Sanglong Pingchuanin keittämisen antiastmaattiset vaikutukset tasapainoisen Th1/Th2-immuunivasteen indusoimisen kautta

Abstract

Tavoite. Tutkia Sanglong pingchuan decoctionin (SLPCD) antiastmaattisia vaikutuksia ja tutkia sen vaikutusmekanismeja. Menetelmät. Seerumi, bronkoalveolaarinen huuhteluneste (BALF) ja keuhkokudokset OVA-indusoidusta allergisesta astmasta kärsiviltä hiiriltä kerättiin 24 tuntia viimeisen annon jälkeen. Keuhkojen patologiset muutokset havaittiin H&E-värjäyksellä. BALF:n tulehdussolut laskettiin virtaussytometrialla. Kokonais-IgE:n pitoisuudet seerumissa ja sytokiinien pitoisuudet BALF:ssä määritettiin ELISA:lla. Sytokiinien mRNA:n ilmentymistasot keuhkoissa määritettiin qRT-PCR:llä. Tulokset. SLPCD esti merkittävästi hengitystieinflammaatiota, vähensi tulehdussoluja BALF:ssä, vähensi kokonais-IgE:n pitoisuuksia seerumissa ja Th2-sytokiinien (IL-10 ja IL-13) pitoisuuksia BALF:ssä sekä alensi Th2-sytokiinien (IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13) mRNA:n ilmentymistasoja astmaattisten hiirten keuhkoissa. SLPCD nosti kuitenkin huomattavasti Th1-sytokiinin IFN-γ tasoa BALF:ssä ja sääteli Th1-sytokiinien (IL-2 ja IFN-γ) mRNA-ekspressiotasoja astmaattisten hiirten keuhkoissa. Päätelmät. SLPCD voisi lievittää hengitystieinflammaatiota ja lievittää patogeneesiä astmahiirissä indusoimalla tasapainoisen Th1/Th2-vasteen, ja se voisi toimia tehokkaana lääkkeenä astman hoidossa.

1. Johdanto

Astma on monimutkainen, krooninen hengityselinsairaus, jolle on ominaista keuhkoputkien yliherkkyys, hengitystieinflammaatio ja -remodeling, ilmavirtauksen tukkeutuminen sekä erilaisten tulehdussolujen infiltraatio, jota sytokiinit ja muut välittäjäaineet indusoivat . Astman aiheuttavat ympäristötekijät, kuten allergeenit, virukset ja työperäinen altistuminen geneettisesti alttiilla henkilöillä, mutta sen lopullinen syy on epäselvä . Astman esiintyvyys on lisääntynyt merkittävästi maailmanlaajuisesti, erityisesti pienillä lapsilla, ja siitä on tullut yksi yleisimmistä hengityselinsairauksista . On arvioitu, että 300 miljoonaa ihmistä sairastaa astmaa eri maissa .

Kortikosteroidit ovat tällä hetkellä tehokkaimpia lääkkeitä astman hoidossa . Vaikka nämä lääkkeet voivat parantaa astmaoireita, ne eivät paranna tätä sairautta . Näillä aineilla on myös vakavia sivuvaikutuksia erityisesti lapsilla, kuten immuunijärjestelmän suppressio, sekundaariset infektiot, lihasten surkastuminen, osteopenia, osteoporoosi, kaihi ja glaukooma . Siksi uusien, turvallisten ja tehokkaiden lääkkeiden jatkuva etsiminen on erittäin tärkeää.

Monia perinteisiä kiinalaisia lääkkeitä on käytetty astman hoidossa vuosisatojen ajan, ja niitä käytetään edelleen laajalti Aasian maissa . Viime aikoina on raportoitu lukuisten allergisen astman hoitoon käytettyjen kasviperäisten kaavojen vaikutusmekanismeista . Erilaisia kasviperäisiä luonnontuotteita, joilla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia, on myös seulottu mahdollisia sovelluksia varten astman hoidossa .

Sanglong pingchuan decoction (SLPCD) on sairaalavalmiste, jonka on määrännyt professori Qing Chang, perinteisen kiinalaisen lääketieteen kansallinen veteraanilääkäri, perinteisen kiinalaisen lääketieteen perinnöllinen studio-mentori, Shaoxingin perinteisen kiinalaisen lääketieteen sairaalassa. SLPCD on johdettu Shegan Mahuang Tangista lisäämällä ja vähentämällä. Shegan Mahuang Tang on tunnettu perinteinen kiinalainen reseptilääke, joka mainittiin ensimmäisen kerran Jin Kui Yao Lve -kirjassa. Shegan Mahuang Tangia käytetään laajalti astman, lasten keuhkoputkentulehduksen, keuhkoastman, keuhkokuumeen, keuhkokuumeen, iäkkäiden akuutin ja kroonisen keuhkoputkentulehduksen, keuhkoputkentulehduksen, keuhkoputkentulehduksen, keuhkoputkentulehduksen, keuhkoputkentulehduksen, keuhkoputkentulehduksen ja allergisen nuhan hoidossa, koska se on edustava formulaatio. SLPCD:n kaava koostui kolmestatoista perinteisestä kiinalaisesta lääkkeestä, jotka on lueteltu taulukossa 1. Satunnaistettu tutkimus osoitti, että SLPCD on tehokas astman hoidossa, erityisesti pahenemisvaiheiden vähentämisessä. SLPCD:n tehoa ei kuitenkaan ole osoitettu kontrolloiduilla kokeilla.

Tässä tutkimuksessa luotiin kokeellinen perusta SLPCD:n kliiniselle käytölle astman hoidossa ja tutkittiin sen vaikutusmekanismeja käyttämällä OVA:n aiheuttamaa allergista astmahiirimallia, SLPCD:n anti-inflammatorisia vaikutuksia tutkittiin histologisella tutkimuksella, bronkoalveolaarisen huuhtelunesteen (BALF) immuunisolujen laskennalla, seerumin kokonais-IgE:n kvantitatiivisella määrityksellä, BALF:n sytokiinien määrityksellä ja sytokiinien mRNA-ekspressiolla keuhkokudoksissa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Tutkimusmenetelmät. Kasvimateriaalit ja reagenssit

Cortex Mori (eränumero: 140901), Pheretima Aspergillum (eränumero: 150406), hunajakäsitelty Herba Ephedrae (eränumero: 150302), Rhizoma Belamcandae (eränumero: 141213), Semen Armeniacae Amarum (eränumero: 150312), Fructus Perillae (eränumero: 150115), Scorpio (eränumero: 150126), Semen Descurainiae (eränumero: 150208), hunajalla paistettu Flos Farfarae (eränumero: 150301), Herba Houttyniae (eränumero: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (eränumero: 150308), Radix Angelicae Sinensis (eränumero: 150213) ja Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (eränumero: 140917) ostettiin Shaoxingin kiinalaisen lääketieteen sairaalasta, ja professori Yonghai Jiang Shaoxingin elintarvike- ja lääkevalvontainstituutista (Zhejiang, Kiina) todisti ne oikeiksi. Klorogeenihapon ja rutiinin standardit ostettiin Zhejiangin elintarvike- ja lääkevalvontainstituutista, Hangzhou, Kiina, ja molempien yhdisteiden puhtaudet olivat yli 98 %.

Ovalbumiini (OVA) ostettiin Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA; hiiren IL-10-, IL-13- ja IFN-γ-ilmaisevia ELISA-sarjoja ostettiin Wuhan Boster Biological Technology Co., USA. Ltd., Hubei, Kiina; hiiren IgE:n ELISA-pakkaus oli peräisin RayBiotech Inc., Norcross, GA, Yhdysvallat, vasikan sikiöseerumi (FCS) oli peräisin Gibco, Grand Island, NY, Yhdysvallat. Puhdistetut antihiiri CD16/CD32 (Fc-reseptoriblokki), Ly-6G-FITC (klooni: RB6-8C5), F4/80-antigeeni PE-Cy5 (klooni: BM8), Ly-6C-APC (klooni HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alpha (FceR1)-APC (klooni: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, klooni: 2B8) ja siglec-F-PE (klooni: E50-2440) -vasta-aineet ostettiin yrityksestä eBioscience, Inc, San Diego, CA, Yhdysvallat. Trizol-reagenssi ostettiin Invitrogenilta, Carlsbad, CA, USA; revert Aid™ M-MLV käänteistranskriptaasi Fermentasilta, Amherst, NY, USA; ribonukleaasi-inhibiittori ja oligo(dT)18 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Kiina; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) Roche Diagnosticsilta, Indianapolis, IN, USA. Alumiinihydroksidigeeli (Alum) ostettiin China Animal Husbandry Industry Co., Ltd.:ltä, Peking, Kiina; deksametasoni (Dex) oli peräisin Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd.:ltä, Xiangyang, Kiina.

2.2.1. TUTKIMUKSEN TULOKSET JA TUTKIMUKSEN TULOKSET SLPCD:n valmistaminen

Reseptilääkkeitä SLPCD:tä (440 g) maseroitiin 8 alikvootissa tislattua vettä 30 minuutin ajan ja sitten keitettiin vettä 1 h. Ensimmäisen keittämisen jälkeen sakkaa keitettiin 6 alikvootissa tislattua vettä vielä 30 minuutin ajan. Kaksinkertaisesta keittämisestä saatu supernatantti suodatettiin steriilin sideharson läpi ja väkevöitiin rotavaporilla (Buchi, Sveitsi) alennetussa paineessa 65 °C:ssa loppupitoisuuteen 1,1 g raakalääkettä/ml. Väkevää keittosuolaa säilytettiin -20 °C:ssa ja laimennettiin myöhemmin tislatulla vedellä useisiin eri pitoisuuksiin ennen käyttöä.

2.3. SLPCD:n korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -analyysi

HPLC-analyysi suoritettiin käyttäen Diamon C18 -kolonnia (250 mm × 5 mm, 5 μm) ja Waters 2996 PDA -detektoria Water 600E HPLC-laitteessa. Liikkuva faasi oli asetonitriilin (A) ja 0,1 % fosforihapon (B) seos. Lineaarinen gradienttieluutio suoritettiin seuraavasti: 0-8 min 2 %:n A:ssa, 8-35 min 6 %:n A:ssa, 35-40 min 8 %:n A:ssa, 40-45 min 13 %:n A:ssa, 45-70 min 14 %:n A:ssa, 70-80 min 17 %:n A:ssa ja 80-90 min 17-2 %:n A:ssa. Virtausnopeus oli 1 ml/min ja injektiotilavuus 10 μl. Kolonnin lämpötila pidettiin jatkuvasti 30 °C:ssa. Standardien (klorogeenihappo ja rutiini) ja näytteiden HPLC-analyysit suoritettiin edellä mainituissa vakiintuneissa koeolosuhteissa.

2.4. Koe-eläimet

5 viikon ikäiset naaraspuoliset BALB/c-hiiret ostettiin Shanghain tiedeakatemian Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences -laitokselta, Shanghai, Kiina (sertifikaatti nro SCXK 2007-0005). Hiiret akklimatisoitiin 1 viikon ajan ennen käyttöä. Jyrsijöiden laboratorioruokaa ja vesijohtovettä annettiin vapaasti, ja niitä pidettiin valvotuissa olosuhteissa, joissa lämpötila oli 24 ± 1 °C, kosteus 50 ± 10 % ja valo-/pimeäjakso 12/12 tuntia. Kaikki menettelyt olivat tiukasti laboratorioeläinten käyttöä ja hoitoa koskevan Kiinan kansantasavallan lainsäädännön ja Zhejiangin yliopiston koe-eläinten tutkimuslaitoksen laatimien ohjeiden mukaisia, ja yliopiston eläinkokeiden komitea hyväksyi ne.

2.5. Hiirten herkistäminen, haastaminen ja hoito

Naaraspuoliset BALB/c-hiiret jaettiin kuuteen ryhmään: normaaliin kontrolliryhmään (NC), mallikontrolliryhmään (MC), positiiviseen kontrolliryhmään (käsitelty Dexillä, 2 mg/kg) ja SLPCD-ryhmiin (5,5, 11 ja 22 g/kg). Kussakin ryhmässä oli kymmenen hiirtä. Hiirten hengitystietulehdus indusoitiin OVA:lla. Eläimet immunisoitiin vatsansisäisellä injektiolla liuoksella, joka sisälsi 50 μg OVA:ta ja 200 μg alumiinihydroksidia kolmen päivän ajan. Tehostava herkistäminen annettiin 14. päivänä. Viikko viimeisen herkistyksen jälkeen hiiret altistettiin aerosolisoidulle 2-prosenttiselle OVA:lle PARI TurboBOY N (1205) -sumuttimella (PARI GmbH, Saksa) 1 tunnin ajan päivässä 8 päivän ajan. Neljä päivää ennen altistusta herkistyneille hiirille annettiin suun kautta SLPCD:tä annoksina 5,5, 11 ja 22 g/kg tai ruiskutettiin vatsansisäisesti 2 mg/kg deksametasonia (Dex) joka päivä 12 päivän ajan. Mallin kontrolliryhmät saivat saman määrän suolaliuosta. Annosmäärä oli 0,2 ml/10 g ruumiinpainoa. Kymmenen hiirtä, jotka toimivat normaalina kontrolliryhmänä, oli ainoastaan herkistetty ja haastettu suolaliuoksella. OVA-herkistämiseen ja -haastamiseen sekä SLPCD-hoitoon käytetyt menetelmät on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1

Kokeellinen protokolla OVA:n aiheuttaman astman mallia ja hoitoprosesseja varten.

2.6. OVA-herkistäminen. Keuhkojen histopatologia

Keuhkokudokset kerättiin 24 h viimeisen annostelun jälkeen, minkä jälkeen ne kiinnitettiin 4 %:n paraformaldehydillä, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 μm:n paksuudelta. Sarja mikroleikkauksia värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E) histologista arviointia varten.

2.7. Bronkoalveolaarisen huuhtelunesteen (BALF) kerääminen ja virtaussytometria

BALF kerättiin huuhtelemalla keuhkot fosfaattipuskuroidulla liuoksella (PBS), joka annosteltiin endotrakeaalisen katetrin kautta 24 tuntia viimeisen annoksen jälkeen. BALF sentrifugoitiin 5 minuutin ajan ja solut pestiin jääkylmällä PBS:llä, joka sisälsi 2 % FCS:ää. Soluja blokattiin 0,5 μg:lla puhdistettua antihiiren CD16/CD32-vasta-ainetta (FcR-blokki) 10 minuutin ajan jäällä epäspesifisen värjäytymisen estämiseksi, minkä jälkeen solut värjättiin antihiiren Ly-6G-FITC-, F4/80-antigeeni-PE-Cy5- ja Ly-6C-APC-vasta-aineiden tai FceR1-APC-, CD117-FITC- ja Siglec-F-PE-vasta-ainekombinaatiolla huoneenlämpöisessä tilassa pimeässä 30 minuutin ajan. Värjätyt solut pestiin jääkylmällä PBS:llä ja suspendoitiin uudelleen PBS:ään. Sata tuhatta elinkelpoista solua käsittelyä kohti analysoitiin BD FACScan -virtaussytometrillä käyttäen CellQuest-ohjelmistoa.

2.8. Kokonais-IgE-vasta-aineen mittaaminen seerumista

Seerumi kerättiin 24 tuntia viimeisen annon jälkeen. IgE:n kokonaisvasta-aine määritettiin yksittäisistä seeruminäytteistä RayBio® mouse IgE ELISA kitillä. Seeruminäytteet laimennettuna 1:1250 tai IgE-standardi lisättiin 96-kuoppalevyihin, jotka oli päällystetty spesifisellä hiiren IgE-vasta-aineella. Levyjä inkuboitiin 2,5 tuntia huoneenlämmössä ja pestiin sen jälkeen neljä kertaa. Detektoiva vasta-aine lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin huoneenlämmössä 1 tunnin ajan ennen piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun ABC:n lisäämistä. 45 minuutin inkuboinnin jälkeen levyt pestiin ja kehitettiin TMB:llä 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 20 μl stop-liuosta. Absorbanssi mitattiin ELISA-lukulaitteella (BIO-RAD 680) 450 nm:ssä.

2.9. Sytokiinien mittaaminen BALF:stä

Th2- (IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13) ja Th1-sytokiinien (IFN-γ ja IL-2) pitoisuudet BALF:stä määritettiin kaupallisilla ELISA-pakkauksilla, kuten aiemmin on tehty .

2.10. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR)

Th2- (IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13) ja Th1-sytokiinien (IFN-γ ja IL-2) mRNA-ekspressiotasot keuhkokudoksissa määritettiin qRT-PCR:n avulla. Kokonais-RNA eristettiin homogenisoiduista keuhkokudoksista Trizol-reagenssilla valmistajan protokollan mukaisesti, ja käänteinen transkriptio suoritettiin kuten aiemmin . Tämän jälkeen monistaminen suoritettiin 20 μl:n reaktiossa käyttäen FastStart Universal SYBR Green Masteria. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI 7400 Real-Time PCR -järjestelmällä. Alukkeet qRT-PCR:ää varten syntetisoi Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (Shanghai). (Kiina), ja sekvenssit oli lueteltu taulukossa 2. qPCR-sykli suoritettiin seuraavasti: alku denaturointi 95 °C:ssa 10 minuutin ajan, jota seurasi 40 sykliä denaturointia 95 °C:ssa 10 s, hehkutus 60 °C:ssa 1 minuutin ajan. GAPDH:ta käytettiin endogeenisena kontrollina. Alukkeiden monistustehokkuus ja spesifisyys tarkistettiin kunkin alukesarjan osalta. Testattujen geenien ilmentymistasot suhteessa GAPDH:hon määritettiin menetelmällä ja kerrottuna induktiona .

geeni Primerisekvenssi Tuotteen koko (bp) GAPDH 5′-AGCCTCGTCCCGTAGACAA-3′ 104 5′-AATCTCCACTTTGCCACTGC-3′ IL-2 5′-CCCAAGCAGCAGGCCACACAGAATTGAAA-3′ 81 5′-AGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3′ IFN-γ 5′- TCTTGAAAGACAATCAGGCCATCA -3′ 233 5′- GAATCAGCAGCGACTCCTTTTCC -3′ IL-4 5′-CAAACGTCCTCACAGCAACAACG-3′ 203 5′-CTTGGACTCATTCATGGTGC-3′ IL-5 5′- GCTGGCCTCAAACTGGTAATGTA- -3′ 100 5′- GGCAATGGTGCATGTCTGTAACCTC -3′ IL-10 5′- GCTCTTACTGACTGGCATGAG -3′ 105 5′- CGCAGCTCTAGGAGCATGTG -3′ IL-13 5′- GCTTGCCTTGGTGGTCTCGCCGCC – -3′ 175 5′- GGGCTACACAGAACCCGCCA – – 2.11. Tilastollinen analyysi Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD), ja niiden erojen tilastollista merkitsevyyttä tutkittiin ANOVA:lla ja Tukeyn post hoc -testillä. -arvoja, jotka olivat alle 0,05, pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. 3. Tulokset 3.1. Tulokset . SLPCD:n HPLC-profiili Klorogeenihapon ja rutiinin pitoisuudet SLPCD:ssä analysoitiin HPLC:llä. Klorogeenihappo ja rutiini tunnistettiin ja määritettiin standardivertailuyhdisteisiin verrattuna (kuva 2). Standardien kalibrointikäyrän regressioyhtälöt olivat A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) ja A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) klorogeenihapon ja rutiinin osalta. Klorogeenihapon pitoisuus SLPCD:ssä oli 1,4 mg/g ja rutiinin pitoisuus 0,15 mg/g. (a) (b) (a) (b) Kuva 2 SLPCD:n HPLC-kromatogrammit. Kuvassa on esitetty edustavat kromatogrammit standardivertailuyhdisteistä (a) ja SLPCD:stä (b). ① Klorogeenihappo ja ② rutiini. 3.2. SLPCD vaimensi hengitystieinflammaatiota astmaattisilla hiirillä SLPCD:n vaikutusta keuhkotulehdukseen OVA:n aiheuttamissa astmaattisissa hiirissä havainnoitiin H&E-värjäyksellä, ja tulokset oli esitetty kuvassa 3. Astmamallihiirillä esiintyi keuhkoissa vakavampaa interstitiaalista, peribronkiolaarista ja perivaskulaarista tulehdussolujen infiltraatiota verrattuna normaaleihin kontrollihiiriin. Positiivisena kontrollina Dex lievitti merkittävästi keuhkojen interstitiaalisten, peribronkiolaaristen ja perivaskulaaristen tulehdussolujen infiltraatiota astmahiirissä. SLPCD lievitti myös merkittävästi tulehduksellisia infiltraatteja OVA-altistettujen hiirten keuhkoissa verrattuna mallikontrolliin. (a) (b) (c) (d) (e) (f) (a) (b) (c) (d) (e) (f) Kuva 3 SLPCD-hoidon vaikutukset keuhkojen histopatologisiin muutoksiin. Keuhkojen leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Esitetyt valomikroskooppikuvat edustavat kymmenen hiiren keuhkoleikkauksia kustakin ryhmästä. (a) Normaali kontrolli (NC); (b) mallikontrolli (MC); (c) deksametasoni (Dex, positiivinen kontrolli); (d) SLPCD (5,5 g/kg); (e) SLPCD (11 g/kg) ja (f) SLPCD (11 g/kg). 3.3. SLPCD vähensi tulehdussoluja astmaattisten hiirten BALF:ssä Selvittääksemme SLPCD:n vaikutukset tulehdussolujen infiltraatioon OVA:n aiheuttamien astmaattisten hiirten keuhkoissa, BALF:n tulehdussolujen, mukaan lukien eosinofiilit (Sigilec F+), basofiilit (CD117+), neutrofiilit (Ly-6C+y-6), makrofagit (F4/), monosyytit (Ly6G-Ly6C+) ja syöttösolut (FcER1+), määrä laskettiin virtaussytometrialla. Kuten kuvasta 4 käy ilmi, eosinofiilien (1756-kertainen), makrofagien (114-kertainen), neutrofiilien (110-kertainen), basofiilien (91,7-kertainen), monosyyttien (45,8-kertainen) ja syöttösolujen (6,9-kertainen) määrä astmaattisten hiirten BALF:ssä oli selvästi kohonnut verrattuna normaaleihin kontrollihiiriin. Dex vähensi merkittävästi astmaattisten hiirten BALF:ssä testattujen erilaisten tulehdussolujen lukumäärää (), lähes lähelle normaalien hiirten tasoja. Näiden tulehdussolujen lukumäärät astmaattisten hiirten BALF:ssä vähenivät merkittävästi annosriippuvaisesti SLPCD:n vaikutuksesta verrattuna mallikontrolliryhmään (, , tai ). Kuva 4 SLPCD:n vaikutus tulehdussolujen rekrytoitumiseen BALF:ssä OVA:lla aikaansaadussa astmahiirissä. BALF kerättiin 24 h viimeisen annostelun jälkeen ja solukoostumus analysoitiin tekstissä kuvatulla FACS-menetelmällä. Arvot esitetään keskiarvoina ± SD (). Merkittävät erot verrattuna astmamallin kontrolliryhmään (MC) on merkitty merkinnöillä , , ja . Dex: deksametasoni (positiivinen kontrolli), NC: normaali kontrolliryhmä. 3.4. SLPCD vähensi astmaattisten hiirten seerumin kokonais-IgE-tasoja Kuvassa 5 on esitetty SLPCD:n vaikutukset astmaattisten hiirten seerumin kokonais-IgE-tasoihin. Astmaattisten hiirten seerumin kokonais-IgE-vasta-ainepitoisuudet olivat merkittävästi korkeammat kuin normaalien kontrollihiirten (). Positiivisena lääkkeenä Dex vähensi merkittävästi seerumin kokonais-IgE-vasta-ainepitoisuuksia OVA:n aiheuttamissa astmaattisissa hiirissä (). Seerumin kokonais-IgE-vasta-ainepitoisuudet astmaattisilla hiirillä pienenivät merkitsevästi annosriippuvaisesti SLPCD:n vaikutuksesta verrattuna mallikontrolliryhmään (). Kuva 5 SLPCD:n vaikutukset kokonais-IgE:n pitoisuuksiin OVA:n aiheuttaman astman aiheuttaman astman aiheuttamien hiirten seerumissa. Seerumi kerättiin 24 tuntia viimeisen annostelun jälkeen ja kokonais-IgE-pitoisuudet mitattiin tekstissä kuvatuilla ELISA-pakkauksilla. Arvot esitetään keskiarvoina ± SD (). Merkittävät erot verrattuna astmamallin kontrolliryhmään (MC) on merkitty . Dex: deksametasoni (positiivinen kontrolli) ja NC: normaali kontrolliryhmä. 3.5. SLPCD moduloi sytokiinien tasoja astmaattisten hiirten BALF:ssä Th2- (IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13) ja Th1-sytokiinien (IFN-γ ja IL-2) tasot BALF:ssä mitattiin ELISA:lla. Kuten kuvasta 6 näkyy, OVA-haaste johti IL-10:n ja IL-13:n tason merkittävään nousuun ja IFN-γ:n tason laskuun astmaattisten hiirten BALF:ssä verrattuna normaaliin kontrolliryhmään ( tai ). IL-4:n, IL-5:n ja IL-2:n pitoisuudet mallin kontrollihiirten BALF:ssä olivat kuitenkin hyvin alhaiset ja lähellä havaitsemisrajaa. SLPCD:n antaminen kolmella annoksella ja Dex vähensi merkittävästi IL-13:n ja IL-10:n pitoisuuksia sekä nosti huomattavasti IFN-γ:n pitoisuutta OVA:n aiheuttamien astmaattisten hiirten BALF:ssä verrattuna mallikontrollihiiriin ( tai ) (kuva 6). Kuva 6 SLPCD:n vaikutus sytokiinien pitoisuuksiin OVA:n aiheuttamien astmahiirien BALF:ssä. BALF kerättiin 24 h viimeisen annon jälkeen. Th1- (IL-10 ja IL-13) ja Th1-sytokiinien (IFN-γ) tasot BALF:stä mitattiin tekstissä kuvatuilla ELISA-sarjoilla. Arvot esitetään keskiarvoina ± SD (). Merkitsevät erot verrattuna astmaattisen mallin kontrolliryhmään (MC) on merkitty ja . Dex: deksametasoni (positiivinen kontrolli) ja NC: normaali kontrolliryhmä. 3.6. SLPCD sääteli sytokiinien mRNA-ekspressiotasoja astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa SLPCD:n vaikutukset Th1- ja Th2-tyypin sytokiinien mRNA-ekspressioon OVA:n aiheuttamien astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa havaittiin qRT-PCR:n avulla, ja tulokset on esitetty taulukossa 3. Normaaleihin kontrollihiiriin verrattuna Th2-sytokiinien mRNA:iden (IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13) ilmentymistasot olivat selvästi koholla ja Th1-sytokiinien mRNA:iden (IL-2 ja IFN-γ) ilmentymistasot olivat merkittävästi alentuneet astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa (P < 0,001). SLPCD:n antaminen kolmella annoksella ja Dexin antaminen johti Th2-sytokiinien IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13 mRNA-ekspressiotasojen merkittävään alenemiseen ja Th1-sytokiinien IL-2 ja IFN-γ mRNA-ekspressiotasojen nousuun astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa verrattuna astmaattisten mallien ryhmiin (P < 0,05, P < 0,01 tai P < 0,001). Ryhmä annos IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 IL-2 IFN-γ NC – 1.00±0.14 1.00±0.23 1.00±0.19 1.00±0.31 1.00±0.19 1.00±0.13 MC – 38.91±2.96 5.22±0.64 7.49±0.23 142.3±14.6 0.73±0.13 0.59±0.15 CTX (mg/kg) 50 19.08±2.62 2.56±0.42 5.07±0.67 44.00±7.74 1.20±0.20 2.14±0.34 SLPCD (g/kg) 5.5 21.70±4.64 4.06±0.38 6.68±0.68 71.26±10.62 1.28±0.20 1.12±0.20 11 21.30±3.71 3.74±0.37 6.21±0.44 65.4±11.99 1.33±0.26 1.53±0.21 22 23.09±3.27 3.07±0.34 6.03±0.65 61.51±8.77 1.49±0.34 1.71±0.23 Keuhkokudokset kerättiin 24 h viimeisen annostelun jälkeen, ja GAPDH:n ja sytokiinien mRNA:n ilmentymistasot havaittiin qRT-PCR:llä käyttäen spesifisiä alukkeita. Endogeenisena kontrollina käytettiin housekeeping-geeni GAPDH:ta. Arvot esitetään keskiarvoina ± SD (). Merkitsevät erot verrattuna astmaattisen mallin kontrolliryhmään (MC) on merkitty merkinnöillä , , ja . Dex: deksametasoni (positiivinen kontrolli) ja NC: normaali kontrolliryhmä. Taulukko 3 SLPCD:n vaikutus sytokiinien mRNA-ekspressiotasoihin OVA:n aiheuttamien astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa. 4. Pohdinta Astmasta on tullut kansanterveydellinen ongelma maailmanlaajuisesti, erityisesti kehittyneissä maissa . Glukokortikoidit ovat ensisijainen hoito astman hoidossa ja hallinnassa. Vaikka nämä lääkkeet pystyivät parantamaan astmaoireita, niiden jatkuvaa käyttöä valvottiin tiukasti niiden vakavien sivuvaikutusten vuoksi . Näin ollen tarvitaan uusia astman hoitokeinoja. Monilla perinteisillä kiinalaisilla lääkkeillä on erilaisia biologisia vaikutuksia, kuten antibakteerisia, sienilääkkeitä, tulehduskipulääkkeitä, antianafylaksia- ja immunomodulatorisia vaikutuksia, joilla on potentiaalia astman hoidossa. Kokeellisissa hiirissä on kuvattu erilaisia allergisen keuhkoputkitulehduksen malleja. OVA:n aiheuttama allergisen astman hiirimalli jäljittelee monia ihmisen astman piirteitä, ja se on saanut laajan hyväksynnän. Siksi tutkimme SLPCD:n antiastmaattisia vaikutuksia ja tutkimme sen molekyylimekanismeja käyttäen tätä mallia. SLPCD koostuu 13 perinteisestä kiinalaisesta lääkkeestä. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum ja Herba Ephedrae ovat ensisijainen komponentti, joka hajottaa keuhkoja ja lievittää astmaa. Semen Armeniacae Amarum, sekoitettuna paistettu Fructus Perillae, Semen Descurainiae ja hunajalla paistettu Flos Farfarae ovat apukomponentteja, jotka vähentävät limaa, lievittävät yskää ja astmaa. Apukomponentteihin kuuluvat Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae ja Rhizoma Fagopyri Dibotrydis, jotka tyhjentävät lämpöpahat ja karkottavat pintapahat, sekä Scorpio ja Radix Angelicae Sinensis, jotka hajottavat veren pysähtyneisyyden, ruoppaavat sivuoireita, spasmolyyttävät ja pysäyttävät astman. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmonisoi kaikki lääkkeet. Yhdessä kaikki komponentit täydentävät toisiaan saavuttaakseen keuhkojen hajottamisen, Qi:n laskeutumisen ja yskän ja astman lievittämisen tulokset. Tässä tutkimuksessa käytetyn SLPCD:n laadunvalvonta suoritettiin HPLC:llä, ja kaksi referenssikemikaalia (klorogeenihappo ja rutiini) tunnistettiin tärkeimmiksi indeksikomponenteiksi (kuva 2). Allerginen astma määritellään hengitysteiden akuutiksi krooniseksi tulehdukselliseksi sairaudeksi, jolle on ominaista eosinofiilinen rekrytoituminen, goblettisolujen hyperplasia, liman hypersekretio, kollageenin laskeutuminen, sileän lihaksen solujen hypertrofia ja subepiteelifibroosi . Tässä tutkimuksessa SLPCD-hoidon vaikutuksia keuhkotulehdukseen OVA-altistetuilla astmaattisilla hiirillä arvioitiin H&E-värjäyksellä. Astmaattisten mallihiirten keuhkokudoksissa havaittiin tyypillistä allergista kertymistä ja tulehdussolujen infiltraatiota. SLPCD-hoito vähensi tulehduksellisia infiltraatteja astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa (kuva 3), mikä viittaa siihen, että SLPCD lievitti merkittävästi hengitystieinflammaatiota. Tulehduksellisilla immuunisoluilla on keskeinen rooli astman patogeneesissä ja vakavuudessa. Alueellisista imusolmukkeista hengitysteihin rekrytoidut tulehdussolut voivat erittää sytokiineja ja kemokiineja, mikä johtaa hengitysteiden hyperreaktiivisuuteen . Tulehdussolujen vähentäminen hengitysteissä on tehokas tapa hoitaa astmaa . Vahvistaaksemme, että SLPCD voi estää tulehdussolujen infiltraatiota, laskimme lisäksi eosinofiilit, makrofagit, neutrofiilit, basofiilit, monosyytit ja syöttösolut BALF:stä. OVA-inhalaatio johti näiden kuuden tulehdussolulajin lukumäärän merkittävään lisääntymiseen BALF:ssä (kuva 4). Eosinofiilien, makrofagien, neutrofiilien, basofiilien, monosyyttien ja syöttösolujen lisääntymiskertoimet olivat 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 ja 6,9 kertaa, mikä osoittaa, että pahentuneen astman malli on luotu tyydyttävästi tässä tutkimuksessa. Hoito SLPCD:llä vähensi merkittävästi ja annosriippuvaisesti näiden tulehdussolujen, erityisesti eosinofiilien, määrää BALF:ssä astmaattisiin hiiriin verrattuna (kuva 4). Nämä tulokset viittasivat siihen, että SLPCD vähensi tulehdussolujen infiltraatiota keuhkoihin OVA:n aiheuttamissa astmaattisissa hiirissä, mikä oli yhdenmukaista histopatologisen havainnon tulosten kanssa. On hyvin tiedossa, että IgE-vasta-ainepitoisuuksien kohoaminen korreloi hengitysteiden allergiseen tulehdukseen ja keuhkoputkien hyperreaktiivisuuteen astmamallihiirissä . Coyle ym. raportoivat, että IgE-vasta-aineet heikensivät eosinofiilistä hengitysteiden tulehdusta ja keuhkoputkien hyperreaktiivisuutta astmahiirillä. Allergeenin aiheuttama IgE laukaisi eosinofiilit, basofiilit ja syöttösolut erittämään sytokiineja IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13 . Siksi arvioimme seerumin kokonais-IgE-pitoisuuksia ja havaitsimme, että SLPCD pystyi merkittävästi alentamaan seerumin kokonais-IgE-pitoisuuksia OVA-altistetuilla astmaattisilla hiirillä (kuva 5). Th1/Th2-solujen epätasapainoa pidetään astman immunologisena syynä . Astmassa Th1-solujen aktiivisuus vähenee, kun taas Th2-solujen aktiivisuus aktivoituu, mikä johtaa Th2-tyyppisten sytokiinien lisääntymiseen ja Th1-sytokiinien vähenemiseen . Keuhkoihin siirtyneet Th2-solut erittävät prototyyppisiä Th2-tyypin sytokiineja IL-4:ää, IL-5:tä ja IL-13:a, mikä johtaa piippusolujen hyperplasiaan, bronkokonstriktioon ja eosinofiliaan hengitysteissä . In vitro IL-13 voi välittää IgE:n tuotantoa, ja sillä voi olla keskeinen rooli IgE-välitteisten allergisten sairauksien patogeneesissä . IL-13 voi myös lisätä eosinofiilien selviytymistä ja vaikuttaa näiden solujen patologiseen toimintaan astmassa . IL-13:a yliekspressoivat hiiret toistavat useita astman piirteitä, mukaan lukien keuhkojen eosinofilia, epiteelin hyperplasia, hengitysteiden tukkeutuminen ja hyperreaktio kolinergisiin. Th2-sytokiinien tuotannon tukahduttaminen osoittautuisi hyödylliseksi allergeenien immunoterapiassa . Toisaalta Th1-aktivoituneet solut voivat estää astmaattisten hengitysteiden tulehdusta . Th1-sytokiinit, kuten IFN-γ, estävät allergeenin aiheuttamaa eosinofiilien rekrytoitumista ja IgE:n vapautumista alentamalla GATA-3:n, IL-4:n ja IL-5:n ilmentymistä astmamallin keuhkokudoksissa . Tässä tutkimuksessa arvioimme SLPCD:n vaikutusta sytokiinien tasoihin astmaattisten hiirten BALF:ssä. Tulokset osoittivat, että SLPCD ei ainoastaan pienentänyt annosriippuvaisesti IL-13- ja IL-10-tasoja vaan myös nosti IFN-γ-tasoa astmaattisten hiirten BALF:ssä (kuva 6). SLPCD-hoidon estävä vaikutus Th2-sytokiinien tuotantoon oli yhdenmukainen sen vaikutuksen kanssa seerumin kokonais-IgE-tasoihin. On raportoitu, että IL-5:llä on tärkeä rooli eosinofiilien proliferaatiossa, erilaistumisessa, kypsymisessä ja migraatiossa kudospaikkoihin . IL-5:n mRNA:n ilmentymistasot astmaatikkojen keuhkoputkien koepaloissa olivat koholla verrattuna ei-astmaattisiin kontrolleihin . IL-5:n mRNA-ekspressiotasot korreloivat astman kliinisen vaikeusasteen kanssa . Kertyvä allergeeniprovokaatio lisäsi IL-4:n mRNA-ekspressiota BALF-soluissa ja perifeerisissä CD4+ ja CD8+ T-soluissa . Myös IL-10:n on osoitettu osallistuvan astmaan . IL-13-transkriptien regulaatio lievää astmaa sairastavien potilaiden BAL-soluissa matala-annoksisen allergeeniprovokaation jälkeen on sopusoinnussa sen korkeamman IL-13 mRNA:n ilmentymistason kanssa keuhkoputkien limakalvoilla . SLPCD-hoidon vaikutukset sytokiinien mRNA-ekspressiotasoon astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa määritettiin edelleen qRT-PCR:n avulla. SLPCD-hoito alensi merkittävästi Th2-sytokiinien (IL-4, IL-5, IL-10 ja IL-13) mRNA-ekspressiotasoja ja nosti Th1-sytokiinien (IL-2 ja IFN-γ) mRNA-ekspressiotasoja astmaattisten hiirten keuhkoissa. Nämä tulokset vahvistivat edelleen SLPCD-hoidon säätelyvaikutukset Th1- ja Th2-sytokiinivasteisiin astmaattisten hiirten keuhkokudoksissa. Johtopäätöksenä voidaan todeta, että SLPCD saattoi merkittävästi estää hengitystieinflammaatiota, vähentää tulehdussoluja BALF:ssä, alentaa seerumin IgE:n kokonaispitoisuutta ja muokata sytokiinien pitoisuuksia BALF:ssä ja mRNA-ekspressiota aivosolujen mRNA:n ilmentymisessä astmaattisten hiirten keuhkoissa. Nämä tulokset viittasivat siihen, että SLPCD voisi lievittää hengitystieinflammaatiota ja lievittää patogeneesiä hiiren astmamallissa indusoimalla tasapainoisen Th1/Th2-vasteen ja validoida sen kliinisen käytön tehokkaana lääkkeenä astman hoidossa. Paljastaminen Binnian Zhun nykyinen osoite on ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd., Hangzhou 310030, Kiina. Interintäristiriidat Tekijät ilmoittavat, että eturistiriitoja ei ole. Tekijöiden panos Binnian Zhu ja Jun Dong osallistuivat yhtä paljon tähän tutkimustyöhön. Kiitokset Tätä työtä on tuettu Shaoxingin tiede- ja teknologiaprojektin apurahalla (nro 2014B700722).