Alcaloïdes aporphiques de Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Alcaloïdes aporphiques de Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon* ; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombie. AA 14490
ABSTRACT
Quatre alcaloïdes aporphine du bois d’Ocotea macrophylla (Lauraceae) ont été isolés et caractérisés comme (S)-3-méthoxy-nordomesticine (1), (S)-N-éthoxycarbonyl-3-méthoxy-nordomesticine (2), (S)-N-formyl-3-méthoxy-nordomesticine (3) et (S)-N-méthoxycarbonyl-3-méthoxy-nordomesticine (4) ; Les alcaloïdes 2-4 sont rapportés pour la première fois. La structure des composés isolés a été déterminée sur la base de leurs données spectrales et par comparaison de leurs données spectrales avec les valeurs décrites dans la littérature. La fraction alcaloïde et le composé 1 ont montré une activité antifongique contre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici et aussi le composé 1 a montré une activité antimicrobienne vers Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis ainsi.
Keywords : Ocotea macrophylla ; alcaloïdes aporphine ; Lauraceae.
INTRODUCTION
Le genre Ocotea (Lauraceae) comprend plus de 350 espèces présentes sur le continent américain et en Afrique australe.1,2 En Colombie, il existe 35 espèces d’Ocotea réparties dans tout le pays principalement dans les forêts andines.3 En médecine traditionnelle, certaines espèces d’Ocotea ont montré différentes applications. O. quixos est utilisé comme désinfectant, anesthésique local et anti-diarrhéique.4 O. lancifolia est utilisé comme antiparasitaire, et O. caparrapi est utilisé pour traiter les piqûres d’insectes, les morsures de serpent, les bronchites et les tumeurs cancéreuses5,6.
Chemiquement, le genre Ocotea est connu principalement comme une source de métabolites de type furofurane7 et tétrahydrofurane lignanes,8 bicyclooctane9 et benzofurane néolignanes,10 et benzylisoquinoline11 et alcaloïdes aporphine5. Dans des études antérieures, quatre alcaloïdes aporphine provenant du bois d’Ocotea macrophylla ont été isolés et identifiés comme étant la nanténine, la glaucine, l’isocorydine et la déhydronanténine12,13. Dans cet article, nous décrivons l’isolement et la détermination structurelle de trois nouveaux alcaloïdes aporphine 2-4 en plus de la (S)- 3-méthoxy-nordomesticine 1 et les rapports des activités antibactériennes et antifongiques des composés.
RESULTAT ET DISCUSSION
L’extrait éthanolique de la tige de O. macrophylla a été soumis à une extraction acide-base pour obtenir une fraction alcaloïde, qui a ensuite été soumise à un fractionnement et une purification par des méthodes chromatographiques conduisant à l’isolement de quatre alcaloïdes : (S)-3-méthoxy-nordomesticine (1), (S)-N-éthoxycarbonyl-3-méthoxy-nordomesticine (2), (S)-N-formyl-3-méthoxy-nordomesticine (3) et (S)-N-méthoxycarbonyl-3-méthoxy-nordomesticine (4). Les structures des alcaloïdes 1-4 sont présentées dans la figure 1 et les données spectroscopiques dans le tableau 1.
Le signal à δH 6,30 (1H, s) n’a montré aucune connectivité dans l’expérience HMQC, indiquant la présence d’un groupe OH phénolique, soutenu par IR. L’analyse du spectre HMBC a permis la localisation des substituants, selon les corrélations observées entre les signaux à δH 5.94 et 5.95 (pour le groupe méthylènedioxy) avec les signaux à δC 145.9 (C-9) et 146.2 (C-10), et ces deux derniers signaux avec les protons à δH 6.70 (H-8) et 7.90 (H-11), respectivement, suggérant la présence d’un groupe méthylènedioxy aux positions 9 et 10 et de deux hydrogènes sur le cycle aromatique en orientation para. La présence du groupe hydroxyle en position 1, a été déterminée en utilisant les corrélations entre les signaux à δH 6,30 et δC 116,5, attribués à C-11b. L’emplacement des groupes méthoxyles en positions C-2 et C-3, a été attribué selon la corrélation des hydrogènes à δH 3,96 et 3,86 avec les carbones à δC 138,4 (C-2) et δC 147,8 (C-3), respectivement.
La configuration absolue de C-6a a été attribuée comme S, car elle a un effet Cotton négatif à 280 nm et un effet Cotton positif à 240 nm dans la courbe CD17. De plus, ceci a été confirmé par la valeur positive de la rotation optique 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Par conséquent, l’alcaloïde 1 a été déterminé comme étant la (S)-3-méthoxy-nordomesticine, un alcaloïde aporphine rapporté précédemment de Nectandra sinuata19 appartenant également à la famille des Lauraceae. Ce rapport corrige et complète les données spectroscopiques de ce composé.
L’alcaloïde 2 a été obtenu sous forme d’une huile jaune qui donne une réaction positive au réactif de Dragendorff et sa valeur de rotation optique était 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). Les spectres UV et IR de 2 étaient similaires à ceux de 1, à l’exception de l’apparition, dans les deux spectres, d’absorptions dues à un groupe carbamate à 282 nm et à 1688 cm-1, respectivement.20 Les spectres RMN 1H et 13C ont montré un profil similaire à celui de 1. Dans le RMN 1H, deux nouveaux signaux sont apparus à δH 4,29 (2H, m) et 1,29 (3H, m), ainsi que le déplacement du signal H-5, dû à la présence d’un groupe déprotecteur à proximité. L’expérience COSY a montré la corrélation des signaux δH 4.29 et 1.29, ce qui indique la présence d’un groupe éthyle qui, en raison de son déplacement, suggère d’être attaché à un hétéroatome. Les spectres RMN 13C et DEPT ont montré l’apparition de trois nouveaux signaux à δC 158.8 (C), 61.0 (CH2), et 14.8 (CH3), signaux typiques d’un groupe éthoxycarbonyle attaché à un atome d’azote. La configuration absolue de C-6a a été déterminée comme étant S, car il a montré les mêmes effets de Cotton que 1. Par conséquent, le composé alcaloïde 2 a été identifié comme étant (S)-N-éthoxycarbonyl-3-méthoxy-nordomesticine. Son spectre ESIMS a donné un pic d’ion pseudomoléculaire à m/z 414 + correspondant à la formule moléculaire de C22H22NO7, et les fragmentations étaient dues à la perte de CH3OH et CH3CH2OH à m/z 382 + et m/z 368 +, respectivement. Le spectre ESI en mode d’ions négatifs a montré des pics à m/z 412 – et m/z 383 -, le dernier étant la perte d’un groupe éthyle. Ce type d’alcaloïdes avec des substituants N-éthoxycarbonyle ont été isolés de Lindera angustifolia (Lauraceae).21
L’alcaloïde 3, a été obtenu comme une huile jaune, avec une valeur de rotation optique de 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). Le spectre IR était similaire à celui des alcaloïdes 1 et 2. De plus, on a observé la présence d’absorptions à 2830, 2700, 1739 cm-1, caractéristiques du groupe formyle. Dans le mode négatif de l’HRESIMS, on a observé l’ion pseudo-moléculaire – à m/z 369.1133, correspondant à la formule moléculaire de C20H20NO6. Le mode ion négatif des spectres ESI-MS a montré la perte d’un groupe formyle à m/z 339 … Le profil RMN était similaire à celui des alcaloïdes 1 et 2. Dans la RMN 1H sont apparus différents signaux appartenant à un mélange de deux isomères dans un rapport 3:1. La comparaison de l’isomère principal avec l’alcaloïde 1 en RMN, a montré le même modèle de substitution du cycle aromatique, en plus de l’apparition de deux nouveaux signaux à δH 8,25 (1H, s) dans le 1H et à δC 161,9 dans le 13C du groupe formyle de 3. Cette fonctionnalité sur l’azote a conduit à la formation d’isomères rotationnels, qui ont été décrits précédemment pour les alcaloïdes avec un groupe N-formyle et N-acétyle.22 La configuration absolue a été déterminée comme S, de la même manière que pour 1 et 2. Par conséquent, cet alcaloïde 3 a été identifié comme étant la (S)-N-formyl-3-méthoxy-nordomesticine.
L’alcaloïde 4 a été obtenu sous forme de solide blanc avec un point de fusion de 222-223 ºC (MeOH), et avec une rotation optique de 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). L’analyse des données RMN de 4 a révélé qu’il a le même squelette de base que 2, mais qu’il a un ester méthylique selon les signaux à δH 3,76 (3H, s) et δC 52,6 pour 4 à la place des signaux pour le groupe éthyle dans 2. HRESIMS a montré un ion pseudomoléculaire – à m/z 398,1233 correspondant à la formule moléculaire C22H22NO7. Par conséquent, l’alcaloïde 4 a été identifié comme (S)-N-méthoxycarbonyl-3-méthoxy-nordomesticine.
L’activité antifongique a été évaluée par la méthode de diffusion de disque contre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 un champignon phytopathogène qui affecte les cultures de tomates, causant des pertes énormes pour les agriculteurs. La fraction alcaloïde était active contre F. oxysporum à 250 μg/μL. L’activité inhibitrice contre la croissance des champignons était modérée à 5 μg/μL pour la (S)-3-méthoxy-nordomesticine 1, tandis que les autres alcaloïdes étaient inefficaces, ce qui suggère que la présence de substituants attracteurs d’électrons sur l’atome d’azote diminue l’activité antifongique.
Bien que peu de rapports d’évaluation de l’activité antifongique des aporphines, il a été constaté que celles-ci sont actives contre des espèces telles que Candida albicans,24,25 mais inactives contre des champignons pathogènes comme Cladosporium herbarium.26 Ces résultats sont un nouveau rapport d’évaluation de l’activité antifongique de ces alcaloïdes, où il est souligné que le type de substituants sur l’azote des aporphines a un effet sur l’activité antifongique qu’ils présentent.
L’activité antibactérienne a été évaluée par la méthode de diffusion radiale rapportée par Lerhrer27 contre deux souches standard Gram (+) : Staphylococcus aureus 6538 et Enterococcus faecalis 29212 et trois Gram (-) : Escherichia coli 25922 et Salmonella tiphymurium, souches MS7953 et 14028s. L’alcaloïde 1 (2,5 μg) a montré une activité antimicrobienne contre les deux bactéries Gram positif évaluées avec des valeurs de 30 UA comme indiqué dans le tableau 2.
Il a été rapporté pour le mélange racémique du composé 3-méthoxy-nordomesticine, son activité contre E. coli (MIC= 256 μg/mL) et S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 cependant dans ce cas le composé 1 n’est pas actif contre E. coli.
De façon similaire à l’activité antifongique, les résultats montrent que la nature du substituant sur l’azote influence l’activité antibactérienne (tableau 2).
EXPERIMENTAL
Procédures générales
Le point de fusion a été déterminé en utilisant Mel-temp Fisher Johns, dispositif de laboratoire. Les spectres UV ont été enregistrés sur un Perkin Elmer Lambda 2S et les spectres CD sur un spectromètre JASCO J-720. Les spectres IR ont été obtenus sur un Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 comme un film mince. Les rotations optiques ont été enregistrées sur un polarimètre Schmidt-Haensch. Les spectres RMN 1H (400 MHz) et 13C (100 MHz), ainsi que les spectres 2D (COSY, HMQC et HMBC) ont été réalisés sur un spectromètre Bruker Avance 400 MHz en utilisant le CDCl3 comme référence interne. Les HRMS ont été déterminés sur un système de spectromètre de masse Shimadzu LCMS-IT-TOF avec ESI en mode ion positif et en mode ion négatif. La chromatographie sur colonne (CC) a été réalisée avec du gel de silice (70-230 et 230-400 mesh, Merck), et la chromatographie analytique a été réalisée avec du gel de silice 60 PF254 (0,25 mm).
Matériel végétal
Les tiges de O. macrophylla ont été collectées en juillet 2006 à Nocaima, en Colombie, par W. Delgado. Le spécimen botanique a été identifié par A. Jara, et un spécimen de référence (COL-517191), et a été déposé à l’Herbier national colombien de l’Université nationale de Colombie, Bogota, Colombie.
Extraction et isolement
Des tiges séchées et alimentées (2,0 kg) d’Ocotea macrophylla ont été extraites avec de l’EtOH par macération à température ambiante et concentrées sous vide pour obtenir un extrait (102,6 g). Un échantillon (48,9 g) de cet extrait a été solubilisé dans l’eau à l’aide d’ultrasons et acidifié avec du HCl à 5% jusqu’à pH 2,0. La suspension acide a ensuite été filtrée et basifiée avec du NaOH à 20 % jusqu’à pH 8,0, puis extraite successivement avec du chloroforme. La fraction chloroforme (3,01 g) a été soumise à une chromatographie sur colonne avec du gel de silice et éluée avec un gradient d’éther de pétrole:AcOiPr (4:6 à 0:10) et AcOiPr:MeOH (10:0 à 0:10), obtenant quatre fractions (I-IV). La fraction I (347 mg) a été chromatographiée de manière répétitive par colonne (CC) sur gel de silice et éluée avec n-hexane:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3, et Tol:AcOiPr 7:3. On a obtenu les alcaloïdes 1 (7 mg) et 2 (4 mg). La fraction II (250 mg) a été soumise à une chromatographie sur colonne sur gel de silice et éluée avec CHCl3:AcOEt (85:15), puis soumise à une CC sur Sephadex LH-20 (CH3OH) pour donner l’alcaloïde 3 (8 mg). La fraction IV (1433 mg) a été purifiée par chromatographie sur colonne répétitive sur gel de silice en utilisant CH2Cl2:MeOH 97:3 et CH2Cl2 comme systèmes d’élution. Enfin, des lavages successifs avec du MeOH ont donné l’alcaloïde 4 (98 mg).
Dosage antifongique
F. oxysporum a été obtenu à partir de la collection de cultures de l’Université de Cundinamarca (Département d’agronomie, Laboratoire de phytopathologie). Le PDA a été utilisé comme milieu pour les essais d’activité antifongique. Le milieu de culture a été inoculé avec 100 μL d’une solution de 105 spores. Les échantillons ont été préparés dans des solutions de différentes concentrations, correspondant à 50, 25 et 10 μg/μL de la fraction alcaloïde et à 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 et 0,1 μg/μL des alcaloïdes purs. Dix microlitres d’échantillons ont été appliqués sur les disques de papier filtre et placés sur le milieu inoculé. Les plaques ont été scellées et laissées dans un incubateur pendant 3 jours à 25 °C. Des zones claires apparaissant contre un champignon en croissance ont indiqué la quantité minimale de fraction ou d’alcaloïde nécessaire pour inhiber la croissance du champignon. Trois répétitions ont été faites pour chaque traitement. Le bénomyl (benzimidazole – 5 μg) a été utilisé comme contrôle positif, et l’acétone a servi de contrôle négatif.23
Dossiers antibactériens
L’activité antibactérienne a été évaluée par la méthode de diffusion radiale adaptée à la méthodologie précédemment publiée par Lehrer.27 Les composés ont été évalués contre deux souches Gram (+) : Staphylococcus aureus ATCC 6538 et Streptococcus fecalis ATCC 29212 et trois souches Gram (-) : Escherichia coli ATCC 25922 et Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s et Salmonella tiphymurium MS7953. Une colonie isolée de chaque souche, a été déposée dans 3 mL de trypticase de soja (TSB) pour les souches Gram (+) et de bouillon de Luria (LB) pour les souches Gram (-), et ont été incubées à 37 °C sous agitation, jusqu’à ce que les micro-organismes soient en phase logarithmique. Le surnageant a été éliminé et le sédiment obtenu a été remis en suspension dans du tampon phosphate (PBS), suivi de lavages avec du PBS et d’une centrifugation. Enfin, le sédiment a été remis en suspension dans du PBS et la densité optique déterminée à 620 nm pour calculer le nombre d’UFC (unités formatrices de colonies) par millilitre. On disperse un certain volume qui contient 4 x 107 UFC dans chaque plat. Le volume mesuré a été mélangé et homogénéisé dans 15 mL d’agarose fondu à plus ou moins 45 °C. Cette suspension bactérienne a été servie dans des boîtes de Pétri et laissée se solidifier à température ambiante, après quoi ont été réalisés des trous de 2 mm de diamètre avec un poinçon stérile.
Les échantillons d’essai ont été préparés en dissolvant 1 mg du composé pur dans 500 μL de DMSO, qui sont placés 8 μL de l’échantillon en double et incubés à 37 °C pendant 30 min. Après ce temps, le milieu nutritif a été ajouté, qui contient de l’agar agar fondu et TSB, incubé pendant 18 h à 37 ºC et ensuite le diamètre des zones d’inhibition a été mesuré par l’activité du composé. Les contrôles positifs utilisés étaient différents antibiotiques, Ampicilline (50 mg/mL), Kanamycine (10 mg/mL) et Tetracycline (4,12 mg/mL) à une dilution 1:100 dans PBS et a été utilisé comme contrôles négatifs DMSO et PBS, chaque contrôle 8 μL être servi par chaque puits. Les diamètres des zones d’inhibition ont été mesurés en millimètres et les résultats ont été rapportés en unités d’activité selon le ratio qui stipule qu’une unité d’action (UA) est égale à 0,1 mm de la zone d’inhibition.
Matériel complémentaire
ACCUEILS
Les auteurs tiennent à remercier l’Université nationale de Colombie pour son soutien financier à ce projet. Ils remercient également le laboratoire de résonance magnétique nucléaire et le laboratoire de spectrométrie de masse pour leur soutien dans l’enregistrement des spectres de RMN et de la HR-ESI-MS, respectivement. En outre, les auteurs tiennent à remercier l’Université Javeriana pour les rotations optiques, la FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) pour l’enregistrement des spectres CD et surtout au Prof. J. M. Lozano par des essais d’activité antibactérienne.
1. Takaku, S. ; Haber. W. ; Setzer, W. ; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.
2. Guerrini, A. ; Sacchetti, G. ; Muzzolli, M. ; Moreno, G. ; Medici, A. ; Besco, E. ; Bruni R. ; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.
4. Ballabeni, V. ; Tognoli, M. ; Bertoni, S. ; Bruni, R. ; Guerrini, A. ; Moreno, G. ; Barocelli, E. ; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.
5. Fournet, A. ; Ferreira, M. ; Rojas, A. ; Guy, I. ; Guinaudeau, H. ; Heinzen, H. ; Fitoterapia. 2007, 78, 382.
6. Palomino, E. ; Maldonado, C. ; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.
7. Marques, R. ; Batistuzzo, S. ; Silva, C. ; Barbosa, J. ; Fassarella, L. ; Mutat. Res. 2003, 536, 117.
8. López, H. ; Valera, A. ; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.
9. Zschocke, S. ; Staden, J. ; Paulus, K. ; Bauer, R. ; Horn, M. ; Munro. O. ; Brown N. ; Drewes, S. ; Phytochemistry 2000, 54, 591.
10. Lordello, A. ; Yoshida, M. ; Phytochemistry 1997, 46, 741.
11. Silva, I. ; Barbosa, J. ; Silva, M. ; Lacerda C. da-Cunha, E. ; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.
12. Franca, N. ; Giesbrecht, A. ; Gottlieb, O. ; Malgalhaes, A. ; Malgalhaes, E. ; Maia, J. ; Phytochemistry 1975, 14, 1671.
13. Warrumby, S. ; Lordello, A. ; Quim. Nova 2007, 30, 92.
14. Wu, Y. ; Chao, Y. ; Chang, F. ; Chen, Y. ; Phytochemistry 1996, 46, 181.
15. Mathouet, H. ; Elomri, A. ; Lameiras, P. ; Daich, A. ; Vérité, P. ; Phytochemistry 2007, 68, 1813.
16. Tantisewie, B. ; Pharadai, T. ; Pandhuganont, M. ; Guinaudeau, H. ; Freyer, A. ; Shamma, M. ; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.
17. Ringdahl, B. ; Chan, R. ; Craig, J. ; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.
18. Nishiyama, Y. ; Moriyasu, M. ; Ichimaru, M. ; Iwasa, K. ; Kato, A. ; Mathenge, S. ; Chalo, P. ; Juma, F. ; Phytochemistry 2006, 67, 2671.
19. Castro, O. ; Hasbun, C. ; Calderon, M. ; Fitoterapia 1991, 62, 72.
20. Chen, Y. ; Chang, F. ; Wu, Y. ; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.
21. Zhao, O. ; Zhao, Y. ; Wang, K. ; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.
22. Chang, F. ; Wei, J. ; Teng, C. ; Wu. Y. ; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.
23. Gomez, Y. ; Gil, K. ; González, E. ; Farías, L. ; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.
24. Kuo, R. ; Chang, F. ; Chen, C. ; Teng, C. ; Yen, H. ; Wu. Y. ; Phytochemistry 2001, 57, 421.
25. Agnihotri, V. ; ElSohly, H. ; Khan, S. ; Jacob, M. ; Joshi, V. ; Smillie, T. ; Khan, I. ; Walker, L. ; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.
26. Ma, W. ; Fukuski, Y. ; Tahara, S. ; Osawa, T. ; Phytotherapy 2000, 71, 527.
27. Lerhrer R. ; Rosenman, M. ; Harwig. S. ; Jackson, R. ; Eisenhaver, P. ; J. Inmunol. Méthodes. 1991, 137, 167.
28. Nimgirawath, S. ; Udomputtimekakul, P. ; Taechowisan, T. ; Wanbanjob, A. ; Shen Y. ; Chem. Pharm. Bull. 2009, 57,
Reçu le 26/6/09 ; accepté le 6/11/09 ; publié sur le web le 10/3/10
* courriel : [email protected]
MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE
.
