Uutta tietoa apoptosomin rakenteesta ja toiminnasta

Varhainen rakennetieto oli ratkaisevaa apoptosomin domain-organisaation paljastamisessa. Ihmisen apoptosomi sisältää seitsemän Apaf-1-molekyyliä, jotka on symmetrisesti järjestetty pyöränmuotoiseen rakenteeseen muodostaen NOD:ista koostuvan keskushubin, jossa on seitsemän pidennettyä HD2-vartta, joista kukin päättyy V:n muotoiseen alueeseen, joka muodostuu kahdesta β-kuljettimesta . NBD:n ja HD1:n α/β-kertaiset osat sitovat ADP/dATP:tä välillään, kun taas WD40-toistot muodostavat 7- ja 8-lapaiset β-propellerit . Aikaisempien ehdotusten vastaisesti havaittiin, että vierekkäisten Apaf-1-molekyylien α/β-kertauksen välisiä lateraalisia vuorovaikutuksia käytetään järjestämään keskuskeskusta, kun taas N-terminaaliset CARDit istuvat tämän renkaan yläpuolella ja ovat järjestäytymättömiä ilman pc-9:ää (PDB 3J2T) . Viimeaikaiset lähiatomirakenteet ovat kuitenkin osoittaneet, että Apaf-1:n CARDit muodostavat levyn kaltaisen piirteen aktiivisen apoptosomin pinnalle pc-9:n CARDien läsnä ollessa, ja tämä järjestely eroaa CED-4:ssä ja Darkissa havaitusta (kuvat 1 ja 2) . Keskuskeskipisteen vakautta ylläpitää viereisten Apaf-1-molekyylien viereisten NBD- ja HD1-moduulien välisten α-helikaalisten vuorovaikutusten, vetysidosten ja suolasiltojen monimutkainen verkosto . Vierekkäisten protomeerien WHD/HD1-kontaktit näyttävät tukevan apoptosomin kokoonpanoa, kun WHD-domeenit silloittavat vierekkäisiä NBD- ja HD1-domeeneja . Kuten pimeässä, Apaf-1:n ISM-kierre (α12) on yhdistetty kierteeseen α13 laajojen hydrofobisten vuorovaikutusten kautta muodostaen kierteis-silmukka-kierre -motiivin kussakin alayksikössä, jotka vuorostaan vuorovaikuttavat sivusuunnassa vierekkäisten alayksiköiden kanssa muodostaen kierteisen aita-aidan, joka reunustaa rengasrenkaan keskushuokosta .

Terveissä soluissa Apaf-1-monomeerit ovat suljetussa, inaktiivisessa konformaatiossa, jossa ADP on upotettu rakoon NBD-HD1:n rajapinnassa (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Tämä suljettu konformaatio ennakoi vaatimusta monomeerin laajoista konformaatiomuutoksista apoptosomin kokoamisen helpottamiseksi. Toisin kuin apoptosomin muodostumisessa C. elegansissa ja Drosophilassa, mitokondrioista apoptoosin signaloinnin aikana vapautuva sytokromi c sitoutuu monomeeriseen Apaf-1:een, mikä käynnistää konformaatiomuutokset, jotka johtavat nukleotidivaihtoon (ATP tai dATP voi korvata ADP:n), ja sitä seuraavaan pidennetyn Apaf-1:n oligomerisaatioon apoptosomin muodostamiseksi (kuva 3) . Tapahtuvien konformaatiomuutosten ymmärtämiseksi tarvitaan tarkkoja malleja Apaf-1:n inaktiivisista ja laajennetuista tiloista. On määritetty kaksi kiderakennetta inaktiivisista Apaf-1-monomeereista, joissa on sidottua ADP:tä, joista toisesta puuttuvat β-propellerit ja toisesta N-terminaaliset CARD-domeenit kiteytymisen helpottamiseksi. NOD on kuitenkin näissä kahdessa kidemuodossa käytännöllisesti katsoen identtinen, ja tämä on mahdollistanut konsensusmallin rakentamisen koko Apaf-1-monomeerille, johon on sitoutunut ADP . Useat ryhmät ovat nyt saavuttaneet ihmisen apoptosomista lähes atomirakenteet käyttämällä yhden hiukkasen kryo-EM:ää, mikä antaa tietoa Apaf-1:n laajennetusta konformaatiosta pc-9:n puuttuessa ja läsnä ollessa (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; kuva 3) . Kuten ennustettiin , Apaf-1:n konformaatio keskeisessä solmukohdassa, HD2-varsissa ja säätelyalueella on olennaisesti identtinen sekä inaktiivisissa että aktiivisissa apoptosomeissa . Nämä tutkimukset ovat antaneet tärkeitä yksityiskohtia erityisistä residuaaleista, jotka osallistuvat alueiden välisiin van der Waalsin kontakteihin yksittäisten Apaf-1-molekyylien sisällä, paljastaneet aktiivista apoptosomia stabiloivien domeenivuorovaikutusten kannalta kriittisiä residuaaleja ja osoittaneet vuorovaikutukset tandemisten 7- ja 8-lapaisten β- potkureiden V:n muotoisen anturidomeenin sisällä, joka muodostaa sytokromi c:n sitoutumispinnan

Apaf-1:n apoptosomissa dATP:n sitoutumiskohta sijaitsee NBD-HD1:n rajapinnalla, ja se muodostuu osittain Walkerin A-silmukasta sekä HD1:n ja WHD:n välisestä silmukasta. Vaikka Apaf-1 voi sitoa ADP:tä inaktiivisessa tilassa, dATP:tä suositaan hieman dATP:n käyttämisessä apoptosomin kokoonpanossa in vitro (ks. ref. ), kun taas ATP:tä on paljon enemmän in vivo (~ 2 mM ATP:tä vs. 10 μM dATP:tä). . Jonkin verran stabiloitumista tapahtuu NBD:ssä olevan arginiinijäännöksen (Arg265) sekä HD1:ssä olevien Ser325:n ja Tyr359:n ja sitoutuneen ATP/dATP-molekyylin välisten vuorovaikutusten kautta. NBD-HD1-parin kiertyminen WHD:ssä olevan α-kierteen 20 ympäri sijoittaa HD1-WHD-silmukan nukleotiditaskun pohjalle, jolloin NBD-HD1-parin on mahdollista muodostaa keskushubin sisällä ympärysmittaisia vuorovaikutuksia kokoonpanon aikana . Tämä myös katkaisee vuorovaikutukset WHD:n kanssa, jotka normaalisti stabiloivat suljetun konfiguraation .

Sensori β-propellerit ja sytokromi c:n sitoutuminen

Apoptosomipyörän ”puolat” työntyvät HD2-domeenien toimesta navan ulkopuolelle, ja kumpikin varsi muodostaa V:n muotoisen alueen tyven, joka sisältää kaksi β-propellerin sensori-domeenia. Pisimmässä Apaf-1-isomuodossa (Apaf-1XL), joka ilmentyy useimmissa kudoksissa , viisitoista WD40-toistoa muodostavat tandemmaisia 7- ja 8-lapaisia β-propellereita, ja äskettäinen kryo-EM-tutkimus osoitti, että tällä on uusi sulkumekanismi. Tämä β-potkurien topologia on samanlainen kuin aktiinin vuorovaikutusproteiinissa (Aip1p), jossa HD2:sta peräisin oleva linkkeri muodostaa 8-lapaisen β-potkurin viimeisen lavan d-säikeen (merkitty pienellä sinisellä alueella 7-lapaisen potkurin alkupäässä kuvassa 1 a), ennen kuin se risteää muodostaakseen 7-lapaisen β-potkurin . Tämä topologia varmistettiin hiiren Apaf-1:n kiderakenteella 3,0 Å:n resoluutiolla, ja se näyttää olevan konservoitunut tummissa β-potkureissa .

Apaf-1:n apoptosomissa V:n muotoiset β-potkurit muodostavat sytokromi c:n sidontataskun, ja vuorovaikutus sytokromi c:n kanssa näyttää stabiloituvan vetysidoksilla ja suolasilloilla . Sekä sytokromi c:n pelkistyneet että hapettuneet muodot voivat olla vuorovaikutuksessa apoptosomin kanssa välittäen sen aktivoitumista . Mielenkiintoista on, että sytokromi c näyttää olevan vuorovaikutuksessa ensisijaisesti 8-lapaisen β-propektorin kanssa, kun taas 7-lapaisen β-propektorin kanssa muodostuu rajoitetumpi kontaktipinta . Sytokromi c on erotettu ~ 6 Å:n resoluutiolla uusissa kartoissa paikallisen liikkeen vuoksi, ja molekyyli on kiertynyt ~ 90° verrattuna aikaisempaan malliin, joka perustui molekyylin telakoitumiseen karttaan, jossa kierteitä ei ollut erotettu . Suunnattu mutageneesi paljasti sytokromi c:stä kriittisiä jäännöksiä, joita tarvitaan vakaaseen assosiaatioon Apaf-1:n β-propellien kanssa, ja jotkin näistä jäänteistä (G56, P76, I81) ovat tärkeitä apoptosomin muodostumiselle ja sitä seuraavalle kaspaasiaktivaatiolle .

Trunkoidut Apaf-1-molekyylit, joista puuttuvat WD-40-toisto-alueet, voivat myös kokoontua muodostaen apoptosomeja, jotka ovat konstitutiivisesti aktiivisia, mutta jotka hajoavat ajan kuluessa . Tämä on viitannut siihen, että β-proptosomit voivat olla jonkin verran kokoamista estäviä ja samalla stabiloida Apaf-1-apoptosomia . Apaf-1-apoptosomin β-propellerit sijaitsevat kuitenkin suurella säteellä, eivätkä ne ole vuorovaikutuksessa viereisten alayksiköiden kanssa, eivätkä ne ole vuorovaikutuksessa monomeerin muiden domeenien kanssa HD2:ta lukuun ottamatta. Näin ollen destabilisaatiomekanismi on edelleen mysteeri. Vaikka se on spekulatiivista, β-propellien puuttuminen typistetyistä apoptosomeista saattaa heikentää HD2:n vuorovaikutusta keskushubin kanssa, mikä johtaa ajasta riippuvaiseen hajoamiseen.

On nyt selvää, että sytokromi c:n sitoutuminen aiheuttaa β-propellerialueen pyörimisen ylöspäin, mikä katkaisee 7-lapaisen β-propellerin ja NBD-HD1-parin välisen yhteyden inaktiivisessa Apaf-1-monomeerissa , kun taas 7-lapainen β-propelli pyörii kohti 8-lapaista β-propellia puristusliikkeessä . Nämä tapahtumat horjuttavat autoinhiboitua Apaf-1:n konformaatiota ja helpottavat nukleotidivaihtoa edistämällä konformaatiomuutoksia, jotka paljastavat ADP:n sidontataskun ATP/dATP:n sitoutumisen mahdollistamiseksi. Tämä vakauttaa Apaf-1-monomeerin laajennettuun konformaatioon siten, että se voi olla vuorovaikutuksessa naapuriprotomeerien kanssa. Bändisiirtokokeet viittaavat siihen, että Apaf-1:n nukleotidivaihto ja siihen liittyvät konformaatiomuutokset voivat tapahtua vastauksena sytokromi c:n sitoutumiseen, koska Apaf-1:n konformaatiossa ei havaittu merkittäviä muutoksia dATP:n lisäyksellä ilman sytokromi c:tä . Yhdessä nämä tiedot tukevat peräkkäistä mallia, jossa sytokromi c:n sitoutuminen tapahtuu ennen nukleotidivaihtoa, mikä helpottaa siirtymistä suljetusta Apaf-1:n konformaatiosta laajennettuun Apaf-1:een. Lisäksi nämä havainnot viittaavat siihen, että WD40-toistot toimivat sensoreina, jotka käynnistävät apoptosomin alkukokoonpanon sitomalla sytokromi c:tä.

Pcaspase-9:n aktivoitumisen mahdolliset mekanismit

Apoptosomi rekrytoi procaspase-9:n muodostamaan holoentsyymin, joka lisää sen katalyyttistä aktiivisuutta . Liuoksessa pc-9 on konstitutiivinen monomeeri, kun se ei ole sitoutunut Apaf-1:een, kun taas aktiiviset kaspaasit ovat yleensä dimeerejä . Huomionarvoista on, että kahden pc-9-monomeerin välinen dimeerinen vuorovaikutus kideristikossa edistää aktiivisen alueen muodostumista toiseen katalyyttiseen alayksikköön, kun taas toinen alayksikkö pysyy inaktiivisessa kokoonpanossa (PDB 1JXQ), ja samanlainen ilmiö esiintyy CED-3-dimeereissä korkeissa pitoisuuksissa . pc-9:n N-terminaalinen CARD on vuorovaikutuksessa Apaf-1:n CARDin (CARDien) kanssa rekrytoidakseen apikaalisen prokaspaasin apoptosomiin, ja tämä edistää katalyyttisen domeenin aktivoitumista, joka on erotettu CARDista pitkällä linkkerillä (kuva 2a) . Lisäksi katalyyttisen domeenin p20- ja p10-alayksiköt ovat myös yhteydessä toisiinsa linkkerillä, joka on altis itsensä pilkkoutumiselle . Ymmärtääksemme, miten pc-9 aktivoituu, meidän on siis ymmärrettävä CARD:ien ja pc-9-linkkereiden rooli holo-apoptosomissa.

On ehdotettu erilaisia malleja, jotka selittävät pc-9:n aktivoitumisen mekanismeja apoptosomissa . ”Läheisyyden aiheuttama dimerisaatiomalli” ennustaa, että pc-9-molekyylien rekrytoituminen Apaf-1-apoptosomiin voi helpottaa homodimerisaatiota, jonka ajatellaan johtavan pc-9:n autoaktivoitumiseen . Viime aikoihin asti ei kuitenkaan ole ollut rakenteellista tai biokemiallista näyttöä siitä, että pc-9 on homodimeerinen, kun se on sitoutunut apoptosomiin (ks. jäljempänä ). ”Indusoidun konformaation mallissa” ehdotettiin, että Apaf-1-apoptosomi on alusta, joka sitoo pc-9:n helpottaakseen sen aktiivista konformaatiota . Viimeaikaisen mallinnuksen mukaan pc-9:n aktivoituminen tapahtuu ensisijaisesti apoptosomin alustan allosterisen säätelyn kautta. Kaikissa näissä malleissa apoptosomin ensisijainen tehtävä on koota Apaf-1:n ja pc-9:n CARDien välinen multimeerinen kompleksi, joka helpottaa pc-9:n aktivoitumista lisäämällä zymogeenin paikallista pitoisuutta . Lisäksi tiedot muunnetusta pc-9:stä, joka on konstitutiivinen dimeeri liuoksessa, viittaavat siihen, että CARD ja sen linkkeri voivat inhiboida katalyyttisiä domeeneja . Näin ollen CARD-heterodimeerin muodostuminen apoptosomissa saattaa vapauttaa tämän eston, mutta tämä ajatus on vielä testaamatta.

Vaikka dimerisaatiolla voi olla keskeinen rooli aktivaatiossa, se, miten se tapahtuu apoptosomissa, on jäänyt selittämättä, ja viimeaikaiset tiedot ovatkin viitanneet monimutkaisemman aktivaatiomekanismin mahdollisuuteen, johon liittyy sekä pc-9-molekyylien homodimeerisaatio että yksittäisen pc-9:n katalyyttisen domeenin muodostuminen heterodimeeriksi Apaf-1:n NBD:n kanssa . Mielenkiintoista on, että Apaf-1-monomeerin inaktiivinen konformaatio ei estä pc-9:n sitoutumista CARD-CARD-vuorovaikutusten kautta, kuten kaistansiirtokokeet osoittavat. Näin ollen pc-9/Apaf-1-heterodimeerit voivat rekrytoitua kokoavaan apoptosomiin osana sen aktivoitumista (kuva 3). Avoimeksi kysymykseksi jää, ohjaavatko Apaf-1:n kokoonpanoa pc-9:n läsnä ollessa syntymässä olevan levyn CARD-domeenien väliset lisävuorovaikutukset.

Ensimmäinen kiderakenne paljasti Apaf-1:n ja pc-9:n CARD-domeenien välisen stabiilin 1:1-kompleksin, jossa on komplementaarinen rajapinta (tunnetaan nimellä Tyyppi I), joka on välttämätön pc-9:n aktivoinnille . Tämä vakaa 1:1-kompleksi osoittautui kuitenkin myöhemmin riittämättömäksi pc-9:n aktivoimiseksi. Sen sijaan Apaf-1:n ja pc-9:n CARDit muodostavat korkeamman asteen oligomeerisia komplekseja, joita vakauttaa ensisijaisesti kaksi kolmesta mahdollisesta rajapinnasta (tunnetaan nimillä TypeI, II ja III), joita esiintyy myös muissa kuoleman domeenikomplekseissa . CARD-CARD-levyyn osallistuvien vuorovaikutusten vertailu CED-4-, Dark- ja Apaf-1-apoptosomeissa tuo esiin II- ja III-tyypin rajapintojen jonkinasteisen säilymisen, kun taas I-tyypin CARD-vuorovaikutukset löytyvät vain ihmisen apoptosomista . Äskettäinen kiderakenne 2,1 Å:n resoluutiolla paljasti heterotrimeerisen kompleksin, joka koostuu kahdesta Apaf-1:n CARD-kortista ja niiden välissä olevasta pc-9:n CARD-kortista . Tyypin II vuorovaikutukset, joihin liittyy jäämiä pc-9:n (Arg36/ Arg65) ja Apaf-1:n (Glu78) CARDeissa, osoittautuivat kriittisiksi pc-9:n aktivoitumiselle aiemmin kuvattujen tyypin I vuorovaikutusten ohella. Lisäksi yksittäinen jäännös (Glu41 Apaf-1:n CARDissa) voi muodostaa haarautuvan vuorovaikutuksen pc-9:n CARDin kanssa minimaalisessa tyypin III rajapinnassa. Lisävuorovaikutusten Apaf-1 CARDin Lys58:n ja Lys62:n kanssa osoitettiin myös olevan välttämättömiä pc-9:n aktivoitumiselle, ja ne voivat auttaa Apaf-1 CARDien sijoittamisessa alustalle. Näin ollen heterotrimeerisen CARD-kompleksin muodostuminen tarjoaa keinon sitoa useita pc-9:n katalyyttisiä domeeneja apoptosomin alustaan .

Kaksi aktiivisen Apaf-1-apoptosomin lähes atomiresoluutiorakennetta ovat paljastaneet, että Apaf-1:n ja pc-9:n CARD-levyjen kokonaisarkkitehtuurin mukaan Apaf-1:n ja pc-9:n levyasetelma luo kallistetun levyn, joka istuu keskuskeskipisteen yläpuolella (kuvat 2 ja 3) . Levyn ja alustan välinen symmetriaepätasapaino johtaa CARD-levyn akentriseen asentoon ylhäältä katsottuna (kuva 3) . Levyä voidaan kuvata Apaf-1- ja pc-9-CARD-parien spiraalina, jossa neljä Apaf-1-CARD-paria muodostaa alimman ”kerroksen”, kun taas kolme tai neljä pc-9-CARD-paria on yläpinnalla (kuvat 2b-d). Lisäksi Apaf-1 CARDit siirtyvät kauemmas keskushubin pinnasta, kun ne kiertyvät spiraalimaisesti ylöspäin vasenkätisesti, ja näin ollen niillä on erilaiset linkerikonformaatiot ja erilaiset vuorovaikutukset keskushubin vastaavien NBD:idensä kanssa. Apaf-1:n ja pc-9:n CARD-parit ovat vuorovaikutuksessa tyypin II rajapintojen kautta, ja ne yhdistyvät sivusuunnassa spiraalin ympärillä pääasiassa tyypin I vuorovaikutusten kautta. Huomionarvoista on, että vain neljä Apaf-1:n seitsemästä CARD-parista on vuorovaikutuksessa levyssä olevien pc-9 CARD-parien kanssa. Tämä johtuu siitä, että loput kolme Apaf-1 CARD-molekyyliä eivät helposti sovi spiraalin alayksiköiden sidosmalliin eivätkä voi jatkaa spiraalia, koska niiden CARD-NBD-linkkerit ovat liian lyhyitä . Apoptosomin vierekkäisten alayksiköiden Apaf-1 CARDit sijaitsevat saumassa (paikkojen 1a ja 7a välillä), jossa spiraali lakkaa pitenemästä pystysuoraan (kuva 2c, d) . Apaf-1/pc-9 CARD-kiekon muodostuminen on välttämätöntä apoptosomin aktivoitumiselle, ja pc-9:n katalyyttiset domeenit on sidottu joustavasti CARD-kiekkoihin linkkerin avulla (kuva 2a) . Yhdessä rakenteessa näkyi levy, jossa oli neljä Apaf-1 CARDia ja kolme pc-9 CARDia, ja heikko tiheys osoitti, että neljäs pc-9 CARD voisi sitoutua kierteisen spiraalin yläosaan alhaisemmalla miehityksellä . Toisessa rakenteessa levyn vallitseva konfiguraatio sisälsi 8 CARDia, ja CARDien konformaatio spiraalissa oli hyvin samankaltainen näiden kahden toisistaan riippumattomasti ratkaistun rakenteen välillä (ks. päällekkäisyys, kuva 2d). Vaihtelut pH:ssa ja suolakonsentraatiossa voivat selittää erilaisen miehityksen kahdeksannessa asennossa. Näin ollen apoptosomin kokoaminen edistää pc-9 CARD:ien rekrytoitumista ja paikallista konsentroitumista, mikä mahdollistaa uudenlaisen kierteisen oligomeerin muodostumisen, jossa on 7 tai 8 CARD:ia.

Uusi analyysi (MALS:llä ja SAXS:llä) osoitti, että CARD-kompleksin muodostuminen on konsentraatioriippuvaista ja että yhtä suuret määrät Apaf-1:n ja pc-9:n CARD:eja assosioidaan pareittain vahvemman tyypin I rajapinnan välityksellä, ja että korkeilla konsentraatiokertymillä liuoksessa muodostuu pääasiassa 3:3 -kompleksi . Tämä CARD-kompleksi kiteytettiin ja rakenne määritettiin 3,0 Å:n resoluutiolla, jolloin paljastui kolmen Apaf-1/pc-9 CARD-parin vasemmanpuoleinen spiraali, jonka konformaatio on samankaltainen kuin apoptosomissa havaittu konformaatio, mutta jossa on joitain eroavaisuuksia (PDB 5WVC; kuva 2e) . Ympäristö kiteessä on kuitenkin aivan erilainen kuin koontuvassa apoptosomissa, mikä johtuu osittain ristikkokontakteista ja CARD-NBD-linkkereiden asettamien rajoitusten aiheuttaman ydintymispinnan puuttumisesta. Tämä saattaa selittää havaitut erot kierteisten CARD-rakenteiden välillä. Tähän sisältyy yhden tai kahden ylimääräisen CARDin lisääminen holo-apoptosomin levymuotoiseen spiraaliin ja se, että levyn pohjan muodostavat neljä Apaf-1 CARDia eikä kolme, kuten liuoksessa ja kiteessä. Kun 8 CARD-kiekon ja kiderakenteesta saadun 6 CARD-kortin spiraalin optimaalinen kohdistus on tehty, CARD-kortit ovat hyvin yhteneväiset paikoissa 2p, 3a ja 4p, ja 6 CARD-kortin spiraalin jälkimmäisellä puoliskolla on jonkin verran eroavaisuuksia (kuvat 2f, g). Erityisesti Apaf-1:n CARD-kortti asennossa 7a on siirtynyt pystysuunnassa virheellisesti väliasentoon, kun Apaf-1:n CARD-kortti asennossa 1a puuttuu (kuva 2g). Näin ollen alustan ja CARD-levyn väliset vuorovaikutukset ovat kriittisiä apoptosomissa esiintyvien suurempien 7- ja 8-CARD-spiraalien ydintymiselle.

Levyn kasaantumisen aikana spiraalin ydintyminen voi tapahtua eri tavoin, mukaan lukien CARD-heterotrimerin muodostuminen, joka koostuu kahdesta Apaf-1 CARDista ja yhdestä pc-9 CARDista, ja jossa Apaf-1 CARD sijaitsee spiraalin tyvessä (paikassa 1a). Tämän jälkeen voi tapahtua kahden Apaf-1/pc-9 CARD-parin myöhempi lisäys, jotka ovat vuorovaikutuksessa tyypin I rajapintojensa kautta, ja joissakin tapauksissa spiraali katetaan lopullisesti pc-9 CARD:lla paikassa 8p. Muut muunnokset ovat kuitenkin mahdollisia, kun otetaan huomioon Apaf-1 CARD-NBD-linkkerin joustava luonne siten, että kolme Apaf-1/pc-9 CARD ”tyyppi I” -paria voi muodostua peräkkäin keskuskeskuksesta, jolloin Apaf-1 CARD lisätään spiraalin tyvelle (sijaintiin 1a) kokoonpanon alkuvaiheessa. Tärkeää on, että levyn kokoaminen voi olla yhteistoiminnallista, jotta apoptosomin neljän Apaf-1 CARD-kortin, jotka muodostavat spiraalin pohjan, oikea välimatka säilyy .

Aktiivisen apoptosomin osalta yksi merkittävä ero on havaittavissa keskusnavan kohdalla, kun verrataan julkaistuja rakenteita (kuvat 3 ja 4) . Lyhyesti sanottuna pc-9:n katalyyttiseksi domeeniksi tunnistettu tiheys (p20/p10) sijaitsee hiljattain laaditussa 3D-kartassa keskushubissa, ja tätä piirrettä havaittiin esiintyvän noin 50 %:ssa komplekseista . Lisäksi samanlainen tiheys visualisoitiin aiemmassa pienemmän resoluution kartassa holo-apoptosomista, mikä mahdollisti p20/p10-alayksiköiden kohtuullisen, vaikkakin alustavan telakoitumisen ; näin ollen havaittu piirre on toistettavissa. Tämä uusi tiheys on kuitenkin havaittu vain matalalla resoluutiolla, mikä saattaa heijastaa joustavuutta p20/p10-alayksiköiden kiinnittymisessä keskuskeskukseen. Yigong Shin ryhmän määrittämässä lähes atomitason resoluutiokartassa havaittiin sirpinmuotoinen tiheys ~ 7 Å:n resoluutiolla keskuskeskuksessa, CARD-levyn vieressä. Tämä tiheys sisältää selvästi ylimääräisen pc-9 CARDin keskellä, joka on vuorovaikutuksessa kahden Apaf-1 CARDin kanssa, jotka sijaitsevat molemmilla puolilla, tavalla, joka on samanlainen kuin kahdessa kiderakenteessa havaittu. Tämä heterotrimeerinen konfiguraatio pystyttiin kuitenkin erottamaan vain ~ 10 prosentissa hiukkasista . Näyttää siis siltä, että kokeelliset olosuhteet näytteen valmistuksen ja ruudukon jäädyttämisen aikana voivat vaikuttaa siihen, miten pc-9 on vuorovaikutuksessa keskushubin potentiaalisten sitoutumiskohtien kanssa, mukaan lukien levyn kaltaisen spiraalin muodostuminen, jossa on vaihteleva määrä pc-9 CARDeja, ja sellaisten sitoutumiskohtien käyttö, jotka sijaitsevat akentrisen levyn vieressä. Kun holo-apoptosomin kaksi viimeisintä epäsymmetristä rakennetta kohdistetaan niiden CARD-kiekkojen perusteella, keskushubissa sijaitsevat uudet tiheyspiikit ovat varsin erilaisissa paikoissa (kuva 4). Vaikka pc-9:n katalyyttinen domeeni (p20/p10) voi sijaita kahdessa paikassa (todennäköisin on esitetty kuvassa 4c) , kolme CARD-tiheyshuippua on kiertynyt ja niillä on erilainen profiili sivulta katsottuna (ei esitetty) verrattuna pc-9:n katalyyttiseen domeeniin (kuvat 4b, d). Apaf-1:n CARD-NBD-linkkeritiheyksien kuvio mahdollistaa kaikkien asiaankuuluvien CARD-NBD-linkkereiden tarkan kartoituksen kolmen CARDin holo-apoptosomissa, jossa on kuusi järjestäytynyttä Apaf-1:n CARDia (kuva 4d) . Kriittinen tekijä on se, että linkkereiden pituus (~ 25-30 Å) ja linkkereiden suhteelliset sijainnit saattavat estää kolmen CARD-moduulin sitoutumisen joko sijaintiin 1 tai 2 keskushubissa. Näin ollen näyttää siltä, että keskushubissa on useita kohtia, joita voidaan käyttää eri tavoin pc-9 CARDin tai katalyyttisen domeenin sitomiseen.

Prokaspaasi-9:n on arvioitu sitoutuvan apoptosomiin suhdeluvuilla, jotka vaihtelevat välillä 2-5 zymogeeniä seitsemää Apaf-1-molekyyliä kohti , joten näyttää siltä, että apoptosomiin sitoutuneiden pc-9-molekyylien tarkka määrä voi vaihdella kokoonpanon aikaisista olosuhteista riippuen, mikä saattaa kuvastaa tämän proteolyyttisen koneiston dynaamista luonnetta. Lisäksi näyttää selvältä, että Apaf-1:n vastineet eivät sido kuudetta tai seitsemättä pc-9 CARD-molekyyliä suhteessa apoptosomissa jo dokumentoituihin paikkoihin, mikä voi heijastaa joko steriittistä rajoitusta tai suuremman oligomeerin tarvetta stabiloida sidotut pc-9 CARD-molekyylit. Tärkeää on, että joitakin pc-9:n katalyyttisiä domeeneja ei näy nykyisissä kryo-EM-tiheyskartoissa, koska ne kiinnittyvät joustavasti pitkien CARD-p20-linkkereiden kautta, mikä vaikeuttaa aktivaation tarkkojen mekanismien selvittämistä ja ymmärtämistä ja korostaa samalla tarvetta tehdä lisää yksimolekyylitutkimuksia.

Apoptosomin ensisijaisena tehtävänä on aktivoida pc-9:ää niin, että se voi toteuttaa apoptoosin. Rakennetutkimukset ovat antaneet tietoa pc-9:n rekrytoinnista ja aktivoinnin vaatimuksista, mutta useat biokemialliset kokeet ovat nyt osoittaneet, että sekä läheisyyden aiheuttama dimerisaatio että monomeerisen pc-9:n allosteerinen säätely ovat kriittisiä apoptosomin toiminnan säätelyssä, ja ne voivat myös säädellä apoptosomin aktiivisuuden kestoa. Ensinnäkin pc-9:n rekrytointi apoptosomiin lisää sen paikallista pitoisuutta, jotta se voi homodimeroitua, mikä lisää sen affiniteettia kompleksia kohtaan. Mielenkiintoista on, että pilkkoutumattomalla pc-9:llä on suurempi taipumus homodimerisaatioon ja että se osoittaa lisääntynyttä proteaasiaktiivisuutta (kaspaasi-3:n pilkkoutuminen) apoptosomissa kuin pilkottu kaspaasi-9 . Tämän seurauksena katalyyttisen domeenin alayksiköiden välisen p20/p10-linkkerin pilkkominen vähentää pc-9:n affiniteettia apoptosomiin, ja kun se on prosessoitu, kaspaasi-9 vapautuu eikä sitoudu uudelleen apoptosomiin. Tärkeää on, että nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että pc-9:n homodimerisaatio on aktivoitumisen edellyttämä avaintapahtuma ja että apoptosomi helpottaa tätä tapahtumaa. Tämä on yhdenmukaista muiden CARD-kaspaasien, kuten kaspaasi-2:n ja Dronc:n, biokemiallisten tutkimusten kanssa, joissa alkuvaiheen aktivoituminen edellyttää pikemminkin dimerisaatiota kuin zymogeenin pilkkomista . pc-9:n sitoutumisen vakauttaminen apoptosomiin ei edellytä ainoastaan CARD-CARD-vuorovaikutuksia, vaan myös pc-9:n pienen alayksikön (p10) vuorovaikutuksia sen GCFNF404-motiivin kautta homo- ja heterodimeerien muodostamiseksi . Tässä vaiheessa ei ole selvää, miten pc-9:n homodimeerin muodostuminen vaikuttaa CARD-CARD-levyn vakauteen, sillä katalyyttisen domeenin dimeerit näyttävät olevan melko joustavia, koska ne voidaan irrottaa holo-apoptosomista paikkaan kohdistetulla trombinolyysillä eivätkä ne erotu ilman symmetriaa tarkennetuissa kryo-EM-kartoissa . Myös pc-9:n GCFNF-motiivi on vuorovaikutuksessa Apaf-1:n NOD:n kanssa muodostaen pc-9/Apaf-1-heterodimeerejä, jotka pilkkovat tehokkaasti kaspaasi-3:a . Nämä tiedot viittaavat siihen, että pc-9:n katalyyttinen domeeni, joka on suoraan vuorovaikutuksessa apoptosomin kanssa, voi olla aktiivinen. Tämä oletettu kaspaasi-3:n pilkkomisen aktiivinen paikka saattaa vastata keskushubissa havaittua uutta tiheyttä, joka on tulkittu p20/p10-molekyyliksi, ja tästä asiasta tarvitaan lisätutkimuksia. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että pc-9:llä voi olla kaksi erilaista aktiivista konformaatiota apoptosomissa, jolloin yksi tai mahdollisesti kaksi homodimeeriä on kiinnittynyt CARD-levyyn ja pc-9/Apaf-1-heterodimeeri on sitoutunut keskushubiin. Kun otetaan huomioon holo-apoptosomit, joissa on kolme CARD-moduulia sidottuna keskuskeskukseen, vähintään kuusi permutaatiota on mahdollista kolmen tai viiden pc-9:n katalyyttisen domeenin sijoittelulle (kuva 5). Näin ollen mahdollisten aktiivisten pc-9-katalyyttisten domeenien määrä (homodimeereinä ja heterodimeereinä) vaihtelee sen mukaan, kuinka monta pc-9-molekyyliä on rekrytoitu apoptosomiin, kun ne täyttävät Apaf-1:n CARD-korttien välittämiä mahdollisia sitoutumiskohtia.

Loppujen lopuksi kaspaasi-3:n suorittama pc-9:n täydellinen pilkkominen poistaa alayksiköiden välisen linkkerin ja palauttaa kaspaasi-9:n täydellisen aktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että kaspaasi-3:lla on myös proteolyyttinen takaisinkytkentä pc-9:n suhteen, joka voi vahvistaa apoptoottista signaalia . Samanlaista mekanismia on ehdotettu kaspaasi-2:lle . Näissä biokemiallisissa tutkimuksissa on lisäksi esitetty molekyyliaikamalli, jossa kaspaasi-9:n dissosioitumisnopeus apoptosomista määräytyy p20-p10-linkkerin alkuhalkaisun perusteella, mikä vähentää sen apoptosomin sitoutumisaffiniteettia . Halkaistun kaspaasi-9:n täydellinen dissosiaatio holo-apoptosomista edellyttäisi kuitenkin sen CARDin irtoamista levystä tai kolmesta CARD-moduulista. Näin ollen aktiivisten kaspaasi-9-molekyylien vapautumisessa voi olla hierarkia, joka riippuu niiden CARDien paikallisesta ympäristöstä. CARD-kiekon rakenne, jossa kaikki pc-9 CARDit sijaitsevat yläpinnalla, saattaa myös helpottaa kaspaasi-9:n vapautumista.