Applications actuelles des microréseaux d’anticorps

En raison des capacités uniques du microréseau d’anticorps et de son applicabilité dans une gamme de projets biomédicaux, une série de différents microréseaux d’anticorps ont été développés, dont certains sont devenus disponibles dans le commerce. Dans le présent document, nous avons rassemblé certaines des études représentatives des sept dernières années (tableau 1) et organisé notre aperçu en deux parties, en fonction de l’objectif des projets : études de biologie fondamentale et recherche clinique. Comme il reste pratiquement impossible de couvrir toutes les applications récentes des puces à anticorps, nous nous concentrons sur les applications que nous avons jugées d’un grand intérêt et sur les résultats ayant une signification clinique importante.

Recherche fondamentale

Les changements dans les voies de signalisation sont une caractéristique de nombreux états pathologiques, y compris le cancer , le diabète et les troubles neurodégénératifs . La construction de réseaux d’anticorps utilisant des réactifs de capture ciblant les protéines dans la cascade de signalisation d’intérêt a permis aux chercheurs d’étudier les changements dans les profils de protéines et les modifications des voies de signalisation dans les processus biologiques normaux et les états pathologiques. Les chercheurs ont appliqué ce concept à une gamme de matériaux et de préparations d’échantillons biologiques, y compris les lysats cellulaires , les extraits de tissus et le plasma .

La calbindine-D28 k (CB), une importante protéine de liaison au calcium qui agit comme un tampon de calcium, s’avère être exprimée à des niveaux plus faibles dans le cerveau des souris et des humains atteints de la maladie d’Alzheimer, mais on ne sait pas si ces changements contribuent au dysfonctionnement lié à la MA (AD). Kook et al. ont créé une souris transgénique CB déficiente pour la maladie d’Alzheimer (CBKOTg) afin d’étudier la contribution de CB aux voies de signalisation dans la MA. En utilisant des microréseaux d’anticorps pour examiner le tissu cérébral de la souris, ils ont identifié des altérations significatives des voies de mort cellulaire, de la transmission synaptique et des voies de signalisation MAPK lors de la délétion de CB. Ces résultats ont été vérifiés par immunohistochimie qui a montré une augmentation des marqueurs apoptotiques et une augmentation de la mort neuronale, démontrant que les microréseaux d’anticorps peuvent fournir de nouvelles informations, améliorant notre compréhension du rôle de CB et de son implication dans la physiopathologie de la MA.

Les microréseaux d’anticorps ont été utilisés pour découvrir le rôle physiologique dans des protéines hautement conservées, y compris le facteur d’élongation 4. Gao et al. ont disséqué le mécanisme du facteur de contrôle de la qualité du facteur d’élongation mitochondrial 4 (mtEF4) dans la traduction en utilisant un microréseau d’anticorps phospho-explorateur . En comparant les lysats cellulaires entre les tissus testiculaires de souris knock-out mtEF4 et WT, ils ont constaté que l’enrichissement en plis de mTOR était le plus élevé parmi les différentes voies de signalisation. Les auteurs ont montré qu’avec la délétion de mtEF4, le principal signal de rétroaction provenant du cytoplasme somatique est la régulation à la hausse de mTOR. Celle-ci s’accompagne d’une augmentation de la traduction cytoplasmique, ce qui indique que mTOR joue un rôle crucial en tant qu’effecteur en aval compensant le déficit de traduction mitochondrial. En outre, l’étude a lié une diaphonie précédemment non décrite entre le contrôle de qualité dépendant de mtEF4 dans la mitochondrie et la voie mTOR dans le cytoplasme.

Mécanisme médicamenteux

A l’aide des essais de microréseaux d’anticorps, les chercheurs peuvent étudier les mécanismes médicamenteux de manière systématique et efficace. Parmi les nombreuses applications possibles, l’angiogenèse induite par les tumeurs a été étudiée car elle joue un rôle central dans la progression du cancer . P11, un nouveau ligand peptidique contenant un motif de liaison PDZ (Ser-Asp-Val) et présentant une forte affinité pour l’intégrine αvβ3, a été identifié à partir d’une bibliothèque d’hexapeptides (PS-SPCL) en utilisant un microréseau d’anticorps. Le mécanisme pharmacologique de P11 a été élucidé à l’aide d’une approche pharmacoprotéomique par microréseau spécialement conçue, contenant 48 anticorps liés au cancer. L’étude a révélé que le P11 inhibe la prolifération des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine induite par le bFGF via l’inhibition de la protéine kinase activée par des agents mitogènes et de la kinase régulée par des signaux extracellulaires. En outre, le microréseau a révélé que le P11 provoquait la régulation à la hausse du marqueur apoptotique p53, entraînant l’induction de l’apoptose via l’activation du système des caspases, ce qui indique que le P11 peut jouer un rôle clé dans la prévention de la progression tumorale. Le lien entre P11 et p53 présente les chercheurs cliniques et fondamentaux sur le cancer aidera à élucider d’autres indices sur le rôle de P11 et sa cible inhibitrice.

La lovastatine, un produit naturel dérivé d’Aspergillus terreus ou de Monascus ruber, a été largement utilisée comme médicament hypocholestérolémiant en clinique. Yang et al. ont utilisé un microréseau d’anticorps contenant 656 anticorps axés sur différentes voies cellulaires fonctionnelles, ce qui suggère que la lovastatine possède également des propriétés anticancéreuses, par le biais de mécanismes mal définis. Il est impératif de trouver des traitements efficaces contre le cancer et de comprendre leurs mécanismes d’action. À l’aide d’une biopuce, des cellules cancéreuses du sein ont été étudiées dans des conditions hypoxiques afin d’examiner les mécanismes moléculaires par lesquels la lovastine exerce son effet. Ils ont montré 17 protéines régulées à la hausse et 20 protéines régulées à la baisse pour les cellules cancéreuses du sein traitées par la lovastatine, par rapport au contrôle, et les résultats ont ensuite été validés par PCR en temps réel . La signature protéique comprenait des protéines impliquées dans l’apoptose, la prolifération cellulaire et les métastases tumorales, reliant la modulation de ces voies à l’action pharmacologique de la lovastine.

La metformine, médicament contre le diabète de type 2, a également été proposée pour avoir des propriétés anticancéreuses. Lee et al. ont étudié la puissance de nouveaux dérivés de la metformine en utilisant un microréseau d’anticorps construit pour étudier les molécules liées au cycle cellulaire. Les auteurs ont montré que le butyrate de metformine (MFB) avait une meilleure efficacité antitumorale que le chlorhydrate de metformine, grâce à une plus grande activité néoplasique et à une meilleure efficacité dans l’altération de la progression du cycle cellulaire pendant les phases S et G2/M, en plus de sembler avoir des effets cytotoxiques préférentiels sur les populations de cellules souches du cancer du sein. Ces résultats soulignent la façon dont les réseaux d’anticorps peuvent fournir des preuves protéomiques soutenant le développement de médicaments plus efficaces.

Pour la recherche fondamentale en biologie, les microréseaux d’anticorps peuvent servir à détecter les protéines de signalisation et les protéines associées à un phénotype particulier. Les puces à détection parallèle de protéines créent une opportunité d’étudier de multiples voies de signalisation dans une seule expérience, fournissant un aperçu de nouveaux mécanismes, tels que l’étude de la progression des maladies, l’interaction des médicaments et la réponse aux infections.

Recherche clinique

L’analyse des échantillons cliniques au niveau des protéines permettra d’améliorer les marqueurs de diagnostic, et d’orienter les options de traitement. Les protéines étant impliquées dans la majorité des processus cellulaires, l’analyse des protéines peut fournir une signature biologique de la maladie, générant des informations détaillées sur l’état actuel d’une cellule, d’un organe ou d’un système. Les microréseaux d’anticorps peuvent fournir un guide en temps réel des changements actuels dans les processus biologiques au cours de la santé et de la maladie. Dans cette section, nous allons illustrer comment les puces à anticorps ont été utilisées pour étudier des cohortes cliniques, en analysant principalement des échantillons de sérum et de plasma. Il n’est pas possible de couvrir tous les aspects des puces à anticorps pour la recherche clinique, ici, nous nous concentrons seulement sur plusieurs des maladies les plus importantes, à savoir les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, le cancer et les maladies neurodégénératives.

Maladies auto-immunes

Le diagnostic du lupus érythémateux systémique (LES) est un défi en raison de sa présentation clinique hétérogène et du manque de biomarqueurs robustes pour le distinguer de la maladie active et inactive ainsi que d’autres maladies auto-immunes. Lin et al. ont réalisé un dépistage par microréseau d’anticorps DotScan™ sur des cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de 60 patients atteints de LED dont l’activité de la maladie varie, de 25 patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, de 28 échantillons d’autres maladies auto-immunes et de 24 témoins sains. Les profils des microréseaux d’anticorps ont permis de distinguer les patients atteints de LED actifs des témoins sains. L’utilisation d’un réseau de capture de leucocytes a amélioré la capacité de discrimination des diagnostics conventionnels du LED, en vérifiant les anti-dsDNA sériques, les compléments C3 et C4, les microréseaux ont augmenté la capacité de discrimination du LED semi-actif et actif, une information qui aidera à une meilleure gestion de la maladie.

Dans une autre étude, Carlsson et al. ont construit 135 variables de fragments à chaîne unique (scFv) recombinants humains ciblant des protéines immunitaires pour construire un microréseau d’anticorps interne. Dans cette étude, ils ont examiné des patients atteints de sclérose systémique (SSc), de LED et 15 volontaires sains. La SSc est une maladie auto-immune qui affecte les tissus de connexion, ce qui peut être difficile à différencier du LED. La matrice a identifié 40 protéines exprimées de manière différentielle, créant ainsi une signature protéomique candidate pour délimiter le LED et sa gravité de la ScS. Cette signature protéique était une meilleure classification de la maladie qu’une seule ou même des combinaisons de paramètres cliniques conventionnels, y compris, ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 et CRP, illustrant l’utilisation potentielle des microréseaux d’anticorps pour créer de nouvelles signatures de maladie qui ajouteront une valeur clinique à la gestion de la maladie.

Maladies infectieuses

Les infections activent le système immunitaire différemment, et ces mécanismes peuvent être étudiés en utilisant des réseaux d’anticorps à l’échelle du protéome. Helicobacter pylori est un agent pathogène qui colonise environ la moitié de la population mondiale et qui provoque des gastrites chroniques. Sukri et al. ont utilisé la biopuce d’anticorps DotScan™ pour déterminer la tolérance du système immunitaire envers les cellules tumorales dans le cancer gastrique en utilisant 144 anticorps CD pour profiler la distribution des marqueurs CD entre les cellules d’adénocarcinome gastrique infectées et non infectées par Helicobacter pylori. Il est intéressant de noter que la lignée cellulaire AGS d’adénocarcinome gastrique infectée par cagA + H. pylori a montré une augmentation de l’expression de CD27, qui est essentielle pour le maintien de la population de cellules T, et une augmentation des marqueurs CD a également été détectée chez les patients atteints de cancer gastrique infectés par H. pylori. Cette étude suggère non seulement la tolérance du système immunitaire envers le cancer gastrique, mais aussi les variations de la réponse immunitaire exploitées par différentes souches de H. pylori.

En outre, les réseaux d’anticorps peuvent être utiles pour suivre un changement continu dans l’environnement physiologique, y compris le statut de la maladie et la réponse aux thérapies et aux interventions. Après une transplantation du foie, 94% des patients ont été trouvés avec des dommages histologiques induits par le virus de l’hépatite C (VHC), avec certains patients souffrant de récidive grave de la maladie . Il existe un besoin urgent de biomarqueurs prédictifs pour identifier la gravité de la maladie récurrente. À l’aide d’un microréseau d’anticorps CD, le sang périphérique de patients définis comme des groupes avant la transplantation, au début, au milieu et à la fin de la transplantation a été étudié pour prédire la gravité de la récurrence du VHC après la transplantation. Des échantillons de sang prélevés en série sur des patients avant et après une transplantation hépatique ont permis de suivre le milieu de la maladie, avec ses propres contrôles internes. Cinq marqueurs CD (CD27, CD182, CD260, CD41 et CD34) étaient significativement augmentés dans les cas de récidive sévère par rapport aux cas de récidive légère. Ce résultat montre que les matrices d’anticorps peuvent aider à évaluer la gravité de la maladie VHC récurrente après une transplantation hépatique.

Ellmark et al. ont conçu une microréseau d’anticorps recombinants à cadre unique (SinFabs) contenant 127 anticorps différents contre des antigènes immunorégulateurs sélectionnés dans la bibliothèque n-CoDeR sur l’adénocarcinome gastrique. Les chercheurs ont découvert que des signatures d’expression protéique distinctes associées aux tumeurs et aux infections, telles que IL-9, IL-11 et MCP-4, pouvaient être identifiées à partir des protéomes plasmatiques et servir de biomarqueurs potentiels. Ces résultats peuvent aider à améliorer la compréhension du cancer induit par H-pylori et ouvrir la voie à des diagnostics affinés à l’avenir.

Des tableaux d’anticorps à base de billes ont été réalisés pour étudier les profils protéiques différentiels dans le plasma des enfants souffrant de paludisme et de complications liées au paludisme . Sur 1000 protéines criblées, 41 protéines présentaient une expression différentielle entre les enfants infectés par le paludisme et les contrôles communautaires. Treize autres protéines étaient liées à la gravité du paludisme et de la maladie. Ces résultats indiquent l’implication de l’inflammation ainsi qu’un métabolisme déséquilibré du glucose dans les formes graves de la maladie et les changements les plus importants ont été observés dans deux des protéines musculaires (anhydrase carbonique 3 et créatine kinase), ce qui indique des dommages et des lésions musculaires chez les enfants atteints de paludisme cérébral. Ces résultats peuvent aider au développement de tests simples pour classer les enfants infectés par le paludisme dans le groupe montrant un risque plus élevé pour la forme grave de la maladie.

Cancer

Les puces à anticorps ont été appliquées pour la recherche sur le cancer principalement pour étudier la progression du cancer et les protéines candidates qui peuvent servir de biomarqueurs de diagnostic . Le cancer du pancréas est une maladie agressive avec un mauvais pronostic, et les biomarqueurs spécifiques à la maladie qui offrent un diagnostic précoce et précis sont en besoin urgent. En utilisant une plateforme de microréseau d’anticorps recombinants développée en interne, Wingren et al. ont analysé les sérums de 148 patients atteints de cancer du pancréas, de pancréatite chronique, de pancréatite auto-immune (PIA) et de témoins sains. Ils ont identifié un panel de 25 protéines cibles, dont l’IL-2, l’IL-11, l’IL-12, le TNF-, qui ont contribué à distinguer le cancer du pancréas des témoins sains. Cette signature de 25 protéines présente un potentiel diagnostique élevé (AUC de 0,88). En outre, le groupe a récemment étendu l’analyse de son panel à d’autres ensembles d’échantillons, y compris le lymphome, le cancer de la prostate et le cancer du sein dans les lysats cellulaires et le plasma. Ces résultats sont utiles pour aider au développement de méthodes de diagnostic nouvelles et multivariées.

L’une des questions les plus importantes en biologie du cancer, est de déterminer le caractère invasif d’une tumeur. Une étude a développé une plateforme personnalisée de microréseau d’anticorps contenant 4096 caractéristiques pour interroger des échantillons de plasma couvrant les maladies pré-invasives et invasives d’un modèle murin d’adénocarcinome du canal pancréatique (PDA) . Ils ont trouvé une signature protéique, comprenant l’expression différentielle de trois protéines, ERBB2, TNC et ESR1, qui pourrait être utilisée pour améliorer l’AUC de 0,86 (intervalle de confiance à 95 % 0,76-0,96) à 0,97 (IC à 95 % 0,92-1,0) lorsque le marqueur PDA CA19-9 est inclus.

La majorité des cas de cancer de la vessie nouvellement diagnostiqués sont de bas stade, de bas grade et non invasifs sur le plan musculaire . Après une résection transurétrale standard, 50 à 70 % des tumeurs récidivent, cependant 10 à 30 % des tumeurs évolueront vers une maladie invasive sur le plan musculaire . Comprendre le mécanisme de la progression tumorale pourrait fournir des informations plus utiles pour la clinique. Srinivasan et al. ont étudié des lysats cellulaires avec un microréseau d’anticorps contenant 810 anticorps liés au cancer, construit par le laboratoire Hoheisel. Les auteurs ont construit un classificateur multivarié contenant 20 protéines, qui a facilité la prédiction de la récurrence avec une sensibilité de 80% et une spécificité de 100%. De manière intéressante, ils ont trouvé une répression de la voie de signalisation TGF-β dans les cancers récurrents. Les facteurs de signalisation IFNG, TNF-α et THBS1 étaient moins exprimés et l’abondance de l’inhibiteur MAPK3 (également connu sous le nom de ERK1) était plus élevée, tandis que SMAD2, SMAD3 et SMAD4 étaient à nouveau significativement sous-représentés . Les données indiquent que les inhibiteurs de la voie de signalisation TGF-β peuvent réduire la récurrence du cancer de la vessie .

Puig-Costa et al. ont employé des microréseaux d’anticorps pour découvrir des biomarqueurs pour le cancer gastrique (GC). La biopuce contenait notamment des anticorps ciblant différentes protéines fonctionnelles bien connues qui jouent un rôle crucial dans la progression du cancer, dont 120 cytokines, 43 facteurs angiogéniques, 41 facteurs de croissance, 40 facteurs inflammatoires et 10 métalloprotéinases. L’analyse des voies d’ingéniosité a confirmé que certains biomarqueurs, tels que l’ICAM-1 et l’angiogénine, indiquaient une réponse inflammatoire élevée chez les patients atteints de cancer du sein. Les mouvements cellulaires et les cibles du trafic des cellules immunitaires, comme la protéine chimioattractante des monocytes (MCP)-1, étaient surreprésentés chez les patients atteints de cancer du sein. Les valeurs prédictives positives et négatives dans cette cohorte de validation étaient respectivement de 75 % (IC 95 % 53-90) et 80 % (IC 95 % 56-94). Enfin, les analyses de microréseaux d’anticorps du protéome inflammatoire associé au cancer du côlon ont permis d’identifier une signature du cancer gastrique basée sur 21 protéines inflammatoires (INPROGAS) qui a permis de distinguer avec précision le cancer du côlon de la muqueuse gastrique non cancéreuse et qui pourrait fournir de nouvelles pistes pour l’analyse de la progression du cancer.

Dans le cas du cancer de la prostate, Schwenk et al. ont utilisé des réseaux d’anticorps sur des réseaux de billes en suspension pour comparer les niveaux plasmatiques de protéines entre différents groupes afin de trouver des biomarqueurs supplémentaires à côté de l’antigène spécifique de la prostate (PSA). En plus de classer les patients sur la base du PSA, ils ont identifié des niveaux plasmatiques réduits de CNDP1 et, dans une étude ultérieure de plus grande envergure, il a été démontré que cette association était associée à des formes plus agressives de la maladie. Un test immunologique en sandwich a été mis au point pour valider ces résultats chez plus de 1 200 patients, et l’association de la diminution du CNDP1 aux métastases des ganglions lymphatiques a été élucidée. Il s’agit de l’une des rares études qui ont réussi à valider une indication initiale par le biais d’un pipeline de microréseaux d’anticorps et le développement d’un test ciblé. Dans une étude ultérieure sur la cachexie cancéreuse, on a constaté que les niveaux plasmatiques de CNDP1 étaient réduits chez les patients cachexiques, ce qui indique un rôle métabolique des changements dans les niveaux de CNDP1.

Darmanis et al. ont étudié les niveaux plasmatiques de deux ensembles d’études indépendants (77 et 132 échantillons) et un réseau de billes ciblées pour 124 protéines uniques dans une étude sur les tumeurs neuroendocrines de l’intestin grêle. Ils ont pu obtenir une précision de classification allant jusqu’à 85 % en utilisant un panel de protéines et ont conclu en proposant de nouveaux candidats pour la classification des tumeurs. Parmi les candidats présélectionnés, comme pour IGFBP2 et IGF1, le groupe a effectué des tests ELISA pour confirmer les indications. Ces résultats indiquent une association métabolique des protéines plasmatiques avec le cancer et soutiennent la prise en compte de ces cibles dans les futures études sur le cancer.

Maladies neurodégénératives

L’analyse de l’expression des protéines offre une possibilité d’étendre les connaissances actuelles sur la physiopathologie neurodégénérative . Les progrès récents dans le domaine de la protéomique ont offert la possibilité de rechercher de nouveaux biomarqueurs en utilisant des microréseaux d’anticorps. Les progrès dans le développement des protocoles ont permis aux chercheurs d’étudier non seulement le sang, mais aussi le liquide céphalo-rachidien (LCR).

Dans le domaine de la neuroprotéomique, le laboratoire de Nilsson a mené plusieurs études en utilisant les anticorps de l’Atlas des protéines humaines ainsi que les essais de suspension de billes. En établissant le profil du LCR de patients atteints de sclérose en plaques (SEP), ils ont trouvé GAP43, une protéine cytoplasmique impliquée dans la formation et la régénération des neurones, ce qui en fait un biomarqueur prometteur des maladies du cerveau. Plus récemment, Remnestål et al. ont comparé les niveaux de protéines dans 441 échantillons de LCR prélevés dans différents ensembles d’échantillons de maladies neurodégénératives ainsi que dans des LCR prélevés post-mortem. Parmi 376 anticorps, les protéines synaptiques GAP43 et NRGN se sont avérées associées aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer par rapport aux témoins.

Utilisant des échantillons de plasma, de LCR et de tissu cérébral de patients souffrant de la SEP, un dépistage à grande échelle a été effectué qui a commencé par l’utilisation de 4500 anticorps sur des réseaux de billes . Un ensemble de protéines s’est avéré être associé aux sous-types de SEP dans le LCR et le plasma. L’utilisation de certains des anticorps candidats dirigés contre IRF8, IL7 et METTL14 pour l’analyse par immuno-fluorescence des tissus cérébraux a montré une coloration des neurones à proximité des lésions de la SEP. Cela indique que les anticorps sélectionnés à partir d’essais basés sur des réseaux pour l’analyse des fluides corporels peuvent également fournir des preuves supplémentaires au niveau du tissu affecté.

Enfin, les réseaux de billes ont été utilisés pour profiler le plasma de patients souffrant de sclérose latérale amyotrophique (SLA) , où 367 patients SLA et 101 contrôles ont été analysés pour 278 protéines. L’étude conclut en proposant le polypeptide moyen des neurofilaments (NEFM), la famille des transporteurs de solutés 25 (SLC25A20) et le régulateur de la signalisation des protéines G 18 (RGS18) comme des protéines précieuses car elles sont impliquées dans des processus liés à la physiopathologie de la maladie, ce qui justifie une validation supplémentaire dans des ensembles d’échantillons indépendants.