Amélioration de la fermentation du L-arabinose en modifiant la voie métabolique et le transport dans Saccharomyces cerevisiae

Abstract

La voie d’utilisation du L-arabinose a été établie dans Saccharomyces cerevisiae, en exprimant les gènes codon-optimisés araA, araB, et araD de Lactobacillus plantarum. Après la surexpression des gènes TAL1, TKL1, RPE1, RKI1 et GAL2 et une évolution adaptative, l’utilisation du L-arabinose de la souche recombinante est devenue efficace. La souche résultante a affiché une vitesse de croissance spécifique maximale de 0,075 h-1, une vitesse de consommation spécifique maximale de L-arabinose de 0,61 g h-1 g-1 de poids cellulaire sec, et un rendement prometteur en éthanol de 0,43 g-1 à partir de la fermentation du L-arabinose.

1. Introduction

Pour réduire la dépendance aux combustibles fossiles, la production mondiale de bioéthanol a été augmentée de ~45 millions de litres en 2005 à ~113 milliards de litres en 2012 . La future production à grande échelle d’éthanol carburant sera très probablement basée sur des matériaux lignocellulosiques abondants au lieu du sucre et des céréales, qui sont des aliments pour les humains et les animaux . La production rentable d’éthanol carburant à partir de matières lignocellulosiques nécessite l’utilisation complète des matières premières. L’un des objectifs de la production de bioéthanol est de doter le micro-organisme de fermentation de la capacité de convertir tous les sucres des matières lignocellulosiques. Environ 3-15% du composant L-arabinose peut être récupéré à partir des matériaux lignocellulosiques. Il est donc nécessaire de construire un microorganisme fermentant le L-arabinose pour augmenter l’utilisation de ce sucre .

Deux types de voies métaboliques du L-arabinose existent chez les champignons et les bactéries. L’aldose réductase (AR), la L-arabitol-4-déhydrogénase (LAD), la L-xylulose réductase (LXR) et la D-xylitol déshydrogénase (XDH) constituent la voie métabolique du L-arabinose fongique. La réaction catalysée par l’AR et la LXR est couplée à l’oxydation du NADPH en NADP+, et la LAD et la XDH utilisent le NAD+ comme cofacteur . Le xylulose produit est phosphorylé et entre dans la voie du pentose-phosphate (PPP). La voie métabolique bactérienne du L-arabinose est indépendante des cofacteurs et comprend la L-arabinose isomérase (AraA), la L-ribulokinase (AraB) et la L-ribulose-5-phosphate 4-épimérase (AraD). Le D-xylulose-5-phosphate produit entre dans la PPP . Les deux voies métaboliques du L-arabinose ont été établies dans Saccharomyces cerevisiae, qui est le micro-organisme traditionnel de production d’éthanol avec une excellente capacité de fermentation des sucres et une tolérance à l’environnement difficile, mais il ne peut pas fermenter le L-arabinose . Il n’est pas surprenant qu’un déséquilibre redox se produise dans la souche recombinante de S. cerevisiae contenant la voie métabolique fongique du L-arabinose. Le rendement du sous-produit L-arabitol était aussi élevé que 0,48 g-1 de sucre pentose consommé dans la cofermentation du D-xylose et du L-arabinose, bien que la souche exprimant le NADH ait préféré AR et LXR pour diminuer le déséquilibre redox .

Par rapport à la voie métabolique du L-arabinose fongique, la voie bactérienne est plus simple et indépendante des cofacteurs. Cependant, en raison du manque de tests d’activité efficaces pour les enzymes impliquées dans la voie métabolique bactérienne du L-arabinose, l’optimisation de cette voie dans S. cerevisiae n’a pas été simple. La souche de S. cerevisiae exprimant les gènes araA, araB et araD d’Escherichia coli ne pouvait pas utiliser le L-arabinose. Cependant, après avoir remplacé le gène de la L-arabinose isomérase d’E. coli par le gène araA cloné à partir de Bacillus subtilis, la souche a pu croître et produire de l’éthanol sur L-arabinose après plusieurs cycles de croissance adaptative. En outre, l’utilisation du L-arabinose a été améliorée en changeant l’utilisation des codons des gènes bactériens araA, araB et araD par les codons préférés de la levure. Les gènes du métabolisme du L-arabinose de Lactobacillus plantarum correspondent plus étroitement à l’utilisation des codons de S. cerevisiae que les gènes rapportés précédemment. Wisselink et al. ont introduit des copies multiples de araA et araD et une copie unique de araB de L. plantarum dans S. cerevisiae. Après la surexpression des gènes codant pour les enzymes de la PPP non oxydative et une évolution adaptative importante, la souche résultante a présenté un rendement élevé en éthanol, jusqu’à 0,43 g g-1, lors d’une croissance anaérobie sur L-arabinose, avec un taux élevé de consommation d’arabinose (0,70 g h-1 g-1 de poids cellulaire sec (PCS)). L’analyse du métabolome, du transcriptome et des flux métaboliques d’une souche plus évoluée a révélé que des niveaux d’expression plus élevés des isoenzymes du transporteur de galactose, de la transcétolase et de la transaldolase profitent à la croissance de S. cerevisiae sur L-arabinose .

Dans le présent travail, les gènes uniques codon-optimisés araA, araB et araD de L. plantarum ont été exprimés dans la souche CEN.PK102-3A de S. cerevisiae à différents niveaux. Ensuite, les gènes TAL1, TKL1, RPE1 et RKI1 impliqués dans la PPP ont été surexprimés dans cette souche recombinante. La souche résultante a été sélectionnée séquentiellement sur L-arabinose en conditions aérobies et en conditions limitées en oxygène. Une souche avec une capacité d’utilisation du L-arabinose significativement améliorée a été obtenue. La capacité métabolique du L-arabinose des souches évoluées et de la souche qui surexprime également le gène transporteur GAL2 a été étudiée. Les facteurs affectant l’efficacité du métabolisme du L-arabinose sont discutés.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Milieux et conditions de culture

Le milieu complet synthétique (SC) de levure contenant 1,7 g L-1 de base d’azote de levure (YNB, Sangon, Chine) et 5 g L-1 de sulfate d’ammonium (Sangon, Chine), avec des sources de carbone supplémentaires de glucose (Sangon, Chine) ou de L-arabinose (Sinopharm, Chine), a été utilisé pour la culture de levure. Le mélange complet de suppléments, 0,77 g L-1 CSM-URA ou 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), a été ajouté pour maintenir les plasmides requis avec une sélection auxotrophe si nécessaire. Pour les souches avec le marqueur KanMX4, le milieu a été fourni avec 200 g mL-1 de l’antibiotique G418 sulfate (Promega, Madison, WI, USA). Toutes les levures ont été cultivées à 30°C.

2.2. Analyse de l’indice d’adaptation des codons

L’indice d’adaptation des codons (CAI) est utilisé pour illustrer la préférence de l’utilisation des codons dans des espèces spécifiques . Pour l’analyse de l’ICA, CODONW (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw) a été utilisé.

2.3. Construction de plasmides et de souches

E. coli DH5 a été utilisé pour le sous-clonage. Les souches de S. cerevisiae et les plasmides utilisés dans cette étude sont énumérés dans le tableau 1. Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2.

Les gènes uniques codon-optimisés araA, araB et araD codant la L-arabinose isomérase (GenBank : CCC80517.1), la L-ribulokinase (GenBank : CCC80519.1) et la L-ribulose-5-phosphate 4-épimérase (GenBank : CCC80518.1) de L. Plantarum ont été synthétisés artificiellement et ligaturés entre les séquences du promoteur HXT7 et du terminateur PGK1 du plasmide pHX, qui a été construit en substituant la PGK1p du plasmide YEp24-PGKp par la HXT7p, contenant des sites pour les enzymes de restriction Kpn I et Sma I. Le fragment HXT7p-araD-PGK1t a été amplifié par PCR avec des sites terminaux pour les enzymes de restriction Hind III et Bln I, puis inséré dans les sites Hind III et Nhe I de YIp5, ce qui a donné le plasmide YIp5-araD. Le fragment HXT7p-araA-PGK1t contenant les sites terminaux Bgl II et Sal I a été inséré dans les sites BamH I et Sal I de YIp5-araD, ce qui a donné le plasmide YIp5-araAD. Le fragment HXT7p-araB-PGK1t avec les sites Eag I et Stu I a été inséré dans les sites Eag I et Stu I de YIp5-araAD, ce qui a donné le plasmide YIp5-ara (Figure 1(a)). Le fragment promoteur de TEF1 (avec des sites terminaux pour Hind III et Sal I) et le fragment terminateur de PGK1 (avec des sites terminaux pour BamH I et Hind III) ont été clonés à partir des plasmides pJFE3 et pYMIKP, respectivement. Ces deux fragments ont été ligaturés et insérés dans le plasmide pYX242 pour construire un vecteur, pYX242-WS, avec deux sites qui peuvent être utilisés pour exprimer des gènes. Ensuite, le gène araA a été inséré entre les sites Sal I et Sac I de ce vecteur sous le contrôle du promoteur TEF1 et du terminateur PloyA pour son expression, et le plasmide résultant a été nommé pYX2422-TEF1araA (Figure 1(b)). Le plasmide pYX2422-HXT7araA (Figure 1(b)) a été construit en utilisant le fragment de HXT7p pour déplacer le fragment TEF1p du plasmide pYX2422-TEF1araA ; les joints étaient des séquences de reconnaissance BamH I et Sal I. Le gène GAL2 a été cloné à partir de l’ADN chromosomique de CEN.PK102-3A, puis inséré dans les sites Xba I et Sal I du plasmide pJFE3, ce qui a donné le plasmide pJFE3-GAL2. Le fragment URA3 du plasmide pJFE3-GAL2 entre les sites Nde I et Apa I a été remplacé par le gène KanMX4 cloné à partir de pUG6 , ce qui a donné le plasmide pJFE318-GAL2 (Figure 1(c)).

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Figure 1

Les cartes physiques des plasmides (a) YIp5-ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA, et (c) pJFE318-GAL2.

La transformation de la levure a été réalisée par la méthode de transformation à l’acétate de lithium . Le plasmide YIp5-ara a été linéarisé au niveau du site Stu I, puis transformé en CEN.PK102-3A. Les transformants avec les gènes araA, araB, et araD intégrés dans le gène chromosomique URA3 ont été sélectionnés dans un milieu SC contenant CSM-URA, et après avoir été confirmé par séquençage, le transformant souhaité a été nommé BSW1A1. Les plasmides pYX242, pYX2422-HXT7araA, et pYX2422-TEF1araA ont été transformés dans BSW1A1, ce qui a donné BSW1AY, BSW1A7, et BSW1AT, respectivement. Le pJPPP3 linéarisé, qui contient les cadres d’expression des gènes TAL1, TKL1, RPE1 et RKI1, a été intégré dans le chromosome de BSW1AT au locus du gène GRE3, ce qui a donné la souche BSW2AP. La souche BSW2AP a été adaptée sur 20 g L-1 L-arabinose en conditions aérobies puis en conditions limitées en oxygène. Une fois la phase stationnaire atteinte, un nouveau lot a été initié en transférant la culture dans un milieu frais avec une biomasse initiale de 0,15 g DCW L-1. Lorsque le temps de doublement de la souche s’est stabilisé, le mutant BSW3AP a été sélectionné parmi les mutants adaptés en raison de son excellente croissance sur L-arabinose. Le plasmide pJFE318-GAL2 a ensuite été transformé dans la souche BSW3AP, ce qui a donné la souche BSW3AG.

2.4. PCR quantitative en temps réel

Les cellules ont été cultivées dans un milieu SC contenant 20 g L-1 de glucose et recueillies lorsque la DO600 des cultures atteignait 1. L’ARN total a été extrait à l’aide du réactif TRIzol (Sangon, Chine). Le premier brin d’ADNc a été transcrit de manière inverse à partir de 1 g d’ARN total en utilisant les kits de réactifs PrimeScript RT avec gDNA Eraser (Takara, Japon). Les produits d’ADNc dilués ont été utilisés pour la PCR quantitative en temps réel à l’aide du SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japon) et du LightCycle PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Allemagne). Le gène codant pour l’actine ACT1 a été utilisé comme gène de référence pour la normalisation. Les données de la PCR en temps réel ont été calculées selon la méthode . Les amorces pour ces PCR ont été énumérées dans le tableau 2.

2.5. Fermentation

Une seule colonie a été cultivée pendant la nuit dans un milieu SC contenant 20 g L-1 de glucose. Un échantillon de la culture de nuit a été dilué jusqu’à une OD600 initiale de 0,5 dans un milieu SC contenant 10 g L-1 de glucose et 10 g L-1 de L-arabinose. Après 10 h de culture, les cellules ont été recueillies et utilisées pour la fermentation. Toutes les fermentations en flacon secoueur ont été réalisées à 30°C, 200 r min-1, dans des flacons secoueurs de 200 mL contenant 40 mL de milieu. Les conditions de limitation de l’oxygène ont été maintenues à l’aide d’un bouchon en caoutchouc. Les fermentations en lots dans des conditions anaérobies ont été réalisées dans des fermenteurs de 1,4 L (Infors AG, Suisse) avec un volume de travail de 900 mL. Les conditions anaérobies ont été maintenues par barbotage avec de l’azote (0,1 L min-1) ; le taux d’agitation était de 500 r min-1. Le pH a été maintenu à 5,0 en pompant automatiquement 1 mol L-1 de NaOH et 1 mol L-1 de H3PO4 . La biomasse initiale était de 0,2 g de DCW L-1. La source de carbone dans le milieu SC plus CSM-LEU-URA était 20 g L-1 de L-arabinose ; 200 g mL-1 de G418 ont été fournis dans la fermentation de la souche BSW3AG. Le poids sec des cellules des souches évoluées et des souches non évoluées a été calculé selon la formule du poids sec (mg mL-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 et du poids sec (mg mL-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149, respectivement.

2.6. Analyse des produits de fermentation

La chromatographie liquide haute performance (CLHP) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japon) équipée du détecteur d’indice de réfraction RID-10A (Shimadzu, Japon) a été utilisée pour déterminer les concentrations de sucres et de métabolites. La colonne échangeuse d’ions Aminex HPX-87P (Bio-Rad, USA) a été utilisée pour analyser le L-arabinose, l’arabitol et l’éthanol à 80°C avec une phase mobile d’eau à un débit de 0,6 mL min-1. La colonne échangeuse d’ions Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, USA) a été utilisée pour analyser le glycérol et l’acétate à 45°C en utilisant 5 mmol L-1 H2SO4 comme phase mobile .

3. Résultats

3.1. Expression des gènes optimisés par codon impliqués dans la voie du L-Arabinose dans S. cerevisiae

Sur la base de la séquence d’acides aminés de la L-arabinose isomérase (n° d’accession GenBank CCC80517.1), de la L-ribulokinase (n° d’accession GenBank CCC80519.1), et L-ribulose-5-phosphate 4-épimérase (GenBank accession no. CCC80518.1) enregistrés dans le National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), les gènes araA, araB, et araD de L. plantarum ont été synthétisés artificiellement en utilisant les codons préférés de S. cerevisiae. Les ICA de l’araA, de l’araB et de l’araD optimisés par codons étaient respectivement de 0,599, 0,580 et 0,646, ce qui était supérieur à ceux des séquences natives (0,324, 0,223 et 0,243, respectivement).

Les cassettes d’expression de l’araA, de l’araB et de l’araD optimisées au niveau du codon ont été intégrées dans le chromosome de la souche CEN.PK102-3A, ce qui a donné la souche BSW1A1. Cependant, BSW1A1 ne pouvait pas croître sur L-arabinose, bien que les ARNm transcrits de ces gènes étaient tous détectables. Ensuite, d’autres copies de araA ont été introduites dans BSW1A1, portées par le plasmide épisomal pYX242 et exprimées sous le contrôle des promoteurs HXT7 et TEF1. Les niveaux de transcription de l’araA dans les souches résultantes, BSW1A7 et BSW1AT, ont été multipliés par deux et par trois par rapport à la souche de référence BSW1AY portant uniquement l’araA intégré et exprimé. Les souches BSW1A7 et BSW1AT ont été incubées en aérobiose sur L-arabinose, et la croissance de la souche BSW1AT a été observée après ~150 h, alors que BSW1A7 n’a pas pu croître même en étant cultivée plus longtemps.

3.2. Amélioration de l’utilisation du L-Arabinose chez S. cerevisiae par ingénierie et évolution

Les gènes TAL1, TKL1, RPE1, et RKI1 impliqués dans la voie non oxydative du pentose phosphate ont été surexprimés dans une seule colonie isolée de la culture BSW1AT 150 h en intégrant le plasmide linéarisé pJPPP3 dans le chromosome. La souche résultante, BSW2AP, a évolué sur L-arabinose. Après 9 transferts en conditions aérobies et 12 transferts en conditions limitées en oxygène, le temps de doublement de la culture a diminué de 22 h à 4,5 h. Les mutants ont été criblés sur des plaques de L-arabinose, et une grande colonie a été sélectionnée et nommée BSW3AP.

Les niveaux transcriptionnels des gènes dans les souches recombinantes BSW1AT, BSW2AP et BSW3AP ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel (figure 2). Le niveau d’expression de l’araA dans la souche BSW2AP était 2 fois plus élevé que dans la souche BSW1AT, tandis que les niveaux d’expression de l’araB et de l’araD dans la souche BSW2AP étaient plus faibles. Ces changements pourraient être dus à des mutations qui se sont produites pendant la culture de BSW1AT sur L-arabinose. Dans la souche évoluée BSW3AP, les trois gènes ont été exprimés à des niveaux élevés. Les niveaux d’expression d’araA, d’araB et d’araD dans BSW3AP étaient respectivement 4,1 fois, 1,6 fois et 2,5 fois plus élevés que ceux de la souche BSW1AT.

Figure 2

L’expression de l’araA (barres noires), de l’araB (barres grises) et de l’araD (barres blanches) des souches BSW2AP et BSW3AP par rapport à la souche BSW1AT. Les changements de plis des niveaux d’ARNm de ces gènes sont normalisés par rapport à l’expression d’ACT1. Les souches testées ont été cultivées sur 20 g L-1 de glucose. Les valeurs indiquées sont obtenues à partir de trois mesures indépendantes.

L’utilisation du L-arabinose par les souches BSW1AT, BSW2AP et BSW3AP a été comparée dans des fioles à agitation dans des conditions de limitation d’oxygène (figure 3) ; la DO600 initiale était de 0,5. Aucune croissance de BSW1AT n’a été observée dans les 120 h. La souche BSW2AP s’est développée sur le L-arabinose avec un taux de croissance spécifique maximal () de 0,011 h-1 ; 4,4 g L-1 de L-arabinose ont été consommés, et 1,2 g L-1 d’éthanol ont été produits en 120 h de fermentation. En revanche, le taux d’évolution de la souche BSW3AP est passé à 0,23 h-1. Après 120 h de fermentation, 18,6 g L-1 de L-arabinose avaient été consommés avec un taux de consommation spécifique maximal de 0,7 g h-1 g-1 DCW ; 6,9 g L-1 d’éthanol avaient été produits, et le rendement en éthanol était de 0,43 g-1 ; seulement 0,13 g L-1 de L-arabitol s’était accumulé.

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Figure 3

La fermentation du L-arabinose fermentation des souches dans des flacons secoueurs. Capacité de croissance (a), consommation de L-arabinose (b), formation d’arabitol (c), et formation d’éthanol (d) par BSW1AT (▲), BSW2AP (■), et BSW3AP (). Les souches ont été cultivées dans 40 mL de milieu SC avec 20 g L-1 L-arabinose à 30°C, 200 r min-1 avec une OD600 initiale de 0,5. Les données sont les moyennes de trois expériences indépendantes.

3.3. La surexpression de GAL2 a amélioré la fermentation anaérobie du L-Arabinose de la souche évoluée

Le gène GAL2 de la perméase du galactose a été surexprimé dans BSW3AP, ce qui a donné la souche BSW3AG. Les propriétés de fermentation anaérobie du L-arabinose des souches BSW3AP et BSW3AG ont été étudiées (figure 4 et tableau 3) dans des bioréacteurs. La souche BSW3AP s’est développée sur le L-arabinose avec un taux de croissance spécifique maximal de 0,067 h-1. Le taux de consommation spécifique maximal de L-arabinose était de 0,49 g h-1 g-1 DCW. L’éthanol a été produit à un taux spécifique maximum de 0,20 g h-1 g-1 DCW avec un rendement de 0,42 g-1. La surexpression de GAL2 a amélioré de manière significative la capacité de fermentation du L-arabinose. Le taux de croissance spécifique maximal de BSW3AG était de 0,075 h-1, soit 12 % plus rapide que celui de BSW3AP. Le taux de consommation spécifique de L-arabinose de BSW3AG était de 0,61 g h-1 g-1 DCW, soit 24 % plus rapide que celui de BSW3AP. Le taux de production d’éthanol était de 0,27 g h-1 g-1 DCW, et le rendement en éthanol était de 0,43 g-1. En outre, BSW3AP et BSW3AG ont produit de petites quantités de glycérol (1,4 g L-1 pour les deux souches) et des quantités presque indétectables d’arabitol et d’acétate.

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Figure 4

La fermentation anaérobie en batch du BSW3AP (a) et du BSW3AG (b) sur 20 g L-1 d’arabinose. Niveaux de (■), arabinose (◆), éthanol (▲), Glycérol (), et acétate (×). La fermentation a été réalisée dans des fermenteurs de 1,4 L avec un volume de travail de 900 mL. Les conditions anaérobies ont été maintenues par barbotage d’azote (0,1 L min-1) ; le taux d’agitation était de 500 r min-1. Le pH a été maintenu à 5,0 par pompage automatique de 1 mol L-1 de NaOH et de 1 mol L-1 de H3PO4. La biomasse initiale était de 0,2 g de DCW L-1. Le 20 g L-1 L-arabinose a été utilisé comme source de carbone dans le milieu SC plus CSM-LEU-URA, et 200 g mL-1 G418 a été fourni dans la fermentation de la souche BSW3AG. Les données sont la moyenne de déterminations en double.

4. Discussion

La conversion complète des sucres est importante pour la production efficace et rentable d’éthanol carburant à partir de matières lignocellulosiques. Même de petites améliorations dans l’utilisation du substrat peuvent réduire considérablement les coûts de l’ensemble du processus . Le L-arabinose est un composant important des matériaux lignocellulosiques. L’expression de la voie du L-arabinose de L. plantarum s’est avérée efficace pour construire des S. cerevisiae utilisant le L-arabinose . Étant donné que les gènes optimisés au niveau des codons pourraient conduire à une expression accrue des protéines, dans le présent travail, les gènes originaux araA, araB et araD de L. plantarum ont été modifiés pour correspondre à l’utilisation des codons de S. cerevisiae, puis intégrés dans le chromosome de la souche CEN.PK102-3A. Cependant, cette souche recombinante ne pouvait pas se développer sur le L-arabinose. D’autres copies du gène araA ont ensuite été introduites dans la souche recombinante sous le contrôle des promoteurs HXT7 et TEF1. Lorsque les deux souches résultantes ont été cultivées sur L-arabinose, la croissance n’a été observée que dans les cultures de la souche exprimant araA sous le contrôle du promoteur TEF1, dans laquelle le niveau de transcription de araA était 1,4 fois plus élevé que dans la souche exprimant araA contrôlée par le promoteur HXT7. Nous suggérons que ce n’est que lorsque le niveau de transcription de araA est supérieur à un certain niveau que la croissance sur L-arabinose peut se produire. En revanche, une seule copie de araB et araD a été introduite dans cette souche recombinante, et les niveaux de transcription de ces gènes étaient plus faibles que dans la souche parentale. Ces phénomènes ont indiqué que araB et araD étaient moins importants pour la croissance sur le L-arabinose car une seule copie de ces gènes permettait à la souche recombinante de croître sur le L-arabinose.

L’évolution adaptative s’est avérée être une méthode puissante pour améliorer l’efficacité métabolique des souches . Dans la présente étude, la souche évoluée BSW3AP montre une capacité de métabolisation du L-arabinose significativement améliorée. L’augmentation des niveaux de transcription des trois gènes (araA, araB et araD) pourrait contribuer à cette amélioration. Comparé à araA et araD, le niveau d’expression de araB était plus faible. Becker et Boles ont signalé qu’un mutant sur L-arabinose diminuait l’activité L-ribulokinase exprimée par araB. L’expression relativement plus faible de l’araB évite la surconsommation d’ATP, ce qui serait bénéfique à la croissance de la souche sur L-arabinose.

Le L-arabinose est une nouvelle source de carbone pour S. cerevisiae. L’absorption du L-arabinose chez S. cerevisiae dépend principalement du transport non spécifique par le transporteur d’hexose Gal2p. Les transporteurs Hxt9p et Hxt10p peuvent également transporter le L-arabinose, mais leur efficacité est très faible. Il a été signalé que la surexpression de GAL2 améliore l’utilisation du L-arabinose. Dans cette étude, la surexpression de GAL2 a considérablement augmenté le taux de croissance et le taux de consommation de L-arabinose de notre souche évoluée BSW3AP. Ce résultat suggère que le flux métabolique théorique du L-arabinose est plus élevé que celui que nous avons détecté chez BSW3AP. L’utilisation du L-arabinose de la BSW3AP était limitée par son taux d’absorption. Lorsque le GAL2 a été surexprimé, une plus grande quantité de Gal2p dans la membrane plasmique a conduit à une augmentation de l’absorption du L-arabinose et a ensuite favorisé l’utilisation du L-arabinose. Nos résultats confirment l’importance des transporteurs pour l’utilisation du L-arabinose ; cependant, l’affinité de Gal2p pour le L-arabinose est faible, et le glucose inhibe de façon compétitive sa liaison au L-arabinose. L’amélioration de l’efficacité du transporteur spécifique du L-arabinose reste à mener.

5. Conclusions

Avec de multiples étapes de génie génétique et d’évolution adaptative, nous avons obtenu la souche BSW3AG, qui croît sur le L-arabinose avec une de 0,075 h-1. Le taux de consommation spécifique maximal de L-arabinose est de 0,27 g h-1 g-1 DCW, et le rendement maximal en éthanol est de 0,43 g g-1 L-arabinose consommé, soit 84,3% de la quantité théorique. Un niveau élevé d’expression de l’araA est notamment important pour établir une voie efficace du L-arabinose dans S. cerevisiae, et des transporteurs plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la capacité d’absorption du L-arabinose des souches évoluées.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme national clé de recherche fondamentale (2011CB707405), le Programme national de recherche et de développement de haute technologie de la Chine sous la subvention (2012AA022106), la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (30970091, 31070096, et 31270151), et le Programme international de coopération S&T de la Chine (2010DFA32560). Les auteurs remercient le Dr. Peter Kötter de l’Université Johann Wolfgang Goethe de Francfort pour la souche CEN.PK102-3A.

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