Étude comparative de l’effet de la baicaline et de ses analogues naturels sur les neurones à la privation d’oxygène et de glucose impliquant la réaction immunitaire innée de TLR2/TNF𝛼

Abstract

Ce travail consiste à étudier la baicaline et ses trois analogues , baicaline, wogonoside et wogonine, sur l’effet protecteur du neurone contre la privation d’oxygène-glucose (OGD) et l’expression du récepteur Toll-like 2 (TLR2) dans les dommages de l’OGD. Les résultats montrent que la baicaline et ses trois analogues protègent les neurones contre la privation d’oxygène et de glucose et régulent à la baisse le niveau de protéine du TLR2. L’acide D-Glucopyranosiduronique sur le site 7 de la structure a joué un rôle central dans la cytotoxicité de ces analogues de flavonoïdes. Le groupe méthoxyle sur le carbone 8 de la structure est en relation avec l’expression de la protéine TLR2, ainsi qu’avec l’anti-inflammation. En outre, nous avons détecté la caspase3 et la capacité d’antioxydation, pour étudier l’effet de quatre analogues sur l’apoptose cellulaire et la compétence totale d’antioxydation dans le modèle OGD.

1. Introduction

Scutellariae radix, un médicament chinois, a divers effets pharmacologiques tels que antibactérien, antivirus, anti-inflammation, antioxydation, et anti-coup de pied en clinique . Son ingrédient actif est une sorte de flavones, composé de baicaline, baicaleine, wogonine, et wogoniside brièvement (Figure 1) . Il a été signalé que le radix de Scutellariae protège les neurones des lésions dues à l’ischémie et à la reperfusion. La baicaline, le principal composant des flavones, a été confirmée dans la neuroprotection des dommages causés par l’ischémie et la reperfusion et dans son action sur le système nerveux central. Récemment, la baicaline a été étudiée avec un effet prometteur de neuroaction sur de multiples sites. Cependant, aucun rapport n’a présenté l’effet de la baicaline et de l’expression de TLR2 sur les neurones. Quelques recherches ont rapporté que la wogonine et le wogonoside agissent sur les neurones. La baicaline et la baicaleine ont été étudiées en tant qu’antioxydants ; dans quelques modèles, la baicaleine s’est avérée plus efficace que la baicaline pour réduire plusieurs radicaux libres. En les comparant, la baicaline et la baicaline ont atténué de manière significative les lésions cellulaires induites par le peroxyde d’hydrogène, mais la wogonine et le wogonoside ont agi plus faiblement. On suggère qu’il doit y avoir d’autres mécanismes de la wogonine et du wogonoside sur la neuroprotection.

Figure 1

Structures chimiques de la baicaline et de ses analogues naturels, la baicaline, le wogonoside et la wogonine.

A mesure que l’anti-inflammation de la baicaline et de la baicaleine était confirmée, les recherches sur la réponse immunitaire innée ont été étudiées dans l’ischémie cérébrale reperfusion et ont présenté la raison en partie pourquoi l’anti-inflammation de la baicaline et de la baicaleine était l’un des principaux essais pour la protection du cerveau contre les dommages de l’ischémie reperfusion . Plusieurs récepteurs ont été désignés comme les principales cibles des lésions de reperfusion ischémique dans la glie, tels que les récepteurs TLR (toll like receptors) et les NOD (nucleotide-binding oligomerisation domain). Notre expérience précédente a montré que la baicaline atténuait l’expression de NOD2 et de TNFα dans les neurones présentant des lésions d’ischémie et de reperfusion in vivo et in vitro. Le wogonoside a été signalé comme inhibant l’angiogenèse induite par le lipopolysaccharide via la transduction du signal du récepteur TLR4 (toll-like receptor 4). Cependant, TLR2 n’a pas été étudié par la baicaline et ses analogues naturels.

Sur la base des informations mentionnées précédemment, nous avons étudié le comportement de régulation de la baicaline et de ses analogues à travers un type de cellule neuronale PC12 afin d’explorer les cibles possibles de la baicaline et de ses analogues dans les réactions immunitaires innées pendant la privation d’oxygène et de glucose (OGD) et les relations entre la structure chimique et l’effet parmi la baicaline et ses analogues naturels. Comme TLR2 est l’un des récepteurs initiaux de l’immunité innée et que l’activation inflammatoire, ainsi que le TNFα, peuvent être inhibés par la baicaline dans les cellules pulmonaires, l’expression protéique de TLR2 et du TNFα a été testée pour déterminer le rôle de la baicaline et de ses analogues dans ces modèles de lésions nerveuses. Parallèlement, la caspase3 est un indice bien connu de l’apoptose, et plusieurs études ont rapporté que quelques flavones pouvaient induire l’apoptose des cellules inflammatoires, nous avons donc détecté l’expression de la protéine caspase3. De plus, l’effet des quatre analogues sur la capacité totale d’antioxydation des cellules dans le modèle OGD a également été détecté dans cet article, ce qui a permis de comparer davantage la compétence globale de ces flavones .

2. Matériaux et méthodes

2.1. Produits chimiques et matériaux

La baicaline (la pureté était de 98%) a été présentée par le Dr Lujun Zhang, Laboratoire des sciences pharmaceutiques, Université Tsinghua. Le wogonoside (pureté de 98%) a été présenté par le Dr Xiuwei Yang, École des sciences pharmaceutiques, Université de Pékin. La baïdicine et la wogonine, toutes d’une pureté de 98 % (numéros de lot 111595-200604 et 111514-200403), ont été achetées auprès de l’Institut national chinois pour le contrôle des produits pharmaceutiques et biologiques. De l’eau désionisée a été utilisée tout au long de l’expérience. Les autres solvants et réactifs organiques étaient de qualité réactif analytique. Le tampon PBS à pH 7,4 a été préparé dans notre laboratoire. Les cellules PC12 ont été fournies par la banque de cellules de l’Institut de médecine fondamentale de l’Académie chinoise des sciences médicales (Beijing, Chine). Le sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu RPMI 1640 ont été achetés auprès de GIBCO. Les anticorps anti-TLR2/TNFα/caspase3/β-actine ont été achetés auprès de Santa Cruz Company (USA). L’anticorps secondaire a été acheté auprès de Zhongshan Company (Beijing, Chine). Le kit de détection de la capacité totale d’antioxydation (T-AOC) a été acheté auprès de l’Institut de bio-ingénierie de Nanjing Jiancheng (Nanjing, Chine).

2.2. Culture cellulaire

Les cellules PC12 ont été ajustées à environ 1 × 106 cellules/mL avec 2 mL inoculés dans chaque puits de plaques à 6 puits (Costar) dans du RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 5% de sérum de cheval et de la pénicilline/streptomycine (100 U/mL chacun). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humidifié (5 % de CO2) (Sanyo, Japon) à 37 °C et ont pu être fixées pendant au moins 48 h.

2.3. Essais de cytotoxicité in vitro

Les doses sûres de baicaline et de ses trois analogues pour les cellules ont été évaluées par l’essai MTT (méthylthiazol tétrazolium) in vitro. Après 24 h d’incubation des cellules dans des plaques à 96 puits, la baicaline et ses analogues ont été ajoutés avec le dosage de 10 mg/mL à 0,001 mg/mL. 24 h après l’ajout des composés, le milieu de culture dans les plaques 96 puits a été incubé avec du MTT (5 mg/mL, 200 μL par puits) à 37°C pendant 4 h. Ensuite, le milieu a été soigneusement aspiré et 200 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) par puits ont été ajoutés pour dissoudre les produits de formazan bleus. Les valeurs d’absorbance à 490 nm ont été mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques (modèle 550，Bio-Rad，USA). Les résultats de l’absorbance des puits d’essai ont été exprimés en cellules vivantes. La concentration de cytotoxicité de 50% (CC50) a été calculée .

2.4. Cellules pour la privation d’oxygène-glucose

Pour la privation d’oxygène-glucose (OGD) , nous avons remplacé le milieu de croissance par un milieu de culture sans glucose (2 mL par puits) et placé les plaques dans un incubateur (YCP-30Q, Changsha, Chine) rempli de 95% N2/5% CO2 à 37°C pendant 120 min. Ensuite, les cellules ont été remises dans le milieu d’alimentation normal et incubées dans des conditions normales à 37°C (Sanyo, Japon) pendant le temps spécifique pour les expériences ultérieures. Les cultures cellulaires témoins non privées d’oxygène et de glucose ont été incubées dans des conditions normales dans le milieu avec du glucose.

Pour l’effet protecteur des composés contre les dommages de l’OGD, le test de vie cellulaire a été réalisé comme décrit précédemment. Après 24 h d’incubation des cellules dans des plaques 96 puits, la baicaline et ses analogues ont été ajoutés avec les dosages de 10 mg/mL à 0,001 mg/mL. 24 h après l’ajout des composés, le milieu de culture dans les plaques 96 puits a été incubé avec du MTT (5 mg/mL, 200 μL par puits) à 37°C pendant 4 h. Le milieu a été soigneusement aspiré, et 200 μL de DMSO par puits ont été ajoutés pour dissoudre les produits de formazan bleus. Les valeurs d’absorbance à 490 nm ont été mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les résultats de l’absorbance des puits de test ont été exprimés en cellules vivantes. La concentration efficace à 50 % (EC50) a été calculée. Combinés à la cytotoxicité (CC50) des composés, les indices de sécurité (IS) ont été calculés par EC50/CC50 .

Pour l’étude TLR2/TNFα et caspase3, la concentration minimale de sécurité de la baicaline et de ses analogues a été ordonnée à 10 μg/mL. Ces composés (10 μg/mL) ont été ajoutés lorsque le milieu de culture a été échangé avec une solution de glucose et que les cellules ont été cultivées dans des conditions normales. Les cellules ont été prélevées pour l’expérience sur les protéines au moment spécifique de la reperfusion (0,5, 1, 3, 6 h) après l’ajout de la baicaline et de ses analogues. Dans le contrôle, le milieu a été utilisé comme véhicule et les cellules ont été prélevées au temps de reperfusion de 6 h.

2.5. Préparation des échantillons

Deux groupes sans médicaments ont été employés comme contrôle. Un groupe des cellules a été ensemencé dans le milieu avec le milieu de croissance normal pendant tout le processus expérimental sans privation d’oxygène-glucose. Le second groupe a été ensemencé dans le milieu avec le processus de privation d’oxygène-glucose comme contrôle modèle. A chaque point de temps, l’échantillon de cellules a été préparé de la même manière que la description précédente. Le milieu a été retiré de chaque puits, et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid (pH 7,4) et utilisées avec 100 μL de RIPA pour rassembler les protéines totales pour le Western blotting.

2.6. Western Blot

Le test Western blot pour l’expression des protéines de la β-actine, TLR2, TNFα, et Caspase3 a été référencé dans avec minimodification comme suit : échantillons chargés dans le gel (10%), a été exécuté jusqu’à ce que le marqueur (acheté à Fermentas République de Lituanie) et est allé à la fin du gel. Le transfert doit être semi-sec pendant 60 min à 12 volts et 280 mA. Ensuite, la membrane a été bloquée avec du lait à 10 % dans du PBST (1 × PBS + 0,1 % Tween20) pendant 60 min en agitant lentement à température ambiante. La membrane a été mise dans 1 mL de PBST avec un anticorps dans une dilution de 1 : 1000, incubée pendant 60 min à température ambiante sur l’agitateur, et lavée 3 fois avec du PBST après l’incubation de l’anticorps primaire. Après cela, la membrane a été incubée pendant 60 min dans du PBST avec l’anticorps secondaire à la concentration 1 : 3000. La membrane a été lavée 3 fois avec PBST à la dernière.

2.7. Détection de la capacité totale d’antioxydation

Le principe de cette expérience était de détecter le changement de couleur suite à la réduction de Fe3+ en Fe2+ par les composants réducteurs dans les échantillons. Les composants réducteurs pourraient inclure les molécules enzymatiques et non enzymatiques telles que la vitamine E antioxydante soluble dans les lipides et la vitamine C antioxydante soluble dans l’eau, la bilirubine et l’acide urique. Ensuite, la densité optique a été mesurée à 520 nm avec un lecteur de microplaques . L’échantillon cellulaire a été préparé de la même manière que dans la description précédente et prélevé au moment spécifique de la reperfusion (6 h) après l’ajout de la baicaline et de ses analogues. Le milieu a été prélevé dans chaque puits, et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid (pH 7,4). Ces cellules dans la plaque ont été résolues avec du PBS (1 mL/puits) par congélation et décongélation répétées. Le surnageant a été recueilli pour le test T-AOC après centrifugation 12 000 rpm/min.

2.8. Analyse des données

Toutes les valeurs ont été exprimées en moyenne ± S.D. Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA. Les comparaisons de Newman-Keuls ont été utilisées pour déterminer la source des différences significatives, le cas échéant. Les valeurs P inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Le logiciel de CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) a été employé pour le calcul du CC50 et du EC50.

3. Résultats

3.1. Profil de croissance des cellules

Les cellules ont été ensemencées dans les plaques du milieu avec 10% de FBS pendant 48 h. Elles ne seraient pas utilisées pour les expériences jusqu’à ce qu’elles aient bien grandi et se soient attachées les unes aux autres de manière serrée dans le plat des plaques multipuits.

3.2. Tests MTT de cytotoxicité

Afin d’examiner la cytotoxicité et de déterminer les doses sûres de la baicaline et de ses analogues, un test MTT a été réalisé sur des cellules PC12 in vitro. Sur la base des expériences, 10 μg/mL de baicaline et de wogonoside était la concentration la plus élevée en matière de sécurité sur les cellules PC12 normales, et 1 μg/mL de baicalein et de wogonin était la concentration la plus élevée en matière de sécurité sur les cellules PC12 normales (Figure 2).

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Figure 2

Cytotoxicité de la baicaline, wogonoside, baicaleine et wogonine dans les cellules PC12 normales (test MTT). Après 24 h d’incubation des cellules dans des plaques 96 puits, les produits chimiques ont été ajoutés avec le dosage de 10 mg/mL à 0,001 mg/mL. *𝑃<0,05 par rapport au contrôle normal. Les données ont été présentées en tant que moyenne ± S.D. de sept expériences indépendantes.

Dans les cellules PC12 traitées par privation d’oxygène-glucose, seulement moins de 40% des cellules ont survécu par rapport au contrôle normal (𝑃<0,05). Par rapport au contrôle modèle, la concentration minimale efficace (CME) de la baicaline et de la wogonine était de 10 μg/mL, tandis que la CME de la wogonoside et de la baicaleine était la même à 1 μg/mL. La concentration maximale efficace (MAXEC) de la baicaline et de la wogonine était la même à 1 mg/mL, ce qui implique la même innocuité de ces produits. La concentration maximale efficace du wogonoside était de 1 mg/mL, mais celle de la baicaline n’était que de 10 μg/mL. Il a été suggéré que la baicaleine était plus cytotoxique que le wogonoside. Tous ces composés n’ont pas été montrés de manière concentration-dépendante distinctement (Figure 3).

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Figure 3

Protection de la baicaline, wogonoside, baicalein, et wogonin dans les cellules PC12 avec la privation d’oxygène-glucose (OGD) (test MTT). Après 24 h d’incubation des cellules dans des plaques 96 puits et 2 h de privation d’oxygène-glucose, les composés ont été ajoutés avec le dosage de 1 mg/mL à 0,001 mg/mL. #𝑃<0,05 par rapport au contrôle normal. *𝑃<0,05 par rapport au modèle. Les données ont été présentées en tant que moyenne ± S.D. de sept expériences indépendantes.

Le CC50 de la baicaline (188,4 μg/mL ou 0,422 mmol/L) a montré de grandes différences par rapport aux trois autres composés. La baicaline a montré plus de toxicité cellulaire avec une CC50 de 8,9 μg/mL (égale à 0,0329 mmol/L). La wogonine et le wogonoside ont affiché une toxicité similaire à la CC50 10,6 μg/mL (égale à 0,0373 mmol/L) et 13,7 μg/mL (égale à 0,0298 mmol/L), respectivement. Cependant, la baicaléine a été plus efficace pour protéger les cellules contre les dommages causés par la DGO. La dose minimale efficace de baicaline était de 1 μg/mL (égale à 0,0037 mmol/L). La CE50 de la baicaline était de 1,2 μg/mL (égale à 0,0027 mmol/L), et la CE50 de la wogonine et du wogonoside était de 4.3 μg/mL (égal à 0,0151 mmol/L) et 7,4 μg/mL (égal à 0,0161 mmol/L). En comparant entre la toxicité et l’effet, les indices de sécurité des quatre composés étaient respectivement de 156 (baicaline), 8,89 (baicaleine), 2,47 (wogonine) et 1,85 (wogonoside) (tableau 1).

3.3. Effet sur les expressions de TLR2, TNFα, et Caspase3

Lors d’une blessure par OGD, les protéines de TLR2 et TNFα dans les cellules ont été exprimées distinctement ce qui signifie que l’OGD a stimulé la réaction immunitaire innée, provoquant une inflammation. La protéine caspase3 dans le modèle OGD était régulée à un certain degré, mais il n’y avait pas de valeur statistique significative (Figure 4). La baicaline a atténué l’expression protéique de TLR2 et de TNFα 3 heures après l’administration. Lorsque la baicaline a agi pendant 0,5 h, l’expression de TLR2 a montré une signification statistique, quelle que soit la comparaison avec la normale ou avec le modèle (𝑃<0,05), et l’expression de TLR2 pendant 1 h a augmenté (par rapport à la normale, 𝑃<0,05) ; cependant, son expression pendant 3 h ou 6 h n’a montré aucune différence évidente par rapport à la normale (par rapport au modèle, 𝑃<0,05). L’expression du TNFα à 0,5 h était toujours plus élevée que le contrôle (𝑃<0,05), et ses expressions à 1 h, 3 h et 6 h étaient manifestement régulées à la baisse, ce qui a montré une différence significative par rapport au niveau du modèle (𝑃<0,05). Baicalin n’a pas apparemment affecté l’expression de la protéine caspase3, qui a été montré dans la Figure 4(a).

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Figure 4

Effet des quatre analogues sur les expressions protéiques de TLR2, TNFα, et de la caspase3 dans les cellules PC12 avec une privation d’oxygène-glucose (OGD). Le niveau de protéines a été mesuré par Western blot. Le modèle signifie le traitement par privation d’oxygène-glucose. 0,5, 1, 3 et 6 heures représentent le temps du processus de reperfusion après la privation d’oxygène et de glucose. (a) représente l’effet de la baicaline ; (b) représente l’effet du wogonoside ; (c) représente l’effet de la baicaline ; (d) représente l’effet de la wogonine. La baicaline, le wogonoside et la wogonine ont été utilisés dans une concentration de 10 μg/mL, et la baicaleine a été utilisée dans une concentration de 1 μg/mL. *𝑃<0,05 par rapport au contrôle normal. #𝑃<0,05 par rapport au groupe modèle. Les données ont été présentées en tant que moyenne ± SD de trois expériences indépendantes.

Après l’ajout de wogonoside (10 μg/mL), TLR2 et TNFα étaient apparemment régulés à la baisse. L’expression de TLR2 était beaucoup plus faible que celle du modèle, même que le niveau normal (𝑃<0,05). En conséquence, l’expression du TNFα a été inhibée par le wogonoside apparemment de 0,5 h après son administration jusqu’à 6 h (𝑃<0,05). Le wogonoside n’a pas non plus montré d’effet évident sur l’expression de la caspase3 (Figure 4(b)).

Après l’administration de baicaleine, TLR2 était encore régulé à la hausse de manière significative 0,5 h et 1 h après l’ajout de baicaleine (𝑃<0,05), et il a diminué jusqu’à la normale à 3 h et 6 h. Par rapport au modèle, TNFα était régulé à la hausse à 0,5 h et a diminué progressivement par la suite. Comme TLR2, il a été exprimé jusqu’à la normale à 3 h et 6 h (Figure 4(c)).

Dans le groupe wogonine, les deux facteurs ont apparemment diminué. TLR2 a diminué à la normale après 0,5 h de l’ajout de la wogonine (par rapport au modèle, 𝑃<0,05), et il est resté à un niveau inférieur au cours de l’expérience. Aux points de temps 0,5 h et 1 h, TNFα a été exprimé plus que la normale (𝑃<0,05) mais moins que le modèle (𝑃<0,05), et à 3 h et 6 h, il s’est rapproché du niveau normal comme l’expression de TLR2 (Figure 4(d)).

Similairement aux groupes baicaline et wogonoside, l’expression de la caspase3 n’a montré aucun changement significatif dans les groupes baicaline et wogonine (Figures 4(c) et 4(d)).

3.4. Dosage de la compétence totale d’antioxydation (T-AOC)

En utilisant le kit T-AOC, nous avons constaté que la compétence d’antioxydation des cellules normales était d’environ 2,5 U/mg, et une des cellules traitées par privation d’oxygène-glucose était bien inférieure à 0,5 U/mg. Dans le groupe baicaline, la valeur de détection était de 1,8 U/ml, ce qui montre une différence significative, que ce soit par rapport aux cellules normales ou par rapport au modèle de privation d’oxygène et de glucose. Dans les groupes wogonoside, baicaline et wogonine, les valeurs étaient respectivement de 1,6, 0,8 et 0,6 U/mg, ce qui a montré une différence significative par rapport à la normale ou au modèle (Figure 5).

Figure 5

Effet de la baicaline et de ses trois analogues sur la compétence totale d’antioxydation des cellules PC12 traitées par privation d’oxygène-glucose. Modèle signifie traitement avec privation d’oxygène-glucose. La baicaline, le wogonoside et la wogonine ont été utilisés dans une concentration de 10 μg/mL, la baicaleine a été utilisée dans une concentration de 1 μg/mL. **𝑃<0,01 par rapport au contrôle normal. ##𝑃<0.01 versus groupe modèle. $$𝑃<0,01 par rapport aux groupes baicaline et wogonoside. Les données ont été présentées en tant que moyenne ± S.D. de huit expériences indépendantes.

4. Discussions

La baicaline est un composé glycosylé dérivé de la baicaleine, et elle a un groupe fonctionnel d’acide D-glucopyranosiduronique sur le site 7 de la baicaleine (Figure 1), de sorte qu’elle présentera plus de fonction biologique. La structure de base de la baicaline consiste en un benzopyranne avec trois groupes hydroxyle sur les sites 5, 6 et 7 et un groupe phényle de l’autre côté du benzopyranne (site 2). La baicaline possède également une structure énol sur le cycle benzopyranne pour maintenir la conjugaison. Les deux différences entre la baicaline et la wogonine résident dans le groupe méthoxyle sur le carbone 8 de la wogonine et le groupe hydroxyle sur le carbone 6 de la baicaline. La constitution de trois groupes hydroxyle dans la baicaline peut expliquer des caractères plus hydrophiles. De plus, le wogonoside est une forme glycosylée de la wogonine avec l’acide D-glucopyranosiduronique sur le carbone 7. Les quatre composés partagent un squelette carboné similaire avec une structure de benzopyrane et également un groupe hydroxyle sur le carbone 5 ; la baicaleine et la baicaline ont des groupes hydroxyle sur le carbone 6, alors que la wogonine et le wogonoside n’en ont pas ; la baicaleine et la wogonine ont des groupes hydroxyle sur le carbone 7, tandis que la wogonoside et la baicaline sont toutes deux glycosylées sur le groupe hydroxyle au site 7 ; enfin, la wogonine et la wogonoside ont des groupes méthoxyle sur le carbone 8, mais la baicaleine et la baicaline n’ont pas les groupes fonctionnels .

Selon le résultat de la cytotoxicité et de la neuroprotection, l’acide D-glucopyranosiduronique sur le site 7 était important pour réduire la cytotoxicité, dans lequel la baicaline était moins cytotoxique que la baicaleine et le wogonoside était moins cytotoxique que la wogonine. Le groupe méthoxyle sur le carbone 8 et le groupe hydroxyle sur le carbone 6 étaient le principal facteur influençant l’effet neuroprotecteur, par lequel l’EC50 de la baicaline et de la baicaleine était inférieur à celui du wogonoside et de la wogonine (Figure 1 et Tableau 1) après qu’ils aient été administrés.

Dans cette étude, nous avons constaté que TLR2 était fortement exprimé pendant la privation d’oxygène et de glucose (OGD) dans les cellules PC12, ce qui suggère que le récepteur était activé dans les neurones endommagés (Figure 4). TLR2 a été identifié comme un médiateur clé des réponses immunitaires et des réactions inflammatoires, et il médiait les réponses pro-inflammatoires en activant le TNFα. Le récepteur était significativement régulé à la hausse par rapport au niveau normal, ce qui indique qu’il a rejoint la lésion neuronale induite par l’AMG.

Par la littérature de recherche, TLR2 dans le système nerveux central (SNC) est réalisé comme la source directe du signal dommageable et une cible thérapeutique potentielle importante . Dans nos résultats, les expressions de TLR2 et de TNFα ont apparemment diminué quelques heures après avoir ajouté les composés. Dans le même profil, les expressions de TLR2 et TNFα avec la wogonine et le wogonoside étaient plus inhibées que celles avec la baicaline et la baicaleine. L’inhibition de l’expression a commencé à partir de 0,5 h après l’administration de wogonine et de wogonoside ; cependant, l’inhibition de l’expression de TLR2 et de TNFα est apparue plus tard, à 3 h après l’administration de baicaline et de baicalein. Par conséquent, on a réalisé que la wogonine et le wogonoside avaient une préférence pour le TLR2. Combinés avec leurs structures chimiques, tous les résultats ont impliqué que le groupe méthoxyle sur le carbone 8 dans la structure est l’hypothèse pharmacophore de l’effet de l’inhibition de TLR2, relative à l’inhibition de l’inflammation.

Conditionnant la sursuppression sur TLR2 et TNFα par ces analogues, nous avons détecté la caspase3 pour confirmer s’il existait une apoptose avec l’ajout des analogues. Par rapport à la normale, l’expression de la protéine caspase3 dans le modèle d’OGD a effectivement augmenté dans une certaine mesure, mais n’a montré aucune différence statistique. Avec l’administration des quatre analogues, le niveau de la protéine caspase3 n’a pas montré de changement évident, bien qu’il ait montré une tendance à la diminution au point de temps de 6 heures et près du contrôle normal (en comparaison avec la normale ou le modèle, 𝑃>0,05). Les résultats ci-dessus suggèrent que les cellules PC12 lésées dans le modèle OGD n’avaient pas d’apoptose apparente, et que les quatre analogues ne pouvaient pas non plus induire l’apoptose dans les cellules PC12 lésées. Selon la littérature, la baicaline a atténué les lésions d’ischémie cérébrale globale et de reperfusion chez les gerbilles par des voies antioxydantes et antiapoptotiques, et la baicaline et la wogonine peuvent toutes deux induire l’apoptose dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines et les cellules leucémiques HL-60. Par conséquent, nos résultats de l’apoptose par ces composés doivent être étudiés plus avant.

En ce qui concerne la détection T-AOC, nous avons constaté que la séquence de capacité d’antioxydation totale était baicaline et wogonoside > baicaleine et wogonine, ce qui indique qu’une forme glycosylée sur le site 2 de la baicaline et du wogonoside a joué un rôle clé dans l’antioxydation globale.

Ensemble, la baicaline et ses trois analogues ont présenté de manière globale la protection des cellules neuronales contre les dommages de l’OGD et l’inhibition de l’expression de TLR2 et du TNFα (le facteur en aval), suggérant la possibilité de ces composés utilisés dans la thérapie de l’AVC en ciblant TLR2, l’un des principaux mécanismes des dommages cérébraux. Il existe une relation structure-activité entre eux avec la sécurité, l’efficacité et la spécificité du ciblage médicamenteux de TLR2. C’est la première fois que l’on étudie la baicaline et ses analogues naturels sur les cibles moléculaires de TLR2 et du TNFα, ainsi que sur le T-AOC. Tout cela aura des avantages pour les élucider et les développer pour les nouveaux médicaments.

Contribution des auteurs

Les deux premiers auteurs ont contribué à parts égales.

Remerciements

L’auteur remercie tous les membres de son laboratoire. Cette étude a été soutenue en partie par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (30801523, 81073092), le Grand projet spécial national S&T pour la R&D de nouveaux médicaments de Chine (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, et 2011ZX09101-002-11), et la Fondation spéciale pour le laboratoire de l’Université de Tsinghua (LF 20103579).