PEG-saostus:

Pelletin talteenottomenetelmän osoitettiin vaikuttavan merkittävästi uudelleen liuotetun tuotteen puhtauteen. Saostusvaihe on helposti skaalattavissa ja sopii täysin kertakäyttöiseen jatkojalostusprosessiin.

Percivia LLC

Pyrkimykset ovat käynnissä vaihtoehtojen löytämiseksi pakatulle petikromatografialle, jotta voitaisiin vähentää aikaa ja kustannuksia korkean titterin tuotevirtojen käsittelyssä. Vaikka monissa ponnisteluissa keskitytään kalvoadsorbereihin, jotka korvaavat suoraan samaa tai samankaltaista kemiaa käyttävät kolonnit, jotkin vanhemmat teknologiat ovat alkaneet saada jalansijaa rekombinanttiproteiinien valmistuksessa. Yksi houkutteleva vaihtoehto kromatografialle on saostus, jota on käytetty plasmaproteiiniteollisuudessa jo vuosia.1 Yksinkertaisessa saostusmenetelmässä prosessinestettä titrataan saostettavan proteiinin isoelektriseen pisteeseen.2 Tämä menetelmä on hyvin yksinkertainen. Lyotrooppisia suoloja, kuten ammoniumsulfaattia, on myös käytetty pitkään saostusprosesseissa.3 Lyhytketjuiset rasvahapot, kuten kapryylihappo, ovat tunnettuja kyvystään saostaa DNA:ta ja isäntäsoluproteiineja (HCP:t).4 Myös polyioniset lajit ovat käyttökelpoisia saostusaineita, kun haluttua tuotetta halutaan ottaa talteen tai kun halutaan poistaa epäpuhtauksia sisältäviä proteiineja5,6.

Polyetyleeniglykolia (PEG) on käytetty tuotteen ja epäpuhtauksien saostamiseen.7,8 Sitä voidaan myös yhdistää isoelektriseen saostukseen erottelun tehokkuuden parantamiseksi.9,10 Saostuksen jälkeen voidaan käyttää sentrifugointia tai suodatusta kiinteän ja nestemäisen aineen erottamiseen.11 Vaikka sentrifugointi on vakiintunut menetelmä erottelun aikaansaamiseksi, tuotepelletin pesu epäpuhtauksien poistamiseksi voi olla ongelmallista, eikä se sovellu kertakäyttöprosessiin. Suodatus – normaali- tai tangentiaalivirtaus – vaatii enemmän kehitystyötä, mutta pelletin pesu on yksinkertaisempaa, ja se on helposti sovitettavissa kertakäyttöprosessiin.

Tässä työssä kehitettiin PEG:tä käyttävä tuotteen saostusvaihe monoklonaalisen vasta-aineen (MAb) talteenottamiseksi selkeytetystä PER.C6-soluviljelyaineesta. Sopivat saostusolosuhteet tunnistettiin käyttämällä täydellisiä faktoriaalisia koesuunnitelmia. Kaksi suodatusvaihetta arvioitiin saostetun tuotteen talteenottoa ja pesua varten, ja parempi menetelmä skaalattiin 10-kertaiseksi. Koko saostusprosessi johti noin 90 prosentin saantoon ja HCP:n vähenemiseen 1 LRV:llä ilman, että uudelleen liuenneen MAb:n aggregaattitaso nousi merkittävästi. Lopuksi tutkittiin saostusvaiheen vaikutusta seuraavaan kationinvaihtovaiheeseen (CEX).

Materiaalit ja menetelmät Reagenssit

USP-luokan suolat, Tween 20, suolahappo, etikkahappo ja natriumhydroksidi ostettiin JT Bakerilta (Phillipsburg, NJ). PEG oli reagenssilaatua ja ostettu JT Bakerilta tai EMD Chemicalsilta (Gibbstown, NJ). Kaikki puskurit valmistettiin MilliQ-luokan vedestä (Millipore, Billerica, MA), ja ne suodatettiin 0,22 µm:n suodatuksella ennen käyttöä.

Raaka-aine

Human MAb (IgG1, pI = 8.3, 150 kDa) tuotettiin Percivia, LLC:ssä käyttäen PER.C6-solulinjaa. PER.C6-solut ovat ihmisen alkion verkkokalvon soluja, jotka on kuolemattomiksi tehty adenovirus E1-geenillä, kuten Yhdysvaltain patentissa 5,994,128 on kuvattu.12 Soluja kasvatettiin tavallisessa fed-batch-prosessissa tai XD-prosessissa, joissa molemmissa käytetään kemiallisesti määriteltyä elatusainetta.13,14 Fed-batch-mediat selkeytettiin sedimentoimalla ja syväsuodattamalla, ja XD-mediat selkeytettiin tehostetun solujen laskeutumisen (enhanced cell settling, ECS) menetelmällä, jota seurasi syväsuodatus.15 ECS-menetelmässä käytettiin Silica-PEI-hartsia tehostamaan solujen laskeutumista ja vähentämään myös DNA:ta ja HCP:tä.

Saostusolosuhteiden optimointi

MAb:n saostamiseen käytetyt olosuhteet – PEG:n molekyylipaino, PEG:n konsentraatio ja pH-arvo – optimoitiin täydellä faktoriaalisella koesuunnittelulla käyttäen Minitab-ohjelmistoa (State College, PA). Kirkastetun XD-median pH säädettiin halutulle tasolle 2-M Tris:llä 15 ml:n kartioputkessa. PEG lisättiin 40-prosenttisena (w/w) kantaliuoksena haluttuun loppupitoisuuteen. Tämän jälkeen putki sentrifugoitiin 1 000 g:ssa ja supernatantti dekantoitiin. Lopuksi pelletti liuotettiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS).

Pelletin talteenotto syvyyssuodatuksella tai mikrosuodatuksella

Syvyyssuodatus suoritettiin erilaatuisilla suodatinmedioilla. Millistak+HC D0HC, C0HC ja X0HC ostettiin Millipore Corp. (Billerica, MA), ja ZetaPlus 60SP02A ostettiin Cunolta (Meriden, CT). Saostus suoritettiin käyttäen 40 % (w/w) PEG-3350:n kantaliuosta, ja saostettu väliaine ladattiin syöttövirralla 50 L/m2 /h, kunnes kaikki materiaali oli ladattu tai transmembraanipaine (TMP) oli 15 psid. Tämän jälkeen suodattimet pestiin 20-30 L/m2 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4 % (w/w) PEG-3350:llä. Pesun jälkeen suodattimien läpi johdettiin 80 l/m2 resolubilointipuskuria nopeudella 100 l/m2 /h, ja permeaattia kierrätettiin laitteen läpi nopeudella 600 l/m2 /h, kunnes permeaattilammikon A280-arvo oli vakaa, mikä osoitti MAb:n täydellistä liukenemista. Lopuksi kaikki pidättynyt tuote kerättiin talteen 20 l/m2 puskurihuuhtelulla ja suodatinmoduulin ilmapuhalluksella. Joissakin testeissä suodatinmedia pestiin tämän jälkeen 85-mM-asetaatilla pH 5,3 ja sen jälkeen 1-M NaCl:llä. Paine- ja virtaustiedot kerättiin ARC Technology Servicesin (Nashua, NH) räätälöidyllä järjestelmällä.

Mikrosuodatus suoritettiin GE Healthcare Life Sciencesin (Piscataway, NJ) 0,22 µm:n onttokuitumembraanilla. PEG-3350 lisättiin 40-prosenttisena (w/w) kantaliuoksena pienimuotoista koetta varten ja jauheena scale-up-työtä varten. Syöttövirta oli 710 L/m2 /h ja retentaatti ja permeaatti olivat rajoittamattomia. Sakka konsentroitiin ensin 10–14-kertaiseksi ja pestiin sitten kolmella diafiltraatiomäärällä 20 mM Tris pH 8,5:tä ja 14,4 % (w/w) PEG-3350:tä. Lopuksi sakka liuotettiin uudelleen 85 mM natriumasetaattiin pH 5,3 tai 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5. Paine-, virtaus- ja johtokykytiedot kerättiin Slice 200 -penkkijärjestelmällä (Sartorius, Gottingen, Saksa) pienen mittakaavan testejä varten ja SciPro-järjestelmällä (SciLog, Middleton, WI) mittakaavan suurennuskokeita varten.

Kationinvaihtokromatografia

Toyopearl GigaCap S-650 hankittiin Tosoh Bioscience -yhtiöltä (Montgomeryville, PA) Toyoscreen 5 ml:n muodossa. Tämä hartsi on aiemmin osoitettu suurikapasiteettiseksi sieppausvaiheeksi MAb:eille.16 Kolonni tasapainotettiin 74-mM natriumasetaatilla pH 5,3:lla ja ladattiin 90-95 mg-MAb/mL hartsia joko selkeytetyllä väliaineella tai selkeytetyllä ja PEG:llä käsitellyllä materiaalilla, jotka kumpikin oli säädetty samaan pH:han ja johtokykyyn kuin tasapainotuspuskuri. Tämän jälkeen kolonni pestiin ekvibrointipuskurilla ja vasta-aine eluoitiin 50 mM natriumasetaatilla pH 5,3 ja 90 mM NaCl:lla.

Analyyttiset tekniikat

MAb-pitoisuus väliaineita sisältävissä näytteissä määritettiin analyyttisellä Protein A HPLC:llä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Aggregaattipitoisuudet mitattiin koko-ekskluusiokromatografialla (SEC) Tosoh Biosciencen (Montgomeryville, PA) TSKgel G3000SWXL -kolonnilla, jossa piikki havaittiin UV-absorbanssilla 280 nm:ssä. HCP-pitoisuudet kvantifioitiin Cygnus Technologiesin (Southport, NC) PER.C6-spesifisellä ELISA-testillä. SDS-PAGE tehtiin NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geeleillä ja värjäys tehtiin SimplyBlue SafeStain -värjäyksellä, molemmat Invitrogenilta (Carlsbad, CA).

Tulokset ja keskustelu Saostusolosuhteet

Molemmilla PEG:n molekyylipainoilla, 3350 ja 6000 Da, PEG-konsentraatio oli hallitseva tekijä uudelleen liuotetun MAb:n talteenoton ja puhtauden kannalta. Saostaminen PEG-3350:llä johti korkeimpaan saantoon (kuva 1). Suurempi talteenotto tapahtui kuitenkin sen kustannuksella, että uudelleen liuotetun MAb:n HCP-kuormitus oli suurempi. Aggregoituneen MAb:n osalta tasot eivät eronneet merkittävästi lähtöaineesta, mutta on huomattava, että tässä työssä käytetty MAb ei ole altis muodostamaan aggregaatteja. HCP:n vähentämisen paraneminen PEG-6000:n käytöllä kompensoitui tuotteen saannon vähenemisellä. Lopulliseksi olosuhteeksi valittiin 14 % (w/v) PEG-3350 (vastaa 14,4 % w/w) ja pH 8,5.

Kuva 1

Pelletin talteenotto syväsuodatuksella

Ensimmäisessä kokeessa ECS-selkeytetty XD-media saostettiin ja pelletti talteenotettiin syväsuodatuksella X0HC-medialla. Transmembraanipaineessa (TMP) ei havaittu merkittävää nousua 361 g-MAb/m2 :n latauksen aikana (tietoja ei ole esitetty). Pesun jälkeen immobilisoidun pelletin resolubilointi tehtiin 85 mM asetaatilla pH 5,3. Edes 2 tunnin kierrätyksen jälkeen vasta-aine ei ollut täysin liuennut, joten resolubilointipuskuriin lisättiin 0,1 % v/v Tween 20:tä. Vielä 30 minuutin resolubilisaation jälkeen MAb oli täysin liuennut.

Taulukko 1. Saanto ja epäpuhtauksien poisto PEG-saostusoperaatiossa, jossa käytettiin syvyyssuodatusta X0HC:llä tuotteen talteenottamiseksi

Massatasapainotiedot on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. HCP:n vähennys oli pienempi kuin edellisessä kokeessa (kuva 1), jossa HCP:tä oli lopullisessa altaassa vain 5000 ppm verrattuna 8300 ppm:ään tässä kokeessa. Joillakin syvyyssuodattimilla tiedetään kuitenkin olevan hydrofobisia ja anioninvaihtoon (AEX) liittyviä adsorptio-ominaisuuksia.17 Saostettu väliaine ladattiin suhteellisen korkealla pH:lla (8,5) ja matalalla sähkönjohtavuudella (<10 mS/cm), mikä on saattanut aiheuttaa happamien proteiinien sitoutumisen AEX-matriisiin. Lisäksi PEG:n läsnä ollessa ioninvaihtomatriisien proteiinien sitoutumiskapasiteetin on osoitettu kasvavan.18,19 Siksi on todennäköistä, että osa HCP:istä, jotka jäivät liuokseen saostuksen jälkeen, sitoutuivat syvyyssuodatinmediaan ja eluoituivat tuotteeseen resolubilisaation aikana. Tätä hypoteesia tukee myös saostuksen supernatantin ja syvyyssuodattimen läpivirtauksen HCP-pitoisuuksien ero (9 900 mg vs. 240 mg), mikä viittaa HCP:n poistumiseen liuoksesta syvyyssuodattimella. Kun vasta-aine oli immobilisoitu syvyyssuodattimeen, se liuotettiin uudelleen huomattavasti alhaisemmassa pH:ssa (5,3), mikä johti sitoutuneen HCP:n eluoitumiseen ja vähensi lopputuotteen puhtautta. Tätä ilmiötä voitaisiin lieventää käyttämällä vähemmän adsorptiokykyisiä syvyyssuodatinmedioita, kuten Millistak+HC D0HC/C0HC- ja ZetaPlus SP -suodattimia, kuten 60SP02A, tai liuottamalla tuote uudelleen vähäsuolaiseen, korkeamman pH:n puskuriin, kuten 20 mM Tris pH 7,5.

Kuva 2

Nämä strategiat testattiin lataamalla saostettua fed-batch-mediaa D0HC-, C0HC-, X0HC- ja 60SP02A-suodattimiin. Kaikki suodattimet pestiin identtisesti PEG/Tris-puskurilla, mutta resolubilointi tehtiin Millipore-suodattimien osalta 20 mM Tris pH 7,5:llä plus Tween 20:llä ja Cuno-suodattimien osalta 85 mM asetaattia pH 5,3:lla plus Tween 20:lla. Millipore-suodattimet stripattiin myös matalan pH:n puskurilla (85 mM asetaattia pH 5,3) ja korkean suolapitoisuuden puskurilla (1 M NaCl) sen jälkeen, kun tuote oli saatu talteen, jotta voitiin määrittää, voitiinko sitoutuneet HCP:t eluoida. Kuva 2 osoittaa, että kaikki testatut suodattimet likaantuivat huomattavasti. Koska syötetyn erän väliaineita ei selkeytetty ECS-menetelmällä, jonka on osoitettu vähentävän merkittävästi DNA-pitoisuuksia XD-sadoissa, niissä saattoi olla enemmän DNA:ta, joka saostuu korkeissa PEG-pitoisuuksissa.20 Saostuman suurempi DNA-pitoisuus saattoi vähentää suodattimien kapasiteettia, mutta tätä ei ole tutkittu. Taulukosta 2 käy ilmi, että kussakin kokeessa HCP:tä saatiin vähennettyä paremmin (84-88 % verrattuna 46 %:iin), ja vaikka HCP:n lähtökuormitus oli suurempi (49 000 ppm verrattuna 13 000 ppm:ään), uudelleen liuotettujen MAb-altaiden HCP-pitoisuudet olivat yleensä alhaisemmat (6000-7 800 ppm verrattuna 8300 ppm:ään). Matalan adsorptiokyvyn omaavien suodattimien käyttö ja uudelleenliuotus korkeamman pH:n puskurissa näyttävät ratkaisevan syvyyssuodatinmateriaalista eluoituvien HCP:iden aiheuttaman ongelman. Liuskafraktioiden SDS-PAGE paljasti, että sekä HCP:t että tuote olivat sitoutuneet suodattimiin – myös vähemmän adsorptiokykyisiin D0HC- ja C0HC-suodattimiin – ja vahvisti, että X0HC-väliaine oli adsorptiokykyisempi kuin D0HC- ja C0HC-väliaineet (kuva 3).

Taulukko 2. Saanto ja epäpuhtauksien poisto PEG-saostusoperaatiossa, jossa käytetään syvyyssuodatusta eri suodatinmedioilla tuotteen talteenottamiseksi

Pelletin talteenotto mikrosuodatuksella

Vaikka uudelleen liuenneen MAb:n HCP-taakka väheni käyttämällä puskuria, jonka pH on korkeampi, ja vähemmän adsorptiokykyisiä syvyyssuodatinmedioita, syvyyssuodattimien kapasiteetit olivat alhaiset syötetyillä medioilla varustetuilla syvyyssuodattimilla (”fed-batch” -medioilla) (<400 g-MAb/m2 ). Mikrosuodatusta (tangentiaalivirtaussuodatus, MF TFF) testattiin kapasiteetin parantamiseksi, ja lisähyötynä oli, että resolubilointiin voitiin käyttää mitä tahansa puskuria onttojen kuitujen alhaisen sitoutumisominaisuuden vuoksi. MF TFF:n hydraulinen suorituskyky konsentroinnin ja syötetyn erän saostuksen pesun osalta on esitetty kuvassa 4. Permeaattivirta oli noin 100 L/m2 /h ja TMP oli välillä 1,0-2,5 psid koko toiminnan ajan. Massakuormitus 475 g-MAb/m2 oli parempi kuin missään syvyyssuodatusoperaatiossa saavutettu massakuormitus. Tuotteen talteenotto ja HCP:n vähennys olivat molemmat noin 90 prosenttia, mikä on hieman parempi kuin syväsuodatuksessa saavutettu tulos (taulukko 3).

Kuva 3

Resolubilointi oli paljon yksinkertaisempaa ja nopeampaa kuin syvyyssuodatuksessa; sen sijaan, että puskuria olisi kierrätetty laitteen läpi, puskuri pumpattiin lumenien sisäpuolelta retentaattiastiaan permeaatti suljettuna ja sen annettiin sekoittua noin 60 minuutin ajan. Tämä riitti liuottamaan vasta-aineen uudelleen, eikä apuaineita tarvittu. Koska resolubilisaatio oli vaikeaa syvyyssuodatuksessa, tuote liuotettiin uudelleen syöttöaineen pitoisuudessa tai lähellä sitä. MF TFF -prosessista saatu lopullinen pooli oli lähes kaksi kertaa konsentroituneempi kuin lähtöaine.

Kuva 4

Koska retentaatti ja permeaatti olivat avoimia ilmakehän paineelle, tarvittiin minimaalinen instrumentointi: ristivirtauspumppu, yksi paineanturi ja siirtopumppu diafiltrausta varten. Suuren kapasiteetin, korkean talteenoton ja HCP-puhdistuman sekä toiminnan yksinkertaisuuden yhdistelmä tekee MF TFF:stä paremman vaihtoehdon pellettien talteenottoon verrattuna syvyyssuodatukseen. Saostus- ja MF TFF-vaihe skaalattiin 10-kertaiseksi 0,12 m2 :n onttokuitulaitteeseen, ja suorituskyky oli verrattavissa pieneen mittakaavaan (taulukko 4).

Taulukko 3. Saanto ja epäpuhtauksien poisto PEG-saostusoperaatiossa, jossa käytettiin mikrosuodatusta tuotteen talteenottoon penkkiasteikolla

Kationinvaihtokromatografia

Korkeakapasiteettista kationinvaihtokromatografiaa (CEX-kromatografia) arvioitiin syötteillä, jotka oli esikäsitelty PEG-saostuksella tai ilman. Saostusvaiheella ei ollut merkittävää vaikutusta vaiheen saantoon tai HCP:iden prosentuaaliseen vähenemiseen, mutta saostetusta kuorma-aineesta saadussa eluaatissa oli seitsemän kertaa vähemmän HCP:tä (taulukko 5).

Taulukko 4. Saanto ja epäpuhtauksien poisto PEG-saostusoperaatiossa, jossa käytettiin mikrosuodatusta tuotteen talteenottoon pilot-mittakaavassa

Johtopäätökset

Plasmaproteiiniteollisuudessa on jo pitkään käytetty saostusta proteiinien puhdistamiseen suuressa mittakaavassa. Tekniikka on tässä sovitettu aluksi MAb-puhdistukseen selkeytetyistä fed-batch- ja XD-medioista skaalautuvalla tavalla. Kaksi kertakäyttöistä suodatusvaihetta on kehitetty saostetun tuotteen talteenottoa ja pesua varten, jolloin sentrifugointia ei tarvita. Osoitettiin, että saostustoiminto ei vaikuttanut negatiivisesti CEX-sieppausvaiheen saantoon, ja se vähensi eluaatin HCP-pitoisuutta seitsenkertaisesti.

Taulukko 5. Saanto ja HCP:n poisto GigaCap S-650:lle, joka on ladattu saostetulla (+PEG) ja saostamattomalla (âPEG) vasta-aineella

Kyky vähentää epäpuhtauskuormitusta niin pitkälle puhdistusketjun alkupäässä on avainasemassa, kun halutaan typistää tuotantoketjun loppupäässä tapahtuvaa prosessia tai korvata perinteinen kromatografia jollain muulla kertakäyttötekniikalla. Pienemmällä epäpuhtauskuormalla voidaan parantaa läpivirtauskalvoadsorberien ja mahdollisesti virussuodattimien kuormituskapasiteettia, jotka ovat yleensä hyvin kalliita osia prosessissa.

Lisähyötynä on mahdollisuus liuottaa vasta-aine uudelleen puskuriin, joka helpottaa myöhempää yksikön toimintaa. Esimerkiksi soluviljelymedia vaatii tyypillisesti laajaa titrausta ja laimennusta tai UF-DF-vaihetta, jotta se voidaan valmistella kationinvaihtimella tapahtuvaa sieppauskromatografiaa varten. Tässä tapauksessa saostettu vasta-aine voidaan liuottaa tasauspuskuriin suurina pitoisuuksina, mikä lyhentää käsittelyaikaa. Tämä voi olla tärkeää tuotteille, jotka eivät siedä pitkää altistumista alhaiselle pH:lle/johtokyvylle. Tämän vasta-aineen tapauksessa selkeytetty väliaine vaatii yli kaksinkertaisen laimennuksen, jotta se voidaan ladata CEX-kolonniin, kun taas uudelleen liuotettu MAb voidaan ladata suoraan lähes kaksinkertaisena pitoisuutena säätämättömään väliaineeseen verrattuna. Tämä on vähintään nelinkertainen vähennys lataustilavuudessa, mikä voi johtaa huomattavaan ajansäästöön nykyaikaisilla, suurikapasiteettisilla CEX-hartseilla.

Kiitokset

Tekijät haluavat kiittää Percivian proteiini- ja analyysitieteitä tämän työn määritystuesta ja Percivian tuotantoketjun alkupään prosessien kehitysryhmää soluviljelymedian toimittamisesta.

Huomautus tavaramerkistä

PER.C6 on Crucell Holland BV Corporationin rekisteröity tavaramerkki, XD on DSM NV:n rekisteröity tavaramerkki ja ECS on DSM NV:n rekisteröity tavaramerkki. Kaikki muut tuotenimet ovat omistajiensa tavaramerkkejä.

MICHAEL KUCZEWSKI on tutkija I, EMILY SCHIRMER, PhD, on tutkija II, BLANCA LAIN, PhD, on vanhempi tutkija ja GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, PhD, on vanhempi johtaja, kaikki tuotantoketjun myöhemmän vaiheen prosessikehityksessä, Percivia LLC, Cambridge, Massachusetts, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. Seerumin ja plasman proteiinien valmistus ja ominaisuudet. IV. Järjestelmä biologisten kudosten ja nesteiden proteiini- ja lipoproteiinikomponenttien erottamiseksi fraktioihin. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Proteiinipohjaisten rakenteiden valmistus haihtuvan hapon avulla. In: 224th National Meeting of the American Chemical Society. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Preparation of human immunoglobulin by ammonium sulfate precipitation. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. Prosessista peräisin olevien epäpuhtauksien saostaminen muissa kuin proteiini A:n vasta-aineiden puhdistusjärjestelmissä. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Selective antibody precipitation using polyelectrolytes: A novel approach to the purification of monoclonal antibodies. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, keksijät; Millipore Corp., luovutuksensaaja. Proteiinien puhdistus. Yhdysvaltain patentti US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, keksijä; South African Inventions Development Corporation, luovutuksensaaja. Proteiinipitoisten aineiden seosten fraktiointi polyetyleeniglykolia käyttäen. Yhdysvaltain patentti US 3415804. 1968.

8. Giese G. Monoklonaalisten vasta-aineiden polyetyleeniglykolisaostus ja sen vaikutus pylväskromatografiaan. In: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Thrash S, Otto J, Deits T. Divalenttien ionien vaikutus proteiinien saostamiseen polyetyleeniglykolin avulla: vaikutusmekanismi ja sovellukset. Proteiinien ilmentäminen ja puhdistus. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, keksijät; Amgen, luovutuksensaaja. Menetelmä vasta-aineiden eristämiseksi saostamalla. Yhdysvaltain patentti US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Selective precipitation-assisted recovery of immunoglobulins from bovine serum using controlled-fouling crossflow membrane microfiltration. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, keksijät; IntroGene B.V, luovutuksensaaja. Geeniterapiassa käytettävien ihmisen rekombinanttisten adenovirusten pakkausjärjestelmät. Yhdysvaltain patentti US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. XD-prosessi: korkean titterin prosessin kehittäminen PER.C6-soluille. In: 21st Meeting of the European Society of Animal Cell Technology. Dublin, Irlanti; 2009.

14. Chon J. Advances in platform fed-catch and XD production processes using the PER.C6 human cell line. Wilbio Waterside Conference; 2009 20.-22.4.2009; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Primary clarification of extreme-density cell culture harvests by enhanced cell settling. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography. Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. Syvyyssuodattimien adsorptio-ominaisuuksien hyödyntäminen isäntäsoluproteiinin poistamiseksi monoklonaalisten vasta-aineiden puhdistuksessa. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Proteiinien ioninvaihtokromatografia: liikkuvan faasin neutraalien polymeerien vaikutus. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Menetelmä ainutlaatuisten selektiivisyyksien saamiseksi ioninvaihtokromatografiassa lisäämällä orgaanisia polymeerejä liikkuvaan faasiin. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. DNA:n saostaminen polyetyleeniglykolin ja etanolin avulla. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.