Vasta-aineen validointi

Resurssit ”Tekniset resurssikeskukset ”Vasta-aineen tekniset resurssit ”Vasta-aineen validointi

Kaikki vasta-aineet eivät kelpaa kaikissa kokeissa ja olosuhteissa, ne on validoitava tiettyä sovellusta ja lajia varten. Tällä hetkellä ei ole olemassa standardoituja keinoja ”vasta-aineiden validointiin”, ja tämä voi vaikuttaa suuresti kokeiden toistettavuuteen ja luotettavuuteen. Lehdet ja myöntävät tahot ovat ryhtyneet toimiin tämän puutteen korjaamiseksi. Monissa laitoksissa on nykyään vaatimuksia, joissa on nimenomaisesti ilmoitettava, miten vasta-aine validoidaan tiettyä käyttötarkoitusta varten. Valitettavasti vasta-aineen validoinnille ei ole yleisesti hyväksyttyjä kriteerejä. Niinpä jokaisen tutkijan on itse validoitava jokainen vasta-aine aiottua käyttötarkoitusta varten.

Basic Validation

Vakiovasta-aineiden validointimenetelmiin kuuluvat western blot, ELISA, virtaussytometria ja IHC. Useimmat tutkijat tuntevat nämä hyväksi havaitut menetelmät. Validointiprosessi voi olla aikaa vievä, koska tutkijan tai valmistajan on validoitava vasta-aine jokaista sovellusta varten. Vaikeutta lisää se, että kunkin määrityksen olosuhteet ovat erilaiset. Esimerkiksi western blot riippuu proteiinien denaturoinnista. Western blot -validoitu vasta-aine voi siis toimia hyvin denaturointiolosuhteissa, mutta se ei välttämättä tunnista antigeenejä niiden natiivissa konformaatiossa (esim. ELISA).1 Vastaavasti natiivin proteiinien affiniteetin perusteella validoitu vasta-aine voi epäonnistua saman antigeenin sitomisessa denaturoinnin tai fiksaation jälkeen.

Edellä mainituilla menetelmillä on tarpeellinen rooli vasta-aineiden validoinnissa. Emme kuitenkaan voi luottaa pelkästään näihin menetelmiin, koska ne eivät edusta jatkuvasti laajenevia sovelluksia. Validoitujen vasta-aineiden luotettavuustasoa voidaan nostaa ottamalla mukaan muita validointitekniikoita.

Vanhat tekniikat, uudet käyttötarkoitukset

Puuttuakseen vasta-aineiden perusvalidoinnin puutteisiin ryhmä tutkijoita kokoontui hiljattain ”ehdottamaan vakio-ohjeita vasta-aineiden validoimiseksi”.2 He ehdottavat, että vasta-aineiden perusvalidointimenetelmien lisäksi tutkijat alkaisivat nojautua käsitteellisiin pilareihin. Näitä ovat geneettiset strategiat, riippumattomat vasta-ainestrategiat ja merkittyjen proteiinien ilmentäminen.2

• Genetic Strategies:

  Geneettiset strategiat koostuvat tekniikoista, kutenCRISPR-Cas9, RNAi ja siRNA knockdown, joita käytetään yhdessä proteiinien havaitsemismäärityksen kanssa. Näillä menetelmillä havaitaan kyseisen vasta-aineen mahdollinen epäspesifinen sitoutuminen sen jälkeen, kun kyseinen geeni on tyrmätty tai vähennetty. Jos vasta-aine on spesifinen, vasta-aineen signaalia ei pitäisi havaita lainkaan tai sen pitäisi olla vähentynyt vastaavasti knock-out- tai down-solulinjoissa.

• riippumaton vasta-ainelähestymistapa

  Riippumattomien vasta-aineiden käyttö on toinen menetelmä, jolla epäspesifinen sitoutuminen voidaan havaita. Riippumattomassa vasta-ainemenetelmässä käytetään kahta erilaista (riippumatonta) vasta-ainetta, jotka sitoutuvat samaan antigeeniin mutta eri epitooppeihin. Näin ollen näillä kahdella vasta-aineella pitäisi olla sama havaintomalli eikä kohdeproteiinin ulkopuolista sitoutumista.2 Tämä tekniikka edellyttää useita näytteitä testausta varten, jotta voidaan kontrolloida kohdeproteiinin vaihtelevaa ilmentymistä, mikä voi tulla kalliiksi ja aikaa vieväksi.2 Lisäksi validointitekniikka perustuu siihen, että käytettävissä on useita vasta-aineita, jotka tunnistavat saman kohdeproteiinin eri epitooppeja. GenScript tarjoaa epitooppien binningiäMonoExpress™ mAb -palveluissa, jotka sisältävät ”riippumattomia vasta-aineita” proteiiniantigeeneille.

• Tagged Protein Expression

  Merkittyjen kohdeproteiinien havaitsemisen analysointi voi myös tarjota keinon mitata vasta-aineiden epäspesifistä sitoutumista. Tässä menetelmässä kohdeproteiinit muunnetaan joko affiniteettimerkillä (esim. FLAG) tai fluoresoivalla proteiinilla (esim. GFP). Tämän jälkeen validoitavan vasta-aineen havaintomallia verrataan riippumattoman vasta-aineen menetelmän tapaan tag-spesifisen vasta-aineen havaintomalliin. Vaikka menetelmä on suoraviivainen, yksi ongelma tässä menetelmässä on varmistaa, että merkityt proteiinit ilmentyvät endogeenisella tasolla, koska ”yliekspressio voi peittää kohteen ulkopuolisten sitoutumistapahtumien havaitsemisen”.2

  Rekombinanttivasta-aineet vaihtoehtona monoklonaalisille vasta-aineille?

  Vasta-aineiden validointiin liittyvässä hiljattain julkaistussa kehotuksessa ehdotettiin, että tutkijat käyttäisivät vain rekombinanttivasta-aineita polyklonaalisten tai jopa monoklonaalisten vasta-aineiden sijasta. Monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan hybridoomasolulinjojen avulla. Valitettavasti hybridoomasolulinjat voivat kuolla pois, menettää vasta-ainetta koodaavia geenejään tai olla kasvamatta, kun ne otetaan pois pakastevarastosta.3 Lisäksi hybridoomalla tuotetut monoklonaaliset vasta-aineet voivat sitoutua useampaan kuin yhteen kohteeseen. Hybridooman koodaaman vasta-aineen sekvenssin määrittäminen ja vasta-aineen tuottaminen rekombinanttisesti ratkaisee nämä ongelmat. Määritellyn sekvenssin vuoksi rekombinanttivasta-aineet voivat myös tarjota toisen validointikerroksen verrattuna siihen, että käytettäisiin pelkästään edellä mainittuja tekniikoita.3

  Näillä lisävalidointimenetelmillä ehdotetaan ”todisteita siitä, että vasta-aine sitoo kohdettaan, ja useimmissa tapauksissa niiden pitäisi myös mahdollistaa mahdollisen ristireaktiivisuuden arviointi testatuissa olosuhteissa”.2 Vanhoja ja uusia strategioita on kuitenkin todennäköisesti käytettävä yhdessä, jotta vasta-aine voidaan validoida asianmukaisesti.

Tarkoituksenmukaisen vasta-aineen validointimenetelmän valitseminen

Kun kaikki nämä vasta-aineisiin liittyvät kysymykset on otettu huomioon, miten sopiva menetelmä valitaan?

Ensin on päätettävä, missä määrityksessä vasta-ainetta käytetään. Esimerkiksi CRISPR-Cas9-menetelmään ei liity kohdeproteiinin muokkaamista, ja siinä validoidaan, että vasta-aineella ei ole ristireaktiivisuutta muiden proteiinien kanssa. Voit siis käyttää tätä tekniikkaa validoidaksesi vasta-aineita monenlaisia määrityksiä varten, kuten western blot, IHC, immunosytokemia (ICC), virtaussytometria, ELISA, immunoprecipitaatio (IP), kromatiinin immunoprecipitaatio (ChIP) ja käänteisfaasiproteiinimääritykset2 . Koska muunnetun proteiinin ilmentämiseen liittyy kuitenkin vaikeuksia, vasta-aineen validointia merkityn proteiinin ilmentämisen avulla suositellaan vain western bloteille, IHC:lle, ICC:lle ja virtaussytometrialle.

Toiseksi tutkijan on oltava tietoinen näiden validointimenetelmien näyterajoituksista. Esimerkkinä mainittakoon, että sekä CRISPR-Cas9/KO- että tagged protein expression -tekniikoita ei voida käyttää vasta-aineiden validointiin ihmisen kudosnäytteissä ja kehon nesteissä, kuten plasmassa ja seerumissa2 . Tämä johtuu siitä, että ihmisissä ei voida suorittaa geneettistä manipulointia, toisin kuin solulinjoissa.

Loppujen lopuksi, riippumatta vasta-aineen toimittajan käyttämästä vasta-aineesta ja vastaavasta validointimenetelmästä, tutkijan on suoritettava vähintään yksi validointistrategia omassa sovelluksessaan tai näytekontekstissaan.2

Kunkin vasta-aineen validointi omaan erityiseen sovellukseensa ja omiin eläinlajeihinsa on avainasemassa, kun halutaan saada toistettavissa olevia ja luotettavia tuloksia. Nämä tiedot auttavat sinua tekemään päätöksen laboratoriossasi käytettävistä asianmukaisista menetelmistä. Jos haluat lisäapua vasta-aineiden validointiin tai muihin sovelluksiin liittyvissä kysymyksissä, käy osoitteessaGenScript Antibody Technical Resources.

Sovitettu sisällöstä, jonka BitesizeBio on luonut GenScriptin puolesta.