertaisia, ja juuri niiden rakenteen standardointi tekee niistä ihanteellisia sisällytettäväksi automatisoituihin robottialustoihin, jotka todella vievät tällaiset teknologiat HT-alueelle ja antavat niille kyvyn suorittaa satoja soluviljelmiä rinnakkain, ja niiden pohjapinta-ala ei ole juurikaan suurempi kuin tavanomaisen pilottimittakaavan bioreaktorin. Vaihtoehtona on kehittää miniatyyribioreaktorijärjestelmä, joka on itsessään automatisoitavissa. Weuster-Botzin ryhmän yhteistyössä H+P Labortechnikin ja Bioprocessors Corp:n kanssa kehittämä teknologia on esimerkki tästä lähestymistavasta. Tällaiset laitteet tarjoavat jonkin verran HT-ominaisuuksia sekä kehittynyttä sisäänrakennettua robotiikkaa, kuten Bioprocessors Corp:n SimCell®-järjestelmässä.
MBR-laitteiden yhteydessä käytetyissä robottilaitteissa on tavallisesti moniputkipäät, jotka on asennettu käsivarsiin, jotka pystyvät liikkumaan kolmiulotteisesti koko työalueella. Pipetointipäät voivat myös selviytyä erilaisista MBR-geometrioista, ja erilliset robottivarret voivat poimia ja sijoittaa apulaitteita mihin tahansa työtilaan. Tämä poiminta- ja sijoittelukyky tarkoittaa, että yksi robotti voi inokuloida, säätää pH:ta, ottaa näytteitä ja tehdä lisäyksiä MBR:ään, mikä tarjoaa aidosti integroidun ratkaisun. Lisäksi robotit voivat yhdistää soluviljelyalustat analyysilaitteisiin (esim. HPLC-järjestelmiin) ja suorittaa monimutkaisia määrityksiä, kuten vasta-ainetuotteiden ELISA-tutkimuksia reaaliaikaisilla näytteillä – määrityksiä, joissa hyödynnetään robotin kykyä suorittaa tuhansia nesteenkäsittelytoimintoja lyhyessä ajassa. Aseptiset soluviljelyolosuhteet voidaan ylläpitää sijoittamalla robotti räätälöityyn bioturvallisuuskaappiin.