AmpR augmente la virulence de Klebsiella pneumoniae résistant aux carbapénèmes en régulant l’étape initiale de la synthèse de la capsule

Introduction

Le K. pneumoniae classique (cKp) et le K. pneumoniae hypervirulent (hvKp) sont deux pathotypes mondiaux de K. pneumoniae qui circulent actuellement1,2. pneumoniae (cKp) et K. pneumoniae hypervirulent (hvKp) sont deux pathotypes mondiaux de K. pneumoniae actuellement en circulation1,2. En Amérique du Nord et en Europe, la plupart des infections à K. pneumoniae sont causées par des isolats cKp, qui sont le plus souvent des pathogènes opportunistes causant des infections principalement dans le cadre des soins de santé chez des hôtes immunodéprimés. La caractéristique la plus problématique de ce pathotype est sa capacité à acquérir un nombre croissant d’éléments qui lui confèrent une résistance aux antimicrobiens. Le K. pneumoniae résistant aux carbapénèmes (CRKP) associé à des carbapénémases codées par des plasmides pose des défis cliniques distincts et produit des infections invasives avec un taux de mortalité élevé.3,4

Des rapports de Taïwan ont décrit un syndrome clinique unique d’infection à K. pneumoniae acquise dans la communauté et invasive dans les tissus chez des individus en bonne santé, qui se présentait souvent sur plusieurs sites ou se propageait par la suite, notamment par des abcès hépatiques pyogènes.5,6 La hvKp a été désignée pour distinguer ce pathotype de la cKp, et l’incidence des infections dues à la hvKp n’a cessé d’augmenter au cours des 3 dernières décennies dans les pays d’Asie-Pacifique.7-11 La hvKp est généralement sensible aux antimicrobiens, mais elle s’est avérée résistante, et même un isolat de cKp extrêmement résistant aux médicaments (XDR) qui a acquis une partie d’un plasmide de virulence de la hvKp a provoqué une épidémie nosocomiale mortelle a été rapportée12.-15

Une caractéristique initialement considérée comme sensible et spécifique pour les isolats hvKp était un phénotype hypermucoviscide, défini par un test des cordes positif.16 Cependant, cela a créé une certaine confusion car tous les isolats hvKp n’ont pas été déterminés comme étant hypermucoviscides, et certains isolats cKp possédaient cette caractéristique.17 Récemment, il a été démontré que de multiples biomarqueurs, dont peg-344, iroB, iucA, rmpA et rmpA2 codés par le plasmide et la production quantitative de sidérophore, permettaient de prédire avec précision les isolats hvKp ; ces biomarqueurs pourraient être utilisés pour mettre au point un test de diagnostic à l’usage des laboratoires cliniques afin d’optimiser les soins aux patients, ainsi que pour la surveillance épidémiologique et la recherche.18 Cependant, dans cette étude, nous avons identifié un nouveau groupe d’isolats CRKP non hypermucoviscueux dépourvus de la plupart des gènes spécifiques de hvKp. Une étude d’association pangénomique (Pan-GWAS), une analyse du protéome et un test de virulence dans un modèle animal ont révélé que AmpR augmente la virulence de ces isolats en régulant l’initiation de la synthèse de la capsule. En outre, nous avons également constaté que l’ampR porté par les souches du locus K 47 (KL47) dans cette étude était incapable d’augmenter la virulence du K. pneumoniae hypermucoviscide KL1.

Matériel et méthodes

Isolats cliniques et collecte des données

Les isolats cliniques non répétitifs de K. pneumoniae ont été recueillis à partir d’échantillons détectés et stockés de routine du département de médecine de laboratoire de 5 hôpitaux dans les provinces de Guangdong et d’Anhui entre 2018 et 2019. Tous les isolats ont été conservés à -80°C avant d’être utilisés. Les informations cliniques des patients ont été obtenues. L’identification des espèces et les tests de sensibilité aux antimicrobiens ont été réalisés avec le système compact VITEK-2 (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, France). Les résultats ont été interprétés conformément aux directives publiées par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI ; document M100-S26).19 Les espèces identifiées de tous les isolats ont été confirmées par spectrométrie de masse à désorption/ionisation laser assistée par matrice (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, France). CRKP a été défini comme résistant à l’imipénème ou au méropénème.

Caractérisation phénotypique hypermucoviscale

Pour identifier le phénotype hypermucoviscal avec le string test, les isolats ont été inoculés sur des plaques de gélose contenant 5% de sang de mouton et incubés à 37°C pendant la nuit. Le test de la ficelle a été jugé positif lorsqu’une ficelle visqueuse de plus de 5 mm a pu être générée en touchant une seule colonie avec une boucle d’inoculation standard et en tirant la colonie vers le haut2.

Séquençage du génome entier (WGS)

Un volume de culture de 1 mL (densité optique à 600 nm de 0,6) a été utilisé pour l’extraction de l’ADN génomique (ADNg) (Sangon, Shanghai, Chine). L’ADNg a été séquencé sur un séquenceur Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, États-Unis) en utilisant des lectures de 150 paires de points. L’assemblage du génome a été effectué à l’aide de l’assembleur de génome de novo SPAdes (version 3.12.0).20 Nous avons effectué le typage des capsules sur les séquences assemblées avec Kaptive (version 0.5.1).21 Les gènes de résistance aux antimicrobiens et les facteurs de virulence ont été identifiés dans les isolats en analysant les contigs du génome par rapport aux bases de données ResFinder et VFDB à l’aide d’ABRicate (version 0.8.7). L’analyse du génotypage par typage de séquence multilocus (MLST) et par MLST du génome central (cgMLST) a été réalisée avec Ridom SeqSphere+ (version 5.1.0).22 Le type complexe (CT) a été défini en suivant le schéma cgMLST de K. pneumoniae (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). La construction d’un arbre phylogénétique basé sur les variants nucléotidiques simples (SNV) du génome central a été réalisée à l’aide de la suite Harvest (version 1.2) avec un test de 1000 bootstrap.23 L’outil en ligne iTOL a été utilisé pour afficher, manipuler et annoter l’arbre phylogénétique.24 Nous avons annoté les séquences du génome avec Prokka (version 1.13.3).25

Analyse de l’étude d’association à l’échelle du génome pan (Pan-GWAS)

Nous avons utilisé le pipeline du génome pan Roary (version 3.12.0) pour mettre les assemblages annotés au format GFF3 (produit par Prokka) et calculé le génome pan.26. Nous avons utilisé Scoary (version 1.6.16) pour prendre le fichier de « https://sanger-pathogens.github.io/Roary/ », créé un fichier de traits et calculé les associations entre tous les gènes du génome accessoire et les traits. Nous avons rapporté une liste de gènes triés par force d’association avec une valeur P < 0,01 ajustée avec la méthode de Benjamini-Hochberg pour la correction des comparaisons multiples.27

Analyse du protéome

Un volume de culture de 1 mL (densité optique à 600 nm de 0,6) a été utilisé pour l’extraction des protéines. L’échantillon a été soniqué trois fois sur glace à l’aide d’un processeur ultrasonique à haute intensité (Scientz) dans un tampon de lyse (urée 8 M, cocktail d’inhibiteurs de protéases à 1 %). Les débris restants ont été éliminés par centrifugation à 12 000 g à 4°C pendant 10 minutes. Enfin, le surnageant a été recueilli et la concentration en protéines a été déterminée avec un kit BCA selon les instructions du fabricant. Pour la digestion, la solution protéique a été réduite avec 5 mM de dithiothreitol pendant 30 min à 56°C et alkylée avec 11 mM d’iodoacetamide pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité. L’échantillon de protéines a ensuite été dilué en ajoutant 100 mM TEAB avec de l’urée à une concentration inférieure à 2M. Enfin, de la trypsine a été ajoutée à un ratio de masse trypsine/protéine de 1:50 pour la première digestion pendant la nuit et un ratio de masse trypsine/protéine de 1:100 pour une seconde digestion de 4 heures. Les peptides tryptiques ont été dissous dans de l’acide formique à 0,1 % (solvant A) et directement chargés sur une colonne analytique en phase inverse de fabrication artisanale (15 cm de long, 75 μm de diamètre interne). Le gradient a été réalisé comme suit : une augmentation de 6 % à 23 % de solvant B (0,1 % d’acide formique dans 98 % d’acétonitrile) sur 26 min, une augmentation de 23 % à 35 % de solvant B en 8 min, une augmentation à 80 % de solvant B en 3 min et un maintien à 80 % de solvant B pour les 3 dernières min à un débit constant de 400 nL/min sur un système UPLC EASY-nLC 1000. Les peptides ont été soumis à une source NSI suivie d’une spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) dans un Q ExactiveTM Plus (Thermo) couplé en ligne à l’UPLC. La tension d’électrospray appliquée était de 2,0 kV. La plage de balayage m/z était de 350 à 1800 pour le balayage complet, et les peptides intacts ont été détectés dans l’Orbitrap à une résolution de 70 000. Les peptides ont ensuite été sélectionnés pour la MS/MS en utilisant le réglage NCE de 28, et les fragments ont été détectés dans l’Orbitrap à une résolution de 17 500. La procédure dépendante des données alternait entre un balayage MS suivi de 20 balayages MS/MS avec une exclusion dynamique de 15.0 s. Le contrôle automatique de gain (AGC) a été réglé à 5E4. La première masse fixe a été fixée à 100 m/z. Les données MS/MS résultantes ont été traitées à l’aide du moteur de recherche MaxQuant (v.1.5.2.8). Nous avons utilisé InterProScan (version 5.37-76.0) pour annoter les domaines protéiques. Une valeur p corrigée < 0,05 et un changement de pli > 1,2 ont été considérés comme significatifs.

Construction du mutant complémentaire ampR

K. pneumonia ampR (Supplementary Materials) a été synthétisé et flanqué des sites de restriction 5ʹXbaI et 3ʹHindIII. Ce fragment a été soumis à une digestion de restriction et cloné dans pUC57. L’ADN recombinant a été récupéré dans Escherichia coli DH5α avec sélection par ampicilline. Après digestion par restriction, le fragment ampR a été ligaturé au vecteur d’expression pBAD33 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. pBAD33-ampR a été utilisé pour la transformation en utilisant l’électroporation comme norme pour les E. coli isolés en laboratoire. Les souches complémentaires ampR ont été confirmées par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Tableau S1). L’expression de l’ampR a été induite par l’ajout de 100 μg/mL d’arabinose.

Modèles d’infection pulmonaire chez la souris

Un modèle de pneumonie de K. pneumoniae chez la souris a été utilisé pour tester la virulence des isolats. Des souris femelles BALB/c âgées de six à huit semaines et classées exemptes de pathogènes spécifiques ont été achetées auprès de Hunan SJA Laboratory Animal Co, Ltd. Les souris ont été anesthésiées par voie intrapéritonéale avec du pentobarbital sodique (75 mg/kg) et inoculées avec 1,0 × 107 unités formant des colonies (UFC) de K. pneumoniae par instillation intratrachéale non invasive sous vision directe. La survie des souris a été observée pendant 7 jours après l’infection. Pour évaluer la charge bactérienne dans le poumon, les organes des souris infectées ont été homogénéisés et dissous dans 1 ml de solution tampon phosphate (PBS) ; 50 μL ont été inoculés sur des plaques de gélose de bouillon liquide (LB), et une énumération des UFC a été réalisée. Pour l’analyse histopathologique, des segments de poumons ont été fixés dans du formol neutre à 10 %, inclus dans de la paraffine et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine pour être visualisés au microscope optique. La charge bactérienne et l’analyse histopathologique ont été réalisées après 24 heures d’infection.

Extraction et quantification du polysaccharide capsulaire

Les polysaccharides capsulaires ont été extraits avec le détergent Zwittergent 3-14. La quantité d’acide uronique a ensuite été mesurée selon la méthode décrite précédemment28.En parallèle, des dilutions en série de la culture bactérienne ont été ensemencées pour déterminer le nombre d’UFC, et la concentration de polysaccharide capsulaire a été exprimée en fonction de la quantité d’acide glucuronique (μg) pour 109 UFC/mL d’échantillon. Chaque expérience a été réalisée en triplicata.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism version 8 (La Jolla, Californie).

Résultats

Caractéristiques des isolats

Des isolats CRKP non répétitifs (n = 135) ont été utilisés dans cette étude. Tous les isolats étaient de type de séquence 11 (ST11) et exprimaient la carbapénémase de K. pneumoniae (KPC-2), et un isolat portait à la fois OXA-23 et KPC-2 (figure S1). Les isolats ont été assignés à 16 CTs en utilisant le schéma cgMLST. Les CT les plus courants étaient CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) et CT2410 (n = 11), suivis de 11 autres CT identifiés dans moins de 10 isolats chacun (Figure 1). Tous les isolats ont été assignés à deux types de KL, KL64 (n = 86) et KL47 (n = 49) (Figure S2). Aucun isolat hypermucoviscide n’a été trouvé. L’analyse des gènes de virulence a montré qu’aucun isolat portant tous les biomarqueurs permettant de différencier les isolats hvKp et cKp n’avait été signalé précédemment (figure 1, figure S2).18

Figure 1 Analyse phylogénétique des 135 isolats de cette étude. Les branches des différents isolats de type CT sont indiquées en couleurs. Les isolats correspondants de chaque type CT sont CT1291 (P1291-1 à P1291-20), CT1313 (P1313-1 à P1313-33, AH1313-1 à AH1313-2), CT1689 (AH1689-1 à AH1689-8), CT1772 (AH1772-1 à AH1772-4), CT1814 (AH1814-1 à AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1 à P2405-9), CT2410 (P2410-1 à P2410-11), CT2418 (P2418-1 à P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (P2445-1 à P2445-6), CT3175 (AH3175-1 à AH3175-2), CT3176 (AH3176-1 à AH3176-14), CT3178 (AH3178-1 à AH3178-4), CT3179 (AH3179-1 à AH3179-2), et CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 et iucA ont été identifiés pour la différenciation de K. pneumoniae hypervirulent de K. pneumoniae classique dans une étude précédente18.

Analyse des données cliniques

Il n’y avait pas de différences significatives entre les CT en termes de données démographiques, de types d’infection, de comorbidités principales, d’opérations invasives, d’indice de comorbidité de Charlson et de score de bactériémie de Pitt, sauf pour le cathéter veineux central, et de mortalité hospitalière toutes causes confondues (P = 0,035 et P = 0,001, test exact de Fisher). Les patients infectés par CT3176 présentaient des taux de mortalité significativement plus élevés (78,6 % contre 37,1 %, P = 0,012 ; 78,6 % contre 20,0 %, P = 0,001 ; 78,6 % contre 7,7 %, P = 0,0003 ; 78,6 % contre 31,0 %, P = 0,004 ; test exact de Fisher) par rapport aux groupes CT1313, CT1291, CT1814 et aux autres groupes CT, respectivement. L’utilisation de cathéters veineux centraux dans le groupe CT1814 était significativement plus élevée que dans les groupes CT1313 et CT1291 (84,6 % vs 51,4 %, P = 0,049 ; 84,6 % vs 35,0 %, P = 0,011, test exact de Fisher) (tableau 1).

Tableau 1 Données démographiques, comorbidités, Procédures invasives et mortalité des patients atteints d’infections à Klebsiella pneumoniae résistantes aux carbapénèmes

Analyse Pan-GWAS

Pour identifier la base génétique de CT3176, nous avons effectué une analyse Pan-GWAS entre les groupes CT3176 et non-CT3176. Nous avons identifié 39 gènes dont les fonctions connues sont associées à CT3176 (P < 0,01 ajusté avec la méthode de Benjamini-Hochberg) (Figure 2), y compris des facteurs de virulence, des gènes de synthèse des capsules, des gènes de résistance aux antimicrobiens et des transporteurs d’efflux de médicaments multiples. Parmi eux, ampR présentait la plus grande association avec CT3176. Cependant, nous avons noté que d’autres CT, comme CT3178 et certains isolats de CT1689 (AH1689-2 et AH1689-6), portaient également le gène ampR (Figure 1). Tous les isolats portant le gène ampR appartiennent à KL47.

Figure 2 Analyse Pan-GWAS entre les groupes CT3176 et non-CT3176. Le pangénome et les associations ont été calculés avec Roary et Scoary. Une carte graphique a été générée avec ggplot2.

Analyse du protéome

Trois isolats ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 et AH1689-2) et trois isolats ampR- (AH1689-3, AH1689-4 et AH1689-5) ont été sélectionnés pour l’analyse du protéome. Un total de 3093 protéines a été identifié dans les deux groupes sur la base de 36 727 peptides uniques. Enfin, nous avons identifié 24 protéines exprimées de manière différentielle (DEP). Parmi eux, 15 étaient régulés à la hausse, et 9 étaient régulés à la baisse dans les isolats ampR+ par rapport aux isolats ampR- (Figure 3A-C, Tableau S2). WcaJ avait le changement de pli le plus élevé et a donc été mis en évidence.

Figure 3 Analyse du protéome et coloration de la capsule. (A) Graphique de volcan montrant la comparaison de l’expression quantitative des protéines entre les isolats de Klebsiella pneumoniae ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 et AH3178-1) et ampR- (AH1689-3, AH1689-4 et AH1689-5). (B, C) Les protéines exprimées de manière différentielle avec un changement de pli supérieur à 1,2 sont marquées en couleur.

Virulence dans les modèles animaux et quantification de la capsule

Afin d’identifier le rôle de l’ampR dans la virulence des isolats CRKP non hypermuqueux, nous avons sélectionné trois isolats (AH3176-1, AH1689-2 et AH1689-3), et testé la virulence dans un modèle de souris. AH3176-1 et AH1689-2 étaient deux isolats ampR+, tandis que AH1689-3 était l’isolat ampR- (Figure 1). En outre, nous avons également sélectionné deux souches hypermucoviscentes GM2 et GM6 de notre collection pour tester la virulence. GM2 et GM6 appartiennent toutes deux à KL1, parmi lesquelles GM6 porte le gène ampR alors que GM2 ne le porte pas. Cependant, la séquence ampR de la souche non hypermucoviscale KL47 était différente de celle de la souche hypermucoviscale KL1, elles ont donc été nommées respectivement ampRKL1 et ampRKL47 dans cette étude.

Comme le montre la figure 4A, AH3176-1 et AH1689-3:ampRKL47 plus arabinose avaient un taux de survie de 0% avec un inoculum de 1 × 107 unités formant des colonies (UFC) à 4 d post-infection, tandis que 20% de survie avec AH1689-2, 40% de survie avec AH1689-3:ampRKL47 sans arabinose, 60% de survie avec AH1689-3:pBAD33 et ATCC70721, et 80% de survie avec AH1698-3 ont été observés à 7 d post-infection. Le taux de survie était significativement diminué après complémentation avec le gène ampRKL47 dans AH1689-3 (n = 10 ; P = 0,033, test de Mantel-Cox log-rank), ce qui suggère le rôle important de l’ampR dans la virulence. L’infection des souris par AH3176-1 a entraîné la présence dans les poumons d’UFC environ 10 à 100 fois plus élevées que celles des autres isolats (Figure 4B). La pathologie des poumons a montré des degrés variables d’épaississement de la paroi alvéolaire, d’infiltration lymphocytaire et de saignement intravasculaire dans le groupe d’infection. Parmi eux, les changements pathologiques pulmonaires causés par AH3176-1 étaient les plus graves, se présentant sous la forme d’une consolidation pulmonaire étendue et d’une hémorragie intra-alvéolaire (Figure 4D-F).

Figure 4 Potentiel de virulence des isolats de Klebsiella pneumoniae non hyperviscueux dans un modèle d’infection pulmonaire de souris. (A) L’effet sur la survie de 1 × 107 unités formatrices de colonies (UFC) des mutants complémentaires ampRKL47 AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 et AH1689-3 a été évalué. (B) 24 heures après l’infection (hpi), les poumons des souris infectées ont été récoltés et la charge bactérienne a été déterminée par dénombrement des UFC (n = 10 ; *P < 0,05, **P < 0,01, ANOVA à sens unique). Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. (C) Production d’acide uronique de différentes souches. Un test t non apparié bilatéral de Student a été effectué. Chaque point de données a été répété trois fois (n = 3). Les données sont présentées en tant que moyenne ± s.e.m. *P < 0,05, ns = non significatif. Les poumons des souris sans infection (D) ou infectées par ATCC700721 (E) et AH3176-1 (F) ont été prélevés et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine. Toutes les images sont à un grossissement de ×40. Barres d’échelle : 250 μM.

Comme le montre la figure 5A, le taux de survie des souris infectées par GM6 était significativement inférieur à celui de GM2 et ATCC700721. Une diminution du taux de survie a été observée après la complémentation de ampRKL1 dans GM2. En outre, la charge bactérienne dans les poumons des souris infectées par GM6 était significativement plus élevée que celle de GM2 et ATCC700721 (Figure 5B) ; la coloration HE a montré que l’infection par GM6 provoquait une consolidation étendue des poumons et une hémorragie intra-alvéolaire (Figure 5E-G). Cependant, le taux de survie n’était pas affecté si l’ampRKL47 était introduit dans le GM2 (Figure 5C).

Figure 5 Potentiel de virulence des isolats de Klebsiella pneumoniae hypermucoviscides dans un modèle d’infection pulmonaire de souris. (A) L’effet de 1 × 106 unités formant des colonies (UFC) de GM2, GM6 et GM2 ampRKL1 mutant complémentaire sur la survie a été évalué (n = 10 ; *P < 0,05, **P < 0,01, test de Mantel-Cox log-rank),). (B) 24 heures après l’infection (hpi), les poumons des souris infectées ont été récoltés, et la charge bactérienne a été déterminée par dénombrement des UFC (n = 10 ; **P < 0,01, ANOVA à sens unique). Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes. (C) L’effet de 1 × 106 CFU de GM2 et du mutant complémentaire GM2 ampRKL47 sur la survie a été évalué. (D) Production d’acide uronique de différentes souches. Un test t de Student non apparié et bilatéral a été réalisé. Chaque point de données a été répété trois fois (n = 3). Les données sont présentées en tant que moyenne ± s.e.m. *P < 0,05, ns = non significatif. Les poumons des souris sans infection (E) ou infectées par GM2 (F) et GM6 (G) ont été prélevés et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine. Toutes les images sont à un grossissement de ×40. Barres d’échelle : 250 μM.

Puisque la capsule est le principal facteur de virulence de K. pneumonia et que WcaJ qui a été mis en évidence selon le résultat de l’analyse protéomique régule l’étape initiale de la synthèse de la capsule, nous avons étudié les quantités de production de polysaccharides capsulaires. Le résultat a montré que les souches ampR-complémentaires AH1689-3:ampRKL47 et GM2:ampRKL1 plus arabinose ont produit significativement plus de polysaccharide capsulaire (acide uronique) que AH1689-3 et GM2, respectivement (Figure 4C, Figure 5D).

Discussion

MLST a été la technique la plus couramment utilisée pour définir les populations de K. pneumoniae. Avec le WGS rapide et abordable, il est possible de comparer des génomes entiers pour le typage des isolats plutôt que quelques loci, comme dans la MLST traditionnelle. Le génotypage avec la cgMLST utilise des milliers d’allèles à travers le génome, ce qui permet d’obtenir un niveau plus élevé de discrimination des isolats. Dans cette étude, nous avons utilisé le cgMLST pour classer 135 isolats cliniques de CRKP et avons trouvé des différences entre les types de CT sur la base des informations cliniques. En raison du nombre limité de cas, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir une association entre les types de CT et le résultat clinique. Cependant, les différences dans les taux de mortalité nous ont permis d’approfondir l’étude des isolats appartenant à CT3176. L’analyse GWAS a montré que le gène ampR était significativement associé aux isolats CT3176.

Des études antérieures ont montré que le régulateur de β-lactamase AmpC AmpR, membre de la famille LysR des facteurs de transcription, contrôle également de multiples mécanismes de virulence chez Pseudomonas aeruginosa.29,30 A ce jour, un seul article a rapporté le rôle d’AmpR dans la régulation de la virulence de K. pneumoniae. Un isolat clonal de K. pneumoniae a montré que peu de gènes de virulence connus étaient responsables d’infections sévères. AmpR dans ces isolats a été impliqué dans l’upregulation de la synthèse de la capsule, a modulé la formation du biofilm et l’expression du gène fimbrial de type 3, ainsi que la colonisation du tractus gastro-intestinal murin.31 Cependant, le niveau de virulence de ces isolats reste peu clair en raison du manque de données sur les modèles d’infection létale. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de pneumonie pour confirmer la virulence accrue de ces isolats porteurs d’ampR. Cela expliquerait pourquoi les patients infectés par ces isolats avaient un taux de mortalité élevé.

Auparavant, il était courant que les K. pneumoniae de type ST11 soient résistants aux carbapénèmes mais ne soient pas hypervirulents. Cependant, en 2017, une épidémie d’infections hospitalières causées par des isolats de K. pneumoniae hypervirulents résistants aux carbapénèmes ST11 a été signalée. Le phénotype d’hypervirulence de ces isolats était dû à l’acquisition d’un plasmide de virulence d’environ 170 kbp de type pLVPK par des isolats CRKP classiques appartenant au ST11 et au sérotype K47.15 Contrairement au rapport ci-dessus, aucun plasmide de virulence n’a été trouvé dans les isolats CRKP ST11 à virulence accrue dans cette étude, ce qui suggère que l’augmentation de la virulence n’était pas due au mécanisme classique.32 Contrairement au plasmide de virulence, qui contient plusieurs facteurs de virulence, AmpR peut augmenter la virulence indépendamment. Ceci a été confirmé par des tests de virulence de la souche complémentaire ampR.

WcaJ est l’enzyme qui initie la synthèse de l’acide colanique et charge le premier sucre (glucose-1-P) sur le support lipidique undécaprényl phosphate. Le rôle potentiel de WcaJ dans la virulence de K. pneumoniae a été défini récemment.33 Les résultats de l’analyse du protéome suggèrent que AmpR renforce la virulence de K. pneumoniae en régulant l’étape initiale de la synthèse de la capsule. En tant que régulateur, AmpR doit se lier au promoteur du gène pour exercer son rôle régulateur. A ce jour, de nombreux types de capsules ont été identifiés chez K. pneumoniae,34 et l’absence de sites de liaison à AmpR dans certains types de capsules peut expliquer pourquoi la virulence des isolats KL1 ne peut pas être renforcée par l’AmpR trouvé dans les isolats KL47.

De nouvelles preuves ont suggéré que l’hypermucoviscosité et l’hypervirulence sont des phénotypes différents qui ne devraient pas être utilisés comme synonymes. De plus, il est important d’établir qu’un test des cordes négatif est insuffisant pour déterminer si un isolat est hypervirulent.35 Un résultat clé de notre travail est que nous avons identifié le sous-clone CRKP ST11 non hypermucoviscueux avec une virulence accrue.

La principale limitation de cette étude est qu’il n’y a qu’un petit nombre de cas ; par conséquent, nous ne sommes pas en mesure d’étudier la relation entre les résultats cliniques et l’infection CRKP hypervirulente non hypermucoviscueuse. Nous n’avons pas non plus été en mesure de construire une souche knockout ampR, ce qui peut s’expliquer par le fait que l’analyse génomique a montré que ampR était putativement localisé sur le plasmide (Figure S3). Étant donné que les souches présentant le phénotype non hypervirulent ne se distinguent guère en clinique, il est urgent de poursuivre la surveillance et l’étude de ces nouvelles souches.