PLOS ONE

Keskustelu

Suurin osa kemoterapeuttisista lääkkeistä on suunniteltu erityisesti häiritsemään DNA-synteesiä, solujen aineenvaihduntaa ja solujen jakautumista. Tämän vaikutustavan vuoksi näiden lääkkeiden odotetaan aiheuttavan monenlaisia mutaatioita . Kemoterapeuttisten lääkkeiden mutageenisuus normaaleille soluille on yksi kemoterapian vakavimmista ongelmista, koska se voi aiheuttaa sekundaarisia pahanlaatuisia kasvaimia ja epänormaaleja lisääntymistuloksia, kuten Downin, Klinefelterin ja Turnerin oireyhtymiä. Siksi on välttämätöntä määrittää kemoterapialääkkeiden mutageeninen vaikutus normaaleihin soluihin. Mikrotumatestiä on käytetty laajalti korjaamattomien genomivaurioiden mittaamiseen, ja lisääntynyt MN-taajuus ennustaa syöpäriskiä ihmisillä. Koska MN voi johtua kromosomien rikkoutumisesta (klastogeenisuus) tai jäljelle jääneistä kromosomeista (aneugenisuus), MN:n havaitsemista voidaan käyttää numeeristen kromosomipoikkeavuuksien indusoitumisen seulana, jos mukaan otetaan testit, jotka mahdollistavat kokonaisten kromosomien tunnistamisen MN:n sisällä, kuten FISH-testi.

Epirubisiinin klastogeeninen aktiivisuus mitoosin aikana in vivo raportoitiin luuytimen MN-testin avulla . Tällä hetkellä epirubisiinin aiheuttaman MN:n alkuperää ei ole vielä määritetty. Siksi tässä tutkimuksessa tutkittiin epirubisiinin kykyä indusoida aneuploidiaa uroshiirten somaattisissa ja sukusoluissa. Menetelmän tehokkuuden määrittämiseksi käytettiin positiivisina kontrolleina kahta mallimutageenia, kolkisiinia ja mitomysiini C:tä, joilla tiedetään olevan aneugeenisia ja klastogeenisia vaikutuksia. Tässä tutkimuksessa havaitut MNPCE:n tulokset ja signaalien jakautuminen MN:ää kohti kontrollissa ja kahdessa positiivisessa mutageenissä vastaavat hyvin julkaistuja tietoja , . Nämä tiedot vahvistivat genotoksisten vaikutusten havaitsemisessa noudatetun koeprotokollan herkkyyden.

MN-testin tulokset osoittivat, että epirubisiini aiheuttaa annosriippuvaista MN:n muodostumisen lisääntymistä hiiren luuytimessä in vivo (kuva 1) ja sentromeerisesti negatiivisten ja sentromeerisesti positiivisten värjäytyneiden MN:n lisääntymistä, mikä osoittaa sekä klastogeenisuuden että aneugeenisuuden induktiota (kuva 2). Sekä epirubisiinin klastogeeninen että aneugeeninen potentiaali somaattisissa soluissa voi johtaa sekundaarikasvainten kehittymiseen. Klastogeenisuutta koskevat tulokset vahvistavat aiempien in vivo -tutkimusten havainnot, joissa hiiren somaattisten solujen MN-muodostuksen ja rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien lisääntymistä havaittiin samanlaisella annosalueella epirubisiinihoidon jälkeen. Näiden tutkimusten tulokset vastaavat myös aiemmin raportoitua epirubisiinin aiheuttamaa mikrotumien induktiota hiirten syöpäsoluissa in vitro , inkuboitujen kananmunien erytrosyyteissä ja ihmisen lymfoblastoidisessa TK6-solulinjassa . Lisäksi rakenteellisten ja numeeristen kromosomipoikkeavuuksien induktiosta on aiemmin raportoitu myös syöpäpotilailla, jotka saivat epirubisiinia sisältävää kemoterapiaa . Aiemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että epirubisiini aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä HeLa-soluissa , sekä rakenteellisia että numeerisia kromosomipoikkeavuuksia ja sisarkromatidivaihtoja kiinalaisen hamsterin solulinjassa sekä kromosomipoikkeavuuksia perifeerisen veren lymfosyyttiviljelmissä, jotka ovat peräisin rintasyöpään sairastuneilta naisilta, joita on hoidettu epirubisiinia sisältävällä hoidolla in vitro .

Ihmisillä tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että tietyt solunsalpaajahoidot lisäävät aneuploidian esiintymistiheyttä sukusoluissa , , mikä viittaa siihen, että tällaisilla potilailla voi olla suurempi riski epänormaaleihin lisääntymistuloksiin erityisesti lisääntymisikäisillä. Siksi on yleistä huolta aneuploidian syntymisen riskin vähentämisestä, sukusolujen aneugeenisuuden havaitsemisesta ja syymekanismien ymmärtämisestä. Tässä tutkimuksessa aneuploidia määritettiin sukusoluissa sperm-FISH-määrityksellä, jossa käytettiin hiiren kromosomeille 8, X ja Y spesifisiä DNA-koettimia, jotka oli merkitty eri värillä. Menetelmien luotettavuuden määrittämiseksi käytettiin positiivisena kontrolliaineena kolkisiinia, jonka tiedetään olevan pääasiassa aneugeeninen, ja positiivisen ja negatiivisen kontrollin tulokset olivat samaa luokkaa kuin aiemmissa tutkimuksissa , -. Nämä tiedot vahvistivat koeprotokollan herkkyyden testattujen yhdisteiden aneuploidogeenisten vaikutusten havaitsemisessa.

Epirubisiini on aktiivisimmillaan solusyklin S- ja G2-vaiheissa; sillä on kuitenkin jonkin verran havaittavaa aktiivisuutta kaikissa solusyklin vaiheissa . Usein on raportoitu, että kemikaalit, joilla on aneugeenisia ominaisuuksia, voivat muuttaa solunjakautumisen etenemistä sekä meioottisissa että mitoottisissa soluissa . Tässä tutkimuksessa arvioitiin BrdU-inkorporaatiomäärityksellä aikaa, joka kuluu siittiöiden meioottisista jakautumisista epididymaalisiin siittiöihin. Tulokset osoittavat selvästi, että epirubisiini pidensi hiiren spermatosyyttien meioottisten jakautumisten kestoa 48 tuntia (kuva 3). Nämä havainnot vahvistavat siis aiemmat havainnot siitä, että epirubisiinin aiheuttama topoisomeraasi II:n toiminnan estäminen solusyklin eri vaiheissa hidastaa solusyklin etenemistä ja aiheuttaa solujen pysähtymisen G2/M-vaiheeseen . Tällainen G2/M-pysähtyminen voi johtua G2-tarkistuspistekoneiston induktiosta, joka mahdollistaa vaurioituneen DNA:n korjaamisen ennen kuin solut siirtyvät seuraavaan solusyklin vaiheeseen .

In vivo -tiedot epirubisiinin vaikutuksista ei-disjunktionaalisuuteen meioosin aikana ovat rajalliset, mutta tietyt muut antrasykliinit, kuten doksorubisiini ja sen johdannainen idarubisiini, estävät kromosomien segregaatiota ja aiheuttavat merkittävää lisääntymistä disomaattisen ja diploidisen siittiöiden frekvenssissä . Lisäksi in vitro -tutkimus osoitti, että kiinalaisen hamsterin viljelmien käsittely epirubisiinilla aiheutti numeerisia poikkeavuuksia hypodiploidian ja hyperdiploidian muodossa . Lisäksi hiiren spermatogeneesin virtaussytometrinen ja histologinen analyysi osoitti, että DNA-histogrammin variaatiokerroin, joka on aneuploidian mittari, suureni ja diploidisten spermatidien määrä lisääntyi epirubisiinihoidon jälkeen . Yhtäpitävästi edellä mainittujen raporttien kanssa tämä koe osoitti, että epirubisiinialtistus aiheutti merkittävää annosriippuvaista kasvua disomisten ja diploidisten siittiöiden frekvensseissä ja että aneuploidian induktio oli lineaarisesti annosriippuvainen välillä 0-12 mg/kg epirubisiinia (kuva 4). Nämä in vivo -havainnot ovat myös linjassa aikaisemman in vitro -raportin kanssa, joka koski terveistä henkilöistä ja syöpäpotilaista viljeltyjä ihmisen lymfosyyttejä, joissa doksorubisiinialtistus aiheutti kromosomien 7 ja 17 trisomioiden lisääntymistä. Lisäksi Ganapathi ym. raportoivat, että ihmisen HL-60-leukemiasolut, joiden ainoa karyotyyppinen muutos oli monosomia 8, saivat doksorubisiinialtistuksen jälkeen 7q21-markkereita. Lisäksi sytogeneettiset löydökset osoittivat trisomiaa 8 potilailla, jotka saivat antrasykliiniä sisältävää systeemistä kemoterapiaa . Antrasykliiniä sisältävää kemoterapiaa saaneilla potilailla havaittiin monosomia 7, 7q- ja epätasapainoinen translokaatio kromosomi 7 mukaan lukien . Lisäksi kromosomien 1, 9 ja 16 rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia on yhdistetty antrasykliiniä sisältäviin kemoterapeuttisiin lääkkeisiin .

Topoisomeraasi II:n estäjien muista luokista etoposidia on tutkittu aiemmin hiiren spermatosyyteissä , . Näiden tutkimusten tulokset osoittavat, että etoposidi toimii genotoksisena aineena ja aiheuttaa aneuploidioita pääasiassa meioottisissa sukusoluissa pachytenisolujen käsittelyn jälkeen. Toisaalta Kallio ja Lähdetie havaitsivat, että hiirten herkkyys etoposidille oli suurimmillaan primaaristen spermatosyyttien diplotene-diakinesian aikana, väheni myöhäisessä pachytene-vaiheessa ja oli vähäistä preleptoteenivaiheessa; malli on hyvin erilainen kuin DNA:ta alkyloivilla kemikaaleilla. Nämä kirjoittajat ehdottivat, että etoposidi aiheutti rekombinoituneiden kromosomivarsien ratkaisun epäonnistumisen, mikä todennäköisesti liittyi solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosireitin käynnistymiseen. Yksityiskohtaisissa sytogeneettisissä tutkimuksissaan Marchetti ja muut raportoivat, että pachytene oli spermatogeneesin herkin vaihe rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien ja aneuploidian indusoimiseksi. Koska Schmidin ym. sekä Kallion ja Lähdetien tiedot pystyivät osoittamaan, että etoposidi pidensi meioottista solusykliä, vaikuttaa mahdolliselta, että Marchettin ym. 24,5 päivän paritteluryhmässä havaitsemat vaikutukset ensimmäisissä pilkkoutumisjakautumissa saattoivat itse asiassa indusoitua myöhemmässä vaiheessa, ts. meioottisen diakinesiksen, MMI:n tai MMII:n aikana eikä pachyteenin aikana, kuten kirjoittajat ehdottivat.

Tässä tutkimuksessa suunnittelimme sperma-FISH-tutkimusta selvittääksemme, olisiko subakuutilla hoidolla pienillä annoksilla topoisomeraasi II:n estäjää epirubisiinia vaikutusta, koska varhaisemmat profaasivaiheet sisältyisivät epirubisiinihoitoon. Yksittäisiä 0,25, 0,5 ja 1 mg/kg epirubisiiniannoksia ruiskutettiin 12 peräkkäisenä päivänä, ja siittiöistä otettiin näytteet 23 päivää viimeisen epirubisiinihoidon jälkeen. Epirubisiinin kokonaisannos 12 mg/kg, jota annettiin koko meioosin provaiheeseen, lisäsi merkittävästi disomisia ja diploideja siittiöitä, kun taas kokonaisannokset 3 ja 6 mg/kg doksorubisiinia olivat negatiivisia (kuva 5). Sitä vastoin yksittäinen annos 6 mg/kg epirubisiinia, joka annettiin spermasoluihin MMI/MMII:n aikana, antoi positiivisen tuloksen (kuva 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että varhaisemmat profaasivaiheet vaikuttavat suhteellisesti vähemmän epirubisiinin aiheuttamaan aneuploidiaan urospuolisten sukusolujen soluissa.

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että epirubisiini aiheutti autodiploidien siittiöiden (XX88 ja YY88) huomattavaa lisääntymistä. Epirubisiinihoidon jälkeen MMII:n pysähtymisestä johtuvat autodiploidiset siittiöt olivat yleisempiä kuin MMI:n aikana tapahtuneesta pysähtymisestä johtuvat diploidiset siittiöt (XY88). Näin ollen toinen meioottinen jakautuminen oli herkempi epirubisiinihoidolle kuin ensimmäinen meioottinen jakautuminen. Johtopäätöstä, jonka mukaan toiset meioottiset jakaumat olivat herkempiä epirubisiinihoidolle kuin ensimmäiset meioottiset jakaumat, tukevat myös havaitut disomisten sukupuolikromosomien esiintymistiheydet. XX8- tai YY8-signaalin omaavia siittiöitä oli enemmän kuin XY8-signaalin omaavia siittiöitä. Nämä havainnot vahvistavat, että disomiaa tai diploidiaa koskevalla sperma-FISH-määrityksellä pystytään havaitsemaan molempien meioottisten jakautumisten aikana aiheutuneet vaikutukset ja vertailemaan molempien meioottisten jakautumisten herkkyyttä, kuten aiemmin on raportoitu , .

Tässä sperma-FISH-määrityksessä havaittiin, että pienin positiivinen annos, joka aiheutti disomaattisen tai diploidisen siittiöiden disomiaa tai diploidiaa, oli 6 mg/kg epirubisiinia. Hiirten luuytimen MN-tutkimukset osoittivat kuitenkin, että altistuminen 3 mg/kg epirubisiinille johti MNPCE:n merkittävään lisääntymiseen. Tämä havainto viittaa siihen, että MN:t luuytimessä indusoituvat pienemmillä annoksilla kuin disomiat tai diploidiat siittiöissä. Näin ollen luuydin on herkempi kudos. Määritykset mittaavat kuitenkin eri loppupisteitä. MN-testissä mitataan kromosomien häviämistä ja rikkoutumista, ja sperma-FISH-testissä havaitaan disjunktion puuttuminen. Näin ollen nämä tiedot vahvistavat vaarojen arvioinnin yleisen paradigman, jonka mukaan luuytimen MN-testin positiivinen tulos on indikaattori yhdisteen genotoksisesta potentiaalista sukusoluissa. Aneuploidian kvantifiointi sukusoluissa on kuitenkin tärkeää riskinarvioinnin kannalta.

DNA:n topoisomeraasi-inhibiittoreilla on selvä taipumus aiheuttaa kaksisäikeisiä DNA-katkoksia, jotka johtavat ensisijaisesti sentromeerinegatiivisen MN:n muodostumiseen . Vastaavasti osoitus siitä, että epirubisiini on tehokas topoisomeraasi II:n estäjä, viittaa siihen, että epirubisiini saa klastogeeniset vaikutuksensa aikaan tämän mekanismin kautta. Epirubisiinin aineenvaihduntatuotteet voivat myös aktivoida soluja lisäämään solunsisäistä reaktiivisten happilajien tuotantoa, joista vakaat ja diffusoituvat muodot voivat vaurioittaa ydin-DNA:ta . Jos solujen korjausmekanismit ylikuormittuvat, primaarinen DNA-vaurio voi johtaa rakenteelliseen tai numeeriseen kromosomipoikkeavuuteen ja lopulta aiheuttaa kasvaimia . Tätä oletusta tukee se, että henkilöillä, joille kehittyi toinen pahanlaatuinen kasvain ensimmäisen pahanlaatuisen kasvaimen hoidon jälkeen, oli γH2AX-intensiteetillä mitattuna heikompi kyky korjata DNA:n kaksoissidekatkoksia kuin niillä, joille ei kehittynyt toista pahanlaatuista kasvainta . Epirubisiinin aiheuttama sentromeeripositiivisen MN:n induktio viittaa siihen, että epirubisiinilla saattaa olla jokin muu mekanismi, jonka kautta se saa aikaan genotoksisen vaikutuksensa. Tämä havainto korostaa, että on tärkeää käyttää MN-määrityksen FISH-muunnosta indusoituneen MN:n alkuperän määrittämiseksi. Mahdollinen mekanismi, jolla epirubisiini voi aiheuttaa aneugeenisen vaikutuksensa, on topoisomeraasi II:n estäminen, joka voi johtaa kromosomien virheelliseen jakautumiseen solun jakautumisen aikana. Tämä johtuu siitä, että DNA-topoisomeraasi II on välttämätön sisarkromatidien asianmukaiselle erottumiselle solunjakautumisen aikana, ja sen puuttuessa tapahtuu sekä hajoamattomuutta että rikkoutumista , . Näin ollen epirubisiini saattaa pystyä estämään topoisomeraasi II:n kahta keskeistä tehtävää; sen kykyä erottaa asianmukaisesti toisistaan vasta replikoituneet kromosomit sekä sen tehtävää ohimenevien kaksisäikeisten DNA-katkosten uudelleenliittämisessä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että käyttämällä FISH-testiä, jossa käytettiin erytrosyytti-MN:n sentromeeristä DNA-koettimen koetinta, osoitettiin, että epirubisiini ei ole ainoastaan klastogeeninen, vaan se on myös aneugeniittinen somaattisissa soluisssa in vivo. BrdU-inkorporaatiomäärityksellä osoitettiin, että epirubisiinin aiheuttama meioottinen viive oli noin 48 tuntia. Sperman FISH-analyysillä osoitettiin, että epirubisiini aiheuttaa meioosin aikana aneuploidioita, jotka johtavat disomaattisiin siittiöihin, sekä täydellisen meioottisen pysähtymisen, joka synnyttää diploidisia siittiöitä. Autodiploidisten (XX88, YY88) ja disomisten (XX8 tai YY8) siittiöiden yleisyys osoittaa, että toinen meioottinen jakautuminen on herkempi epirubisiinille kuin ensimmäinen meioottinen jakautuminen. Tulokset viittaavat myös siihen, että varhaisemmat profaasivaiheet vaikuttavat suhteellisesti vähemmän epirubisiinin aiheuttamaan aneuploidiaan. Sekä epirubisiinin klastogeeniset että aneugeeniset mahdollisuudet voivat aiheuttaa sekundaarikasvainten kehittymistä ja epänormaaleja lisääntymistuloksia syöpäpotilailla ja hoitohenkilökunnalla, jotka altistuvat epirubisiinia sisältäville lääkehoidoille. Vaikka epirubisiinilla on vähemmän systeemistä ja sydämen toksisuutta kuin doksorubisiinilla ja muilla antrasykliineillä, joilla on vastaava kasvainvastainen vaikutusspektri, sillä on aneuploidogeenisia ja sytotoksisia vaikutuksia muissa kuin kasvainsoluissa. Tämä lääkkeen aneuploidogeeninen vaikutus saattaa olla syynä epänormaalien lisääntymistulosten ja sekundaarikasvainten ilmaantumiseen, joita havaitaan joillakin syöpäpotilailla joskus sen jälkeen, kun heidän primaarisyöpänsä on hoidettu onnistuneesti epirubisiinia sisältävällä solunsalpaajahoidolla.