[Antigen retrieval : its significance and drawbacks in immunohistochemistry]

L’un des plus grands problèmes de l’immunohistochimie a été de savoir comment maintenir à la fois une bonne morphologie et l’immunoréactivité des antigènes dans les coupes de tissus. Diverses techniques permettant de récupérer l’immunoréactivité des antigènes (démasquage) après les préparations tissulaires de routine, telles que la fixation, la déshydratation et l’encastrement, ont été conçues et sont maintenant utilisées pour les immunomarquages, non seulement dans les enquêtes cytohistologiques, mais aussi dans les diagnostics pathocliniques. Dans ce rapport, les mécanismes et la signification de la fixation et de la récupération de l’antigène ont été examinés du point de vue de l’inactivation des protéines. Ensuite, certains problèmes et remarques pratiques concernant deux des techniques de démasquage les plus populaires, la digestion enzymatique et la récupération des épitopes induite par la chaleur (HIER), ont été passés en revue afin d’adapter précisément ces techniques en immunohistochimie. Le principal artefact induit par la fixation est le masquage des antigènes tissulaires dû à la réticulation entre les résidus d’acides aminés des protéines. Il est important de choisir une condition de fixation appropriée pour chaque antigène en tenant compte de sa nature biochimique et de sa résistance à la fixation. Il est important de choisir une condition de fixation appropriée pour chaque antigène en tenant compte de sa nature biochimique et de sa résistance à la fixation (tableau 2), et de maintenir les conditions de fixation à un minimum afin que l’immunoréactivité de l’antigène puisse être facilement récupérée par diverses techniques de démasquage (tableau 3, figure 1). La récupération de l’antigène en soi est le processus qui provoque la dénaturation des protéines dans les tissus, tout comme de nombreux autres processus d’inactivation des protéines (tableau 1). La digestion enzymatique peut attaquer les parties masquantes des protéines autour d’un antigène pour exposer son épitope. Bien que la digestion enzymatique soit relativement simple et que ses conditions de traitement soient faciles à contrôler, les résultats ne sont pas nécessairement spectaculaires et cohérents selon les types ou les lots d’enzymes. Il faut donc trouver son propre manuel de digestion pour obtenir le meilleur résultat de coloration pour chaque antigène (par exemple, tableau 4). Par exemple, la digestion à la pepsine a donné les meilleurs résultats pour l’immunomarquage de la bromodésoxyuridine (BrdU) et de l’antigène nucléaire des cellules proliférantes (PCNA), alors que les autres enzymes ont eu peu d’effet (tableau 5). Le chauffage peut également cliver le squelette polypeptidique et rompre les liaisons transversales produites par la fixation. L’effet du chauffage sur la récupération de l’antigène dépend de la température et semble être proportionnel au produit de la température et du temps. Dans le cas de l’immunomarquage du PCNA sur des coupes incorporées en paraffine et fixées au paraformaldéhyde, un chauffage à 90 degrés C pendant au moins 3 minutes était nécessaire. Cependant, plus les conditions de chauffage étaient sévères, plus les taches de fond non spécifiques augmentaient (tableau 6), ce qui est l’un des problèmes les plus graves de la récupération de l’antigène (figure 2a, c). Un choix possible pour éviter ces résultats indésirables est la combinaison d’un chauffage sous-optimal (à 80 degrés C pendant 10-15 min) et d’une digestion à la pepsine (Fig. 2b, d). Une considération théorique importante pour l’emploi d’une méthode de dénaturation aussi spectaculaire est de savoir si les épitopes antigéniques masqués peuvent être exposés de manière adéquate sans donner lieu à des résultats faussement positifs (ou faussement négatifs) avec des anticorps précédemment fiables. Il semble que chaque antigène nécessite une préparation tissulaire « sur mesure » pour une préservation optimale de son antigénicité et une localisation précise. En fonction du développement de l’immunologie, de la biologie moléculaire, de la génétique ou de l’embryologie, le besoin d’immunomarquage multiple en combinaison avec d’autres technologies comme l’hybridation in situ devrait augmenter afin d’analyser les relations spatiales et fonctionnelles entre diverses molécules in situ. La récupération des antigènes deviendrait alors une stratégie puissante.